Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/65848
Automatic Translation
*1, *2, 2,3, 1,3,4
1Singapore National Eye Centre, Singapore Eye Research Institute, 2Centre for Vision Research, Duke-NUS Medical School, 3Ophthalmology and Visual Sciences Academic Clinical Program, DUKE-NUS Medical School, 4Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
* These authors contributed equally

Summary

אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת תאי אב קולטי אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (photoreceptor) שמקורם בהקפאה, ואת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי RD10 .

Abstract

רגנרציה של תאים קולטי אור באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים היא טיפול מבטיח לטיפול במחלות רשתית תורשתיות והזדקנות בשלבים מתקדמים. הראינו שמטריצת איזופורם למינין ספציפית לרשתית רקומביננטית אנושית מסוגלת לתמוך בהתמיינות של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לאבות קולטי אור. בנוסף, הזרקה תת-רשתית של תאים אלה הראתה גם שיקום חלקי במודלים של מכרסמים וארנבים rd10 . הזרקה תת-רשתית ידועה כשיטה מבוססת המשמשת להעברת תרכובות פרמצבטיות לתאי קולטני האור ולשכבת אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) של העין בשל קרבתה לחלל המטרה. הוא שימש גם להעברת וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו לחלל התת-רשתית לטיפול במחלות רשתית. ההעברה התת-רשתית של תרכובות ותאים פרמצבטיים במודל מורין מאתגרת בשל האילוץ בגודל גלגל העין של מורין. פרוטוקול זה מתאר את ההליך המפורט להכנת תאי אב קולטני אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (hESC) להזרקה ואת טכניקת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי רטיניטיס פיגמנטוזה גנטיים, עכברי RD10 . גישה זו מאפשרת טיפול תאי לאזור הממוקד, במיוחד לשכבה הגרעינית החיצונית של הרשתית, שם מתרחשות מחלות המובילות לניוון קולטני אור.

Introduction

מחלות רשתית תורשתיות וניוון מקולרי הקשור לגיל מובילות לאובדן תאים קולטי אור ובסופו של דבר לעיוורון. הפוטורצפטור ברשתית הוא שכבת המקטע החיצוני של הרשתית המורכבת מתאים מיוחדים האחראים על פוטוטרנסדוקציה (כלומר, המרת אור לאותות עצביים). תאי הפוטורצפטור של המוט והחרוט סמוכים לשכבת הפיגמנטציה ברשתית (RPE)1. טיפול בתחליפי תאים קולטי אור כדי לפצות על אובדן התא היה גישה טיפולית מתפתחת ומתפתחת. תאי גזע עובריים (ESCs)2,3,4, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם בתאי RPE, ותאי אב ברשתית (RPCs)4,5,6,7,8 שימשו לשחזור תאי קולטני האור הפגועים. החלל התת-רשתית, חלל מוגבל בין הרשתית ל-RPE, הוא מיקום אטרקטיבי להפקדת תאים אלה כדי להחליף תאים קולטי אור פגומים, RPE ותאי מולר בשל קרבתו 9,10,11.

טיפולים גנטיים ותאיים מנצלים את החלל התת-רשתית לרפואה רגנרטיבית למחלות רשתית שונות במחקרים פרה-קליניים. זה כולל משלוח עותקים פונקציונליים של הגן או כלי עריכת הגנים בצורה של טיפול אוליגונוקלאוטיד אנטי-סנס 12,13 או CRISPR/Cas9 או עריכה בסיסית באמצעות אסטרטגיה מבוססת וירוס הקשור לאדנו (AAV) 14,15,16, השתלת חומרים (למשל, גיליון RPE, תותבות רשתית 17,18,19) ואורגנואידים רשתית ממוינים שמקורם בתאי גזע 20,21,22 לטיפול במחלות רשתית ו- RPE. ניסויים קליניים באמצעות hESC-RPE31 בחלל התת-רשתית לטיפול באמאורוזיס מולד Leber הקשור ל-RPE65 (LCA)23,24, אכרומטופסיה25-מקושרת CNGA3, רטיניטיס פיגמנטוזה26 הקשורה ל-MERTK, כורואידרמיה 27,28,29,30 הוכחו כגישה יעילה. הזרקה ישירה של תאים לקרבת האזור הפגוע משפרת מאוד את הסיכוי להתיישבות תאים באזור המתאים, אינטגרציה סינפטית, ובסופו של דבר שיפור חזותי.

למרות שהזרקה תת-רשתית במודלים אנושיים ובעלי עיניים גדולות (כלומר, חזיר 32,33,34,35, ארנב 36,37,38,39,40 ופרימט לא אנושי 41,42,43) הוקמה, הזרקה כזו במודל מורין עדיין מאתגרת בשל האילוץ של גודל גלגל העין ועצום עדשה הכובשת את עין העכבר 44,45,46. עם זאת, מודלים מהונדסים גנטית זמינים רק בבעלי חיים קטנים ולא בבעלי חיים גדולים (כלומר, ארנבים ופרימטים לא אנושיים), ולכן הזרקה תת-רשתית בעכברים מפנה את תשומת הלב לחקר גישות טיפוליות חדשניות בהפרעות גנטיות ברשתית. שלוש גישות עיקריות משמשות להעברת תאים או AAV לחלל התת-רשתית, כלומר המסלול הטרנס-קרני, המסלול הטרנס-סקלרלי ומסלול הפארס פלנה (ראו איור 2). מסלולים טרנס-קרניים וטרנס-סקלרליים קשורים להיווצרות קטרקט, סינכיה, דימום כורואידי וריפלוקס מאתר ההזרקה 11,44,45,47,48,49. אימצנו את גישת pars plana כהדמיה ישירה של תהליך ההזרקה, וניתן להשיג את אתר ההזרקה בזמן אמת תחת המיקרוסקופ.

לאחרונה תיארנו שיטה שיכולה להתמיין תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) לאבות קולטי אור בתנאים נטולי קסנו, המוגדרים כימית באמצעות איזופורם למינין LN523 ספציפי לרשתית אנושית רקומביננטית. מאחר שנמצא כי LN523 נמצא ברשתית, שיערנו כי ניתן לשחזר את נישת המטריקס החוץ-תאי של הרשתית האנושית במבחנה ובכך לתמוך בהתמיינות קולטני האור מתאי גזע עובריים עובריים36. ניתוח תעתיק חד-תאי הראה כי אבות קולטי אור המבטאים במשותף הומיאובוקס מוט חרוט ומחלימים נוצרו לאחר 32 יום. מודל עכבר מוטנטי של ניוון רשתית 10 (rd10) המחקה רטיניטיס פיגמנטוזה אנושית אוטוזומלית שימש להערכת היעילות של 32 hESC שמקורם באבות פוטורצפטור in-vivo. תאי האב של קולטני האור שמקורם ב-hESC הוזרקו לחלל התת-רשתית של עכברי RD10 ב-P20, שם תפקוד לקוי של קולטני האור והתנוונותו נמשכים36. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת אבות קולטי אור שמקורם ב- hESC לאחר הקפאה והעברה לחלל התת-רשתית של עכברי rd10 . שיטה זו יכולה לשמש גם למתן AAVs, תרחיפים תאים, פפטידים או כימיקלים לתוך החלל התת-רשתית בעכברים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים in vivo נעשו בהתאם להנחיות ולפרוטוקול שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של SingHealth (IACUC) והצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. הגורים עברו דיכוי חיסוני מ-P17 (לפני ההשתלה) ל-P30 (לאחר ההשתלה) על ידי האכלתם במי שתייה המכילים ציקלוספורין (260 גרם לליטר).

1. הכנת יום 32 hESC אב photoreceptor נגזר לאחר cryopreservation

  1. מדיום התמיינות פוטורצפטור טרום חם (PRDM) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
  2. אחזור קריוביאל המכיל תאי אב פוטורצפטור שמקורם ביום 32 hESC מחנקן נוזלי. יש לשמור על קרח יבש.
  3. הפשיר את cryovial ב 37 ° C באמבט מים במשך 3-5 דקות. השהה מחדש את היום 32 תאים ב 1 מ"ל של PRDM וצנטריפוגה ב 130 x גרם במשך 4 דקות.
  4. הסר את supernatant ו resuspend תאים ב 1 מ"ל של PRDM.
  5. מוציאים 10 μL מהתערובת לספירת תאים. יש לערבב תאים באמצעות 0.2% טריפאן כחול בהתאם להוראות היצרן. תערובת תאי פיפטה לתוך תא ספירת התאים מחליק. קבע את מספר התא ואת הכדאיות על-ידי מונה תאים אוטומטי.
  6. המשך לשלב הבא כאשר כדאיות התא היא מעל 70%. צנטריפוגה את מתלה התא הנותר ב 130 x גרם במשך 4 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב PRDM בריכוז של 3 x 105 תאים / μL להשתלה.
  7. שימו לב לגושי תאים גלויים. יש להשהות מחדש גושי תאים שוב ושוב באמצעות קצה פיפטה של 10 μL בצינור המיקרופוגה עד שלא נצפה גוש תאים נראה לעין. טען לתוך מזרק הזרקת 33G כדי לצפות עבור אקסטרוזיה של תמיסת התא דרך המחט.

2. העברה תת-רשתית של תאי גזע עובריים עובריים בעכברי RD10

  1. הכנת בעלי החיים
    1. מרדימים את העכבר (P20, זכר/נקבה, 3-6 גרם) באמצעות שילוב של קטמין (20 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקסילזין (2 מ"ג/ק"ג משקל גוף) במזרק שחפת 1 מ"ל המחובר למחט 27G בגישה תוך צפקית. מתן זריקה תת עורית של buprenorphine (0.05 מ"ג / ק"ג) לעכבר כמו משכך כאבים מונע.
    2. לאחר מתן ההרדמה, להחדיר טיפה כל אחד של 1% tropicamide ו 2.5% phenylephrine להרחבת האישון. החל ג'ל עיניים על הקרנית כדי למנוע מהעין יובש וקטרקט הקשור להרדמה.
    3. הניחו את העכבר בכלוב ריק עד להרדמה מלאה. להעריך את רמת ההרדמה הנכונה על ידי צביטת כרית הכף ולאשר אם החיה אינה מגיבה לצביטה הקשה.
    4. כאשר העכבר מורדם לחלוטין, הניחו את בעל החיים על כרית חמה שנקבעה ב 38 מעלות צלזיוס.
  2. העברה תת-רשתית של התאים
    1. כדי להשתמש בגישה trans-vitreal pars plana עם יציאה אחת, כפי שנעשה כאן, בצע הזרקה תת-רשתית בסביבה סטרילית. השתמש במיקרוסקופ הפעלה זקוף עם נתיב אור ישיר כדי לבצע את ההזרקה.
    2. הכינו את מזרק הזכוכית 10 μL על ידי הסרת רכזת המחט. הרכיבו את המחט הקהה 33G על מזרק הזכוכית. קח את מכסה רכזת המתכת וחבר בזהירות את המחט על המזרק.
    3. יש לשטוף במים מזוקקים כדי לבדוק אם יש סימני דליפה ופטנט של המחט. רוקנו את המזרק והניחו אותו בצד בזהירות.
    4. הניחו את העכבר המרדים על כרית, כאשר העין המטפלת מביטה היישר אל מטרת המיקרוסקופ. החל את 0.5% proparacaine hydrochloride ולחכות 30 שניות. החל 150 μL של ג'ל עיניים על העין ומניחים כיסוי עגול להחליק על זה.
    5. בצע בדיקה גסה של העין על ידי התבוננות בקרנית, הקשתית, האישון, העדשה והלחמית. דרך האישון, דמיינו את הפונדוס של עין העכבר על ידי התאמת מישור המוקד. כוונן את הראש עד שראש הראייה ממוקם במרכז האישון וצמצם את תנועת הראש על ידי מיקום נכון על הכרית.
    6. הקש בעדינות על בסיס הצינור עם תאי גזע עובריים מספר פעמים כדי לקבל מתלה תאים אחיד. על ידי שימוש מזרק מיקרוליטר זכוכית 10 μL עם מחט קהה 33G, למשוך 2 μL של תאים/מדיה. משכו את התאים ממש לפני ההזרקה כדי למנוע התיישבות תאים/גושים במזרק.
    7. באמצעות מחט חד פעמית 30G, לעשות פצע סקלרקטומיה 2 מ"מ מאחורי הלימבוס. שמור על זווית המחט על ~ 45° כדי למנוע נגיעה בעדשה. לאחר קצה המחט הוא דמיינו בעין, בעדינות למשוך את המחט. יש להשליך את המחט לפח החד לאחר השימוש כדי למנוע פגיעה בדקירת המחט.
    8. קח את מזרק הזכוכית והכנס את המחט הקהה לתוך פצע סקלרקטומיה. מבלי לגעת בעדשה, מקדמים את המחט הקהה עד שהיא מגיעה לרשתית הנגדית של פצע הכניסה. ודא שאזור ההזרקה נקי מכלי דם מרכזיים ברשתית כדי למנוע דימום.
    9. חודרים בעדינות לרשתית עד שנראה ענף לחץ על לובן העין. שמור את הקצה הקהה של המחט במקביל לובן העין כדי למנוע דליפה של התאים לתוך חלל הזגוגית.
    10. הזריקו באיטיות 2 מיקרוליטר של תרחיף תאים או מדיה PRDM (בקרה) לחלל התת-רשתית תוך שמירה על לחץ עדין על המזרק. עם זריקה מוצלחת, bleb גלוי (כלומר, רשתית מוגבהת עם מתלה התא / מדיה בתוכה) צריך להיווצר במקום ההזרקה.
      הערה: יש להשתמש רק בלחץ עדין במהלך ההזרקה כדי למנוע קריעה ברשתית וחסימה של התאים בקצה המחט.
    11. לאחר אישור bleb, לחכות 10 שניות כדי לתת לתאים להתיישב. משכו בעדינות את המחט מהעין.
  3. טומוגרפיה קוהרנטית אופטית תוך ניתוחית (OCT) סריקה של bleb (אופציונלי)
    1. מקם את עין העכבר כדי לדמיין את הפצע מתחת למיקרוסקופ על ידי הזזת הראש באיטיות. אבטח את התנוחה על ידי החזקת הראש בעדינות. אין צורך בהרחבת אישונים נוספת. אין להסיר את החלקת הכיסוי ואת הג'ל על העין. זה נותן מדיה אופטית ברורה כדי לדמיין את bleb.
    2. בצע OCT תוך ניתוחי באמצעות פונקציית iOCT המובנית של מיקרוסקופ ההפעלה.
    3. לחץ על האפשרות קוביה במסך OCT ומקם את אזור הסריקה על ה- bleb על ידי לחיצה על לחצני החץ . התאם את ה-OCT על-ידי הזזה מרכוז ומיקוד לקבלת איכות OCT מיטבית. לחץ על לכידה/סריקה כדי לקבל את סריקת OCT של אזור ה-bleb. סקור את התמונות כדי לבדוק את איכות הסריקות.
  4. שחזור
    1. הסר את הכיסוי להחליק ולנקות את הג'ל מן העין עם גזה. יש למרוח משחה אנטיביוטית פעם אחת לאחר ההזרקה כדי למנוע זיהום.
    2. לאפשר לבעל החיים להתאושש מהרדמה תחת אור חם עד שהוא חוזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה ולחזור לכלוב הביתי. יש לעקוב אחר בעל החיים במשך 3 ימים לפחות לאחר ההזרקה לאיתור סימני דלקת, זיהום ומצוקה.
      הערה: האור החם של 150 ואט צריך להיות במרחק של לפחות 30 ס"מ מכלוב בעלי החיים, ויש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע פגיעה בכוויה.
    3. יש לבצע זריקה תת עורית של בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) 8 שעות למשך יום אחד או לפי המלצת הווטרינר. אם נצפתה דלקת או זיהום בעין, יש להתייעץ עם וטרינרי מקצועי לקבלת טיפול מתאים.
  5. ניקוי ועיקור המכשירים
    1. שטפו את מזרק המיקרוליטר מזכוכית 10 μL ואת המחט הקהה 33G באתנול 100% 10x. שטפו את האתנול על ידי הבהוב המזרק במים מזוקקים.
    2. מפרקים את מזרק הזכוכית ואת המחט. יבש את המזרק לאחסון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מזרק הזכוכית בגודל 10 μL הורכב בהתאם להוראות היצרן (איור 1), והמחט הקהה ששימשה להעברת התרחיף/מדיה של התא מוצגת באיור 1B. גישות שונות להזרקה תת-רשתית מודגמות באיור 2. אנו מתארים את גישת pars plana בפרוטוקול הזה (איור 2C). המחט הקהה שהורכבה על מזרק זכוכית הוחדרה דרך פצע סקלרוטומי וניגשה לחלל התת-רשתית ברחבי העולם. כפי שניתן לראות באיור 3A, מסלול המחט, החדירה דרך הרשתית והעברת התאים נוטרו ישירות מתחת למיקרוסקופ בעת ביצוע ההזרקה. העברה מוצלחת של תאים/מדיה אושרה על-ידי התבוננות בבלב באתר ההזרקה (איור 3B). ניתן לזהות כלב מוצלח כצבע לבנבן בהיר הדומה לבלון מים. לידה כושלת נצפית על ידי דליפה של התאים / מדיה לתוך חלל הזגוגית באתר ההזרקה ואי יצירת bleb. סריקת OCT בוצעה באזור המוזרק, והסריקה הראתה תאי גזע עובריים עובריים בודדים צפים בעין שטופלה בתאים (איור 4A), בעוד שהעין שטופלה במדיה הראתה נוזל צלול ללא תאים בחלל התת-רשתית (איור 4B). תאי גזע עובריים (hESC) אינדיבידואליים מזוהים כחומרים היפררפלקטיביים המפוזרים בחלל התת-רשתית (איור 4A). שיעור ההצלחה של הזריקה חושב על ידי ציון מספר העיניים עם היווצרות מוצלחת של bleb. כללנו במעבדה שלנו את היישומים שאימצו גישה זו ואת אחוזי ההצלחה של הזריקות (טבלה 1).

Figure 1
איור 1: מכשירים שבהם נעשה שימוש במהלך ההזרקה. (A) מזרק זכוכית 10 μL מורכב עם מחט קהה 33G. (B) תמונת זום אין של המחט הקהה 33G. (ג) כרית שעליה יוכל להניח את ראשו של בעל החיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מסלולים שונים של הזרקה תת-רשתית. (A) מסלול טרנס-קרני: מחט ההזרקה עוברת דרך הקרנית והאישון כדי להיכנס לחלל התת-רשתית. (B) מסלול טרנס-סקלרלי: המרחב התת-רשתית נגיש ישירות דרך הסקלרה. (C) מסלול Pars plana: מחט ההזרקה מוחדרת לחלל הזגוגית דרך חתך בלימבוס. המחט מגיעה לחלל התת רשתית על ידי חדירה לרשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תמונות פונדוס של העין במהלך ההזרקה התת-רשתית. (A) לפני ביצוע ההזרקה התת-רשתית, ניתן היה לראות את קצה המחט בחלל הזגוגית נוגע ברשתית, תוך הימנעות מכלי הדם העיקריים ברשתית. (B) לאחר ההזרקה התת-רשתית, נוצר כתם גלוי במקום ההזרקה (קו צהוב מקווקו). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: סריקות OCT תוך ניתוחיות של העיניים המוזרקות. הסריקות נעשו מיד לאחר ההזרקה. (A) תאי גזע עובריים שטופלו בעין: הפאנל העליון הראה את מיקום סריקת OCT (קווי חתך ציאן וורודים) על העין; תאי גזע עובריים נצפו בעין המטופלת בחלל התת-רשתית (קו מקווקו צהוב, פאנל אמצעי ותחתון). (B) עין שטופלה במדיה: הפאנל העליון הראה את מיקום סריקת OCT (קווי חתך ציאן וורודים) על העין; נוזל צלול ללא תאים נצפה בחלל התת-רשתית בעין המוזרק במדיה (קו מקווקו צהוב, פאנל אמצעי ותחתון). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

יישומים זן הנמען שיעור הצלחה
AAV Rpe65rd12/J 80%
AAV C57BL/6 95%
תאי אב הנגזרים מתאי גזע עובריים (hESC) רואד10-/- 95%

טבלה 1: שיעור ההצלחה של הזרקה תת-רשתית ביישומים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההזרקה התת-רשתית שימשה להשתלת תרחיף תאים לטיפול ב-RPE ובמחלות רשתית 23,25,26,27,28,31,40. גישה זו חיונית ביותר במחקרי מכרסמים לא רק עבור השתלות תאים וגישות ריפוי גנטי, אלא גם כדי להעריך תרכובות טיפוליות חדשניות למחלות רשתית. כיום, שלושה מסלולים עיקריים משמשים להעברת תאים או AAVs לחלל התת-רשתית, כלומר, מסלול טרנס-קרנית, טרנס-סקלרל ונתיבי פארס פלאנה.

בגישה הטרנס-קרנית, מחט ההזרקה עוברת דרך הקרנית, האישון, ולבסוף הרשתית כדי להעביר את התאים לתוך החלל התת רשתית וליצור bleb מוצלח. יתרונה של הגישה הטרנס-קרנית הוא היכולת ליצור היפרדות רשתית מלאה אצל מושתל47. הוא יכול לספק מספר גדול יותר של תאים; עם זאת, תצפית אורכית לחקר קונפורמציה מבנית ואינטגרציה של תאים מאתגרת בגישה זו. בנוסף, הסיבוכים כוללים היווצרות קטרקט, סינכיה ואטימות הקרנית, מה שהופך את התצפיות האורכיות למאתגרות 11,45,47,48. לחלופין, הגישה הטרנס-סקלרלית משמשת גם להעברת AAV לחלל התת-רשתית44,49. גישה זו שימושית עבור עכברים יילודים ונחשבת בטוחה יותר מכיוון שאין צורך שהמחט תעבור דרך המדיה העינית. עם זאת, אין להתעלם מדימום כורואידי, ריפלוקס של התמיסה מאתר ההזרקה, ניקוב הרשתית ודליפה לחלל הזגוגית.

אימצנו את גישת pars plana כדי להחדיר את אבות קולטני האור שמקורם ב-hESC לחלל התת-רשתית באמצעות מחט קהה 33G. בגישה זו הוחדרה מחט ההזרקה דרך החתך באזור הלימבוס. המחט הועברה דרך חלל הזגוגית ולבסוף ניגשה לחלל התת-רשתית דרך הרשתית. גושי תאים נצפו לעתים קרובות ועלולים לחסום את העברת התאים בעת שימוש בגדלי מחטים לא מתאימים. השעיית תאים בצינור המיקרופוגה צריכה להתבצע בחריצות באמצעות קצה פיפטה של 10 μL לפני הטעינה למזרק ההזרקה. בתחילה ניסינו להשתמש במחט 34G, שם נצפתה לעתים קרובות חסימה של המחט על ידי התאים. גודל מתאים של המחט צריך להיבדק עבור סוגי תאים ספציפיים, במיוחד מחטים צרות משעמם נוטים לתת תאים קיימא פחות כאשר מוזרק50. אחד היתרונות של גישה זו הוא הדמיה ישירה במהלך ההזרקה, המאפשרת למנתח לפקח ולבחור בקפידה את המיקום הספציפי למסירת התא. אזור ההזרקה והמחט צריך להיות גלוי בבירור במהלך ההליך. קטרקט ואטימות הקרנית הנגרמים על ידי הרדמה יכולים להשפיע מאוד על אספקה נכונה של תאים למיקום מסוים.

בזמן ביצוע ההזרקה, המחט צריכה לחדור את הרשתית בניצב, והקצה הקהה של המחט צריך להיות מקביל ללובן העין כדי למזער את דליפת התאים המוזרקים לחלל הזגוגית (איור 3). רק לחץ עדין צריך להיות מופעל על המזרק בעת ביצוע ההזרקה. לחץ חזק יכול להוביל לקרעים ברשתית, דימום, דליפה של התאים לתוך החלל choroidal, כישלון של התאים לעבור דרך המחט, ניקוב של גלגל העין. ניתן להבטיח את הלחץ האופטימלי כאשר קצה המחט פשוט עבר דרך הרשתית, ונקודת לחץ לבנה קטנה נראית בקצה המחט. לאחר ההזרקה, יש לסגת את המחט לאט ובעדינות ממקום ההזרקה כדי למנוע דליפה של תאים מוזרקים לחלל הזגוגית.

המגבלה של גישה זו היא עקומת הלמידה המאתגרת. מחקר הראה כי רופא עיניים מיומן היה צריך לבצע 364 זריקות בעכברים כדי להשיג שיעור הצלחה של 95%, בעוד שמתאמנים פחות מנוסים עם ניסיון כירורגי היו צפויים לדרוש מספר גבוה יותר של אימונים46. סיבוכים של גישה זו כוללים מסלול מחט ברשתית, ריפלוקס של תאים לתוך חלל הזגוגית, דימום מן choroid/רשתית, קטרקט iatrogenic. עם זאת, עם כמות מספקת של אימון, סיבוכים אלה הם פחות באופן משמעותי נצפו46.

לסיכום, השיטה שלנו יכולה להעביר את אבות קולטני האור שמקורם ב-hESC לחלל התת-רשתית של עכברי RD10 , כפי שניתן לראות בבירור בסריקות OCT. ניתן לאמץ גישה זו כדי לחקור תרכובות טיפוליות חדשניות, השתלות מסוג תאים שונים וריפוי גנטי לטיפול ברשתית החיצונית ובמחלות הקשורות ל- RPE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hwee Goon Tay הוא מייסד שותף של Alder Therapeutics AB. מחברים אחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים ל-Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee ו-Yingying Chung על מתן סיוע טכני להכנת 32 אבות קולטני אור שמקורם ב-HESC לאחר שימור בהקפאה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהמועצה הלאומית למחקר רפואי לחוקר צעיר (NMRC/OFYIRG/0042/2017) ומענק תוכנית המחקר התחרותיתה-24 של הקרן הלאומית למחקר (CRP24-2020-0083) ל-H.G.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.3% Tobramycin Novartis NDC  0078-0813-01 Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone Novartis NDC 0078-0876-01 Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride Alcon NDC 0998-0016-15 0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe Turemo SS01T2713
1% Tropicamide Alcon NDC 0998-0355-15 1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride Alcon NDC 0998-0342-05 2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate Costar 3526
30 G Disposable needle Becton Dickinson (BD) 305128
33 G, 20 mm length blunt needles Hamilton 7803-05
Automated Cell Counter NanoEnTek Model: Eve
B27 without Vitamin A Life Technologies 12587001 2%36
Buprenorphine Ceva Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7 Sigma C0742 5 µM36
Cyclosporine Novartis 260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells DUKE-NUS Medical School Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze Winner Industries Co. Ltd. 1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium Gibco 11710–035
hESC cell line H1 WiCell Research Institute WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02-50 10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Prospec-Tany Technogene CYT-272 10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) Ceva Santé Animale KETALAB03
LN-521 Biolamina LN521-02 1 µg36
mFreSR STEMCELL Technologies 5854
Microlitre glass syringe (10 mL) Hamilton 7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) Selleckchem S2215 10 µM36
N-2 supplement Life Technologies A13707-01 1%36
Non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140–050 1x36
NutriStem XF Media Satorius 05-100-1A
Operating microscope Zeiss OPMI LUMERA 700 With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) DUKE-NUS Medical School See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate Gibco 11360–070 1 mM36
Rd10 mice Jackson Laboratory B6.CXB1-Pde6brd10/J mice Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g 
Retinoic acid Tocris Bioscience 0695/50 0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
SB431542 Sigma S4317 0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g) Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) Troy Laboratories LI0605
β-mercaptoethanol Life Technologies 21985–023 0.1 mM36

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  2. Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
  3. Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
  4. Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
  5. Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
  6. Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
  7. Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
  8. Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
  9. Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
  10. Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
  11. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
  12. Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
  13. Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
  14. Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
  15. Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
  16. Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
  17. Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
  18. Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
  19. Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
  20. Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
  21. McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
  22. Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
  23. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
  24. Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
  25. Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
  26. Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
  27. MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
  28. Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
  29. Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
  30. Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
  31. Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
  32. Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
  33. Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
  34. Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
  35. Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
  36. Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
  37. Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
  38. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
  39. Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
  40. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
  41. Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
  42. Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
  43. Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
  44. Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
  45. Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
  46. Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
  47. Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
  48. Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
  49. Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
  50. Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).

Tags

לידה תת-רשתית תאי גזע עובריים אנושיים קולטני אור מחלות רשתית מטריצת איזופורם למינין התמיינות עכברי Rd10 הזרקה תת-רשתית שיקום מודלים של מכרסמים וארנבות תרכובות פרמצבטיות שכבת אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE) וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו מודל מורין אילוץ גודל גלגל העין תרפיה תאית השכבה הגרעינית החיצונית של הרשתית ניוון קולטני אור
העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי <em>RD10</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tun, S. B. B., Shepherdson, E., Tay, … More

Tun, S. B. B., Shepherdson, E., Tay, H. G., Barathi, V. A. Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice. J. Vis. Exp. (200), e65848, doi:10.3791/65848 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter