Summary
Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Präparation von post-kryokonservierten hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen und die subretinale Verabreichung dieser Zellen in rd10-Mäusen .
Abstract
Die Regeneration von Photorezeptorzellen mit humanen pluripotenten Stammzellen ist eine vielversprechende Therapie für die Behandlung von erblichen und alternden Netzhauterkrankungen in fortgeschrittenen Stadien. Wir haben gezeigt, dass die humane rekombinante retina-spezifische Laminin-Isoform-Matrix in der Lage ist, die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) zu Photorezeptor-Vorläuferzellen zu unterstützen. Darüber hinaus hat die subretinale Injektion dieser Zellen auch eine teilweise Wiederherstellung in den rd10-Nagetier - und Kaninchenmodellen gezeigt. Es ist bekannt, dass die subretinale Injektion eine etablierte Methode ist, die verwendet wurde, um pharmazeutische Verbindungen zu den Photorezeptorzellen und der retinalen pigmentierten Epithelschicht (RPE) des Auges zu bringen, da sie sich in der Nähe des Zielraums befindet. Es wurde auch verwendet, um Adeno-assoziierte virale Vektoren in den subretinalen Raum zu bringen, um Netzhauterkrankungen zu behandeln. Die subretinale Verabreichung von pharmazeutischen Verbindungen und Zellen im Mausmodell ist aufgrund der begrenzten Größe des murinen Augapfels eine Herausforderung. Dieses Protokoll beschreibt das detaillierte Verfahren zur Vorbereitung von hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen für die Injektion und die subretinale Verabreichungstechnik dieser Zellen in genetischen Retinitis pigmentosa-Mutanten, rd10-Mäusen . Dieser Ansatz ermöglicht die Zelltherapie in den Zielbereich, insbesondere in die äußere Kernschicht der Netzhaut, wo Krankheiten auftreten, die zu einer Degeneration der Photorezeptoren führen.
Introduction
Erbliche Netzhauterkrankungen und altersbedingte Makuladegeneration führen zum Verlust von Photorezeptorzellen und schließlich zur Erblindung. Der retinale Photorezeptor ist die äußere Segmentschicht der Netzhaut, die aus spezialisierten Zellen besteht, die für die Phototransduktion (d. h. die Umwandlung von Licht in neuronale Signale) verantwortlich sind. Die Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptorzellen grenzen an die retinale pigmentierte Schicht (RPE)1. Die Photorezeptor-Zellersatztherapie zur Kompensation des Zellverlustes ist ein aufkommender und sich entwickelnder therapeutischer Ansatz. Embryonale Stammzellen (ESCs)2,3,4, induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) und retinale Vorläuferzellen (RPCs)4,5,6,7,8 wurden verwendet, um die geschädigten Photorezeptorzellen wiederherzustellen. Der subretinale Raum, ein begrenzter Raum zwischen der Netzhaut und dem RPE, ist aufgrund seiner Nähe ein attraktiver Ort, um diese Zellen abzulagern, um beschädigte Photorezeptorzellen, RPE und Mueller-Zellen zu ersetzen 9,10,11.
Gen- und Zelltherapien haben in präklinischen Studien den subretinalen Raum für die regenerative Medizin bei verschiedenen Netzhauterkrankungen genutzt. Dies umfasst die Verabreichung von funktionellen Kopien des Gens oder von Gen-Editierungswerkzeugen in Form von entweder Anti-Sense-Oligonukleotid-Therapie12,13 oder CRISPR/Cas9 oder Base-Editierung über eine auf Adeno-assoziierten Viren (AAV) basierende Strategie 14,15,16, Implantation von Materialien (z. B. RPE-Folie, Netzhautprothetik 17,18,19) und differenzierten aus Stammzellen gewonnenen Netzhaut-Organoiden 20,21,22 zur Behandlung von Netzhaut- und RPE-bedingten Erkrankungen. Klinische Studien mit hESC-RPE31 im subretinalen Raum zur Behandlung der RPE65-assoziierten Leber-kongenitalen Amaurose (LCA)23,24, der CNGA3-verknüpften Achromatopsie25, der MERTK-assoziierten Retinitis pigmentosa26 und der Choroiderämie 27,28,29,30 haben sich als wirksamer Ansatz erwiesen. Die direkte Injektion von Zellen in die Nähe des geschädigten Bereichs verbessert die Wahrscheinlichkeit einer Zellansiedlung in der entsprechenden Region, der synaptischen Integration und schließlich einer visuellen Verbesserung erheblich.
Obwohl die subretinale Injektion in menschlichen und großäugigen Modellen (d. h. Schwein 32,33,34,35, Kaninchen 36,37,38,39,40 und nicht-menschliche Primaten 41,42,43) etabliert wurde, ist eine solche Injektion im Mausmodell aufgrund der eingeschränkten Größe des Augapfels und enormer Linse, die das Mausauge einnimmt 44,45,46. Genetisch veränderte Modelle sind jedoch nur bei Kleintieren und nicht bei Großtieren (d.h. Kaninchen und nicht-menschlichen Primaten) verfügbar, daher lenkt die subretinale Injektion in Mäuse die Aufmerksamkeit auf die Erforschung neuer therapeutischer Ansätze bei retinalen genetischen Erkrankungen. Drei Hauptansätze werden verwendet, um Zellen oder AAVs in den subretinalen Raum zu bringen, nämlich die transkorneale Route, die transsklerale Route und die Pars-plana-Route (siehe Abbildung 2). Transkorneale und transsklerale Wege sind mit Kataraktbildung, Synechien, Aderhautblutungen und Reflux von der Injektionsstelle assoziiert 11,44,45,47,48,49. Wir haben den Pars-Plana-Ansatz als direkte Visualisierung des Injektionsprozesses gewählt, und die Injektionsstelle kann in Echtzeit unter dem Mikroskop erreicht werden.
Wir haben kürzlich eine Methode beschrieben, mit der humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen) unter xenofreien, chemisch definierten Bedingungen unter Verwendung der rekombinanten humanen Retina-spezifischen Laminin-Isoform LN523 in Photorezeptor-Vorläuferzellen differenziert werden können. Da LN523 in der Netzhaut gefunden wurde, stellten wir die Hypothese auf, dass die extrazelluläre Matrixnische der menschlichen Netzhaut in vitro rekapituliert werden könnte und dadurch die Photorezeptordifferenzierung von den hES-Zellen unterstütztwerden könnte 36. Die einzellige Transkriptomanalyse zeigte, dass nach 32 Tagen Photorezeptor-Vorläuferzellen erzeugt wurden, die Zapfenstäbchen-Homöobox und Recoverin coexprimieren. Ein retinal degeneration 10 (rd10) mutiertes Mausmodell, das die autosomale humane Retinitis pigmentosa nachahmt, wurde verwendet, um die Wirksamkeit der day 32 hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen in-vivo zu untersuchen. Die hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen wurden in den subretinalen Raum von rd10-Mäusen bei P20 injiziert, wo Photozeptor-Dysfunktion und -Degeneration andauern36. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Herstellung der postkryokonservierten hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen und die Abgabe in den subretinalen Raum von rd10-Mäusen . Diese Methode kann auch verwendet werden, um AAVs, Zellsuspensionen, Peptide oder Chemikalien in den subretinalen Raum von Mäusen zu verabreichen.
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Protocol
Die In-vivo-Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) und der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung genehmigt wurden. Die Welpen wurden von P17 (vor der Transplantation) auf P30 (nach der Transplantation) immunsupprimiert, indem sie mit Ciclosporin (260 g/L) gefüttert wurden.
1. Präparation von Tag 32 hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen nach Kryokonservierung
- Photorezeptor-Differenzierungsmedium (PRDM) in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.
- Entnahme eines Kryo-Fröhrchens mit Tag-32-hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen aus flüssigem Stickstoff. Auf Trockeneis aufbewahren.
- Das Kryoröhrchen bei 37 °C im Wasserbad 3-5 min auftauen. 32 Zellen in 1 ml PRDM resuspendieren und 4 Minuten lang bei 130 x g zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml PRDM.
- Entnehmen Sie 10 μl der Mischung für die Zellzählung. Mischen Sie die Zellen mit 0,2 % Trypanblau gemäß den Anweisungen des Herstellers. Pipettieren Sie die Zellmischung in den Objektträger der Zellzählkammer. Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit durch einen automatisierten Zellzähler.
- Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, wenn die Zelllebensfähigkeit über 70 % liegt. Die verbleibende Zellsuspension wird bei 130 x g für 4 min zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in PRDM in einer Konzentration von 3 x 105 Zellen/μl für die Transplantation.
- Achten Sie auf sichtbare Zellklumpen. Resuspendieren Sie Zellklumpen wiederholt mit einer 10-μl-Pipettenspitze im Mikrofugenröhrchen, bis kein sichtbarer Zellklumpen mehr zu sehen ist. In die 33G-Injektionsspritze geben, um die Extrusion der Zelllösung durch die Nadel zu beobachten.
2. Subretinale Verabreichung der hES-Zellen in rd10-Mäusen
- Vorbereitung der Tiere
- Die Betäubung der Maus (P20, männlich/weiblich, 3-6 g) mit einer Kombination aus Ketamin (20 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (2 mg/kg Körpergewicht) in einer 1-ml-Tuberkulinspritze, die an einer 27G-Nadel befestigt ist, mittels intraperitonealem Zugang. Verabreichen Sie der Maus eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,05 mg/kg) als vorbeugendes Analgetikum.
- Nach der Verabreichung der Anästhesie träufeln Sie je einen Tropfen 1 % Tropicamid und 2,5 % Phenylephrin zur Pupillenerweiterung. Tragen Sie ein ophthalmisches Gel auf die Hornhaut auf, um das Auge vor Trockenheit und anästhesiebedingtem Katarakt zu schützen.
- Legen Sie die Maus in einen leeren Käfig, bis sie vollständig betäubt ist. Beurteilen Sie die richtige Betäubungsstufe, indem Sie den Pfotenballen zusammenkneifen, und vergewissern Sie sich, dass das Tier nicht auf das harte Kneifen reagiert.
- Wenn die Maus vollständig betäubt ist, legen Sie das Tier auf eine warme Unterlage bei 38 °C.
- Subretinale Verabreichung der Zellen
- Um einen 1-Port-transvitrealen Pars-plana-Ansatz zu verwenden, wie hier durchgeführt, führen Sie eine subretinale Injektion in einer sterilen Umgebung durch. Verwenden Sie für die Injektion ein aufrecht stehendes Operationsmikroskop mit direktem Strahlengang.
- Bereiten Sie die 10-μl-Glasspritze vor, indem Sie den Nadelansatz entfernen. Montieren Sie die stumpfe 33G-Nadel auf die Glasspritze. Nehmen Sie die Metallnabenabdeckung und befestigen Sie die Nadel vorsichtig auf der Spritze.
- Spülen Sie mit destilliertem Wasser, um zu prüfen, ob die Nadel undicht ist und durchgängig ist. Entleeren Sie die Spritze und legen Sie sie vorsichtig an die Seite.
- Legen Sie die betäubte Maus auf ein Kissen, wobei das Behandlungsauge direkt auf das Mikroskop blickt. Tragen Sie das 0,5%ige Proparacainhydrochlorid auf und warten Sie 30 Sekunden. Tragen Sie 150 μl Augengel auf das Auge auf und legen Sie ein rundes Deckglas darauf.
- Führe eine grobe Untersuchung des Auges durch, indem du die Hornhaut, die Iris, die Pupille, die Linse und die Bindehaut beobachtest. Visualisieren Sie durch die Pupille den Fundus des Mausauges, indem Sie die Fokusebene anpassen. Stellen Sie den Kopf so lange ein, bis sich der optische Kopf in der Mitte der Pupille befindet, und minimieren Sie die Bewegung des Kopfes durch die richtige Positionierung auf dem Kissen.
- Klopfen Sie mehrmals vorsichtig auf den Boden des Röhrchens mit den hES-Zellen, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu erhalten. Entnehmen Sie mit der 10-μl-Glasmikroliterspritze mit einer stumpfen 33G-Nadel 2 μl Zellen/Medien. Entnehmen Sie die Zellen kurz vor der Injektion, um eine Zellabsetzung/Verklumpung in der Spritze zu vermeiden.
- Machen Sie mit einer 30-G-Einwegnadel eine Sklerektomiewunde 2 mm hinter dem Limbus. Halten Sie den Winkel der Nadel bei ~45°, um eine Berührung der Linse zu vermeiden. Sobald die Nadelspitze im Auge sichtbar ist, ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück. Entsorgen Sie die Nadel nach Gebrauch in den scharfen Behälter, um Verletzungen durch Nadelstiche zu vermeiden.
- Nehmen Sie die Glasspritze und führen Sie die stumpfe Nadel in die Sklerektomiewunde ein. Ohne die Linse zu berühren, schieben Sie die stumpfe Nadel vor, bis sie die gegenüberliegende Netzhaut der Eintrittswunde erreicht. Stellen Sie sicher, dass der Injektionsbereich frei von großen Blutgefäßen der Netzhaut ist, um Blutungen zu vermeiden.
- Sanft in die Netzhaut eindringen, bis ein Druckzweig auf der Sklera zu sehen ist. Halten Sie das stumpfe Ende der Nadel parallel zur Sklera, um ein Austreten der Zellen in den Glaskörper zu vermeiden.
- Injizieren Sie langsam 2 μl Zellsuspension oder PRDM-Medien (Kontrolle) in den subretinalen Raum, während der Druck auf die Spritze sanft aufrechterhalten wird. Nach einer erfolgreichen Injektion sollte sich an der Injektionsstelle eine sichtbare Blase (d. h. eine erhabene Netzhaut mit der Zellsuspension/dem darin enthaltenen Medium) bilden.
HINWEIS: Während der Injektion sollte nur sanfter Druck ausgeübt werden, um ein Einreißen der Netzhaut und eine Verstopfung der Zellen an der Nadelspitze zu vermeiden. - Nachdem Sie das Bläschen bestätigt haben, warten Sie 10 Sekunden, damit sich die Zellen beruhigt haben. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus dem Auge zurück.
- Intraoperative optische Kohärenztomographie (OCT) der Blase (optional)
- Positionieren Sie das Mausauge, um die Blase unter dem Mikroskop sichtbar zu machen, indem Sie den Kopf langsam bewegen. Sichern Sie die Position, indem Sie den Kopf sanft festhalten. Eine zusätzliche Pupillenerweiterung ist nicht notwendig. Entfernen Sie nicht das Deckglas und das Gel auf dem Auge. Es bietet ein klares optisches Medium, um die Blase zu visualisieren.
- Führen Sie die intraoperative OCT mit der integrierten iOCT-Funktion des Operationsmikroskops durch.
- Drücken Sie die Option Cube auf dem OCT-Bildschirm und positionieren Sie den Scanbereich auf dem Bleb, indem Sie die Pfeiltasten drücken. Passen Sie das OAT an, indem Sie Zentrierung und Fokus verschieben, um die beste OCT-Qualität zu erzielen. Drücken Sie auf Erfassen/Scannen , um den OCT-Scan des Brütchenbereichs zu erhalten. Überprüfen Sie die Bilder, um die Qualität der Scans zu überprüfen.
- Genesung
- Entfernen Sie das Deckglas und reinigen Sie das Gel mit Gaze. Tragen Sie einmal nach der Injektion eine antibiotische Salbe auf, um eine Infektion zu verhindern.
- Lassen Sie das Tier unter warmem Licht von der Narkose erholen, bis es wieder zu Bewusstsein kommt, um das Brustbein zu behalten und in den häuslichen Käfig zurückzukehren. Überwachen Sie das Tier mindestens 3 Tage nach der Injektion auf Anzeichen von Entzündungen, Infektionen und Stress.
HINWEIS: Das 150 W warme Licht sollte mindestens 30 cm vom Tierkäfig entfernt sein, und es ist Vorsicht geboten, um eine Verbrennung zu vermeiden. - Verabreichen Sie eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0,05 mg/kg) 8 stündlich für 1 Tag oder nach Empfehlung des Tierarztes. Wenn eine Entzündung oder Infektion des Auges beobachtet wird, konsultieren Sie einen Tierarzt für eine angemessene Behandlung.
- Reinigung und Sterilisation der Instrumente
- Spülen Sie die 10-μl-Glasmikroliterspritze und die stumpfe 33G-Nadel 10x mit 100% Ethanol. Waschen Sie das Ethanol ab, indem Sie die Spritze mit destilliertem Wasser aufblitzen lassen.
- Zerlegen Sie die Glasspritze und die Nadel. Trocknen Sie die Spritze zur Aufbewahrung.
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Representative Results
Die 10-μl-Glasspritze wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers zusammengebaut (Abbildung 1), und die stumpfe Nadel, die zur Abgabe der Zellsuspension/des Mediums verwendet wird, ist in Abbildung 1B dargestellt. Verschiedene Ansätze für die subretinale Injektion sind in Abbildung 2 dargestellt. In diesem Protokoll beschreiben wir den Pars-Plana-Ansatz (Abbildung 2C). Die stumpfe Nadel, die auf einer Glasspritze montiert war, wurde durch eine Sklerotomiewunde eingeführt und gelangte in den subretinalen Raum auf der ganzen Welt. Wie in Abbildung 3A dargestellt, wurden die Flugbahn der Nadel, das Eindringen durch die Netzhaut und die Abgabe der Zellen direkt unter dem Mikroskop überwacht, während die Injektion durchgeführt wurde. Die erfolgreiche Verabreichung der Zellen/Medien wurde durch die Beobachtung einer Blase an der Injektionsstelle bestätigt (Abbildung 3B). Eine erfolgreiche Blase kann als eine leicht weißliche Farbe identifiziert werden, die einem Wasserballon ähnelt. Eine fehlgeschlagene Abgabe wird durch das Austreten der Zellen/Medien in den Glaskörper an der Injektionsstelle und das Versagen der Bildung einer Blase beobachtet. Der OCT-Scan wurde an dem injizierten Bereich durchgeführt, und der Scan zeigte schwebende individualisierte hES-Zellen im zellbehandelten Auge (Abbildung 4A), während das medial behandelte Auge klare Flüssigkeit ohne Zellen im subretinalen Raum zeigte (Abbildung 4B). Die individualisierten hES-Zellen werden als hyperreflektive Materialien identifiziert, die im subretinalen Raum verteilt sind (Abbildung 4A). Die Erfolgsrate der Injektion wurde berechnet, indem die Anzahl der Augen mit erfolgreicher Bildung der Blase notiert wurde. Wir haben die Anwendungen, die diesen Ansatz in unserem Labor verwendet haben, und die Erfolgsrate der Injektionen einbezogen (Tabelle 1).
Abbildung 1: Instrumente, die während der Injektion verwendet werden. (A) Die 10-μl-Glasspritze ist mit einer stumpfen 33G-Nadel befestigt. (B) Vergrößern Sie das Bild der stumpfen 33G-Nadel. (C) Kissen, auf dem der Kopf des Tieres ruhen kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Verschiedene Wege der subretinalen Injektion . (A) Transkornealer Weg: Die Injektionsnadel verläuft durch die Hornhaut und die Pupille, um in den subretinalen Raum einzudringen. (B) Transskleraler Weg: Der subretinale Raum wird direkt durch die Sklera erreicht. (C) Pars-plana-Verlauf: Die Injektionsnadel wird über einen Schnitt am Limbus in den Glaskörper eingeführt. Die Nadel gelangt in den subretinalen Raum, indem sie in die Netzhaut eindringt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Fundusbilder des Auges während der subretinalen Injektion. (A) Bevor die subretinale Injektion durchgeführt wurde, war die Spitze der Nadel im Glaskörperraum zu sehen, der die Netzhaut berührte, wobei die großen retinalen Blutgefäße vermieden wurden. (B) Nach der subretinalen Injektion bildete sich an der Injektionsstelle eine sichtbare Blase (gelbe gestrichelte Linie). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Intraoperative OCT-Scans der injizierten Augen. Die Scans wurden unmittelbar nach der Injektion durchgeführt. (A) hES-behandeltes Auge: Die obere Tafel zeigte die Position des OCT-Scans (cyanfarbene und rosa Querschnittslinien) auf dem Auge; hES-Zellen wurden im behandelten Auge im subretinalen Raum beobachtet (gelbe gestrichelte Linie, mittlere und untere Tafeln). (B) Medienbehandeltes Auge: Die obere Tafel zeigte die Position des OCT-Scans (cyanfarbene und rosa Querschnittslinien) auf dem Auge; Im subretinalen Raum des medial injizierten Auges wurde eine klare Flüssigkeit ohne Zellen beobachtet (gelbe gestrichelte Linie, mittlere und untere Tafel). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Anträge | Empfänger-Stamm | Erfolgsquote |
| AAV | Rpe65rd12/J | 80% |
| AAV | C57BL/6-KARTON | 95% |
| hESC-abgeleitete Vorläuferzellen | Rd10-/- | 95% |
Tabelle 1: Die Erfolgsrate der subretinalen Injektion in verschiedenen Anwendungen.
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Discussion
Die subretinale Injektion wurde für die Zellsuspensionstransplantation zur Behandlung von RPE und Netzhauterkrankungen verwendet 23,25,26,27,28,31,40. Dieser Ansatz ist in Studien an Nagetieren nicht nur für Zelltransplantations- und Gentherapieansätze, sondern auch für die Evaluierung neuartiger therapeutischer Wirkstoffe für Netzhauterkrankungen von entscheidender Bedeutung. Derzeit werden drei Hauptrouten verwendet, um Zellen oder AAVs in den subretinalen Raum zu bringen, d. h. die transkorneale Route, die transsklerale und die Pars-plana-Route.
Beim transkornealen Ansatz verläuft die Injektionsnadel durch die Hornhaut, die Pupille und schließlich die Netzhaut, um die Zellen in den subretinalen Raum zu bringen und ein erfolgreiches Bläschen zu bilden. Der Vorteil des transkornealen Ansatzes ist die Fähigkeit, eine vollständige Netzhautablösung beim Empfängerzu erzeugen 47. Es kann eine größere Anzahl von Zellen liefern; Die Längsschnittbeobachtung zur Untersuchung der strukturellen Konformation und Zellintegration ist bei diesem Ansatz jedoch eine Herausforderung. Zu den Komplikationen gehören außerdem die Bildung von Katarakt, Synechien und Hornhauttrübung, was die Längsschnittbeobachtungen zu einer Herausforderung macht 11,45,47,48. Alternativ wird der trans-sklerale Ansatz auch verwendet, um AAV in den subretinalen Raum44,49 zu bringen. Dieser Ansatz ist für neugeborene Mäuse nützlich und gilt als sicherer, da die Nadel nicht durch das Augenmedium geführt werden muss. Aderhautblutungen, Rückfluss der Lösung von der Injektionsstelle, Perforation der Netzhaut und Leckagen in den Glaskörper sollten jedoch nicht außer Acht gelassen werden.
Wir haben den Pars-plana-Ansatz gewählt, um die hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen mit einer stumpfen 33G-Nadel in den subretinalen Raum einzuführen. Bei diesem Ansatz wurde die Injektionsnadel über den Schnitt im Limbusbereich eingeführt. Die Nadel wurde dann durch den Glaskörper geführt und gelangte schließlich durch die Netzhaut in den subretinalen Raum. Zellklumpen wurden häufig beobachtet und können die Abgabe von Zellen blockieren, wenn ungeeignete Nadelgrößen verwendet werden. Die Resuspension von Zellen im Mikrofugenröhrchen sollte sorgfältig mit einer 10-μl-Pipettenspitze durchgeführt werden, bevor sie in die Injektionsspritze geladen wird. Wir versuchten zunächst, eine 34G-Nadel zu verwenden, wobei die Blockade der Nadel durch die Zellen oft beobachtet wurde. Eine geeignete Größe der Nadel sollte für bestimmte Zelltypen getestet werden, insbesondere Nadeln mit engem Durchmesser neigen dazu, weniger lebensfähige Zellen zu erhalten, wenn sie injiziertwerden 50. Einer der Vorteile dieses Ansatzes ist die direkte Visualisierung während der Injektion, die es dem Chirurgen ermöglicht, den spezifischen Ort für die Zellabgabe zu überwachen und sorgfältig auszuwählen. Der Injektionsbereich und die Nadel sollten während des Eingriffs gut sichtbar sein. Anästhesieinduzierte Katarakt- und Hornhauttrübungen können die ordnungsgemäße Abgabe von Zellen an einen bestimmten Ort stark beeinträchtigen.
Während der Injektion sollte die Nadel senkrecht in die Netzhaut eindringen und das stumpfe Ende der Nadel sollte parallel zur Sklera verlaufen, um das Austreten der injizierten Zellen in den Glaskörper zu minimieren (Abbildung 3). Bei der Injektion sollte nur leichter Druck auf die Spritze ausgeübt werden. Ein starker Druck kann zu Netzhautrissen, Blutungen, Leckagen der Zellen in den Aderhautraum, Versagen der Zellen, die Nadel zu passieren, und Punktion des Augapfels führen. Der optimale Druck kann sichergestellt werden, wenn die Nadelspitze gerade die Netzhaut passiert hat und ein kleiner weißer Druckpunkt an der Nadelspitze zu sehen ist. Nach der Injektion sollte die Nadel langsam und vorsichtig von der Injektionsstelle zurückgezogen werden, um das Austreten von injizierten Zellen in den Glaskörper zu verhindern.
Die Einschränkung dieses Ansatzes ist die herausfordernde Lernkurve. Eine Studie zeigte, dass ein ausgebildeter Augenarzt 364 Injektionen bei Mäusen durchführen musste, um eine Erfolgsrate von 95 % zu erreichen, während von weniger erfahrenen Auszubildenden mit chirurgischer Erfahrung erwartet wurde, dass sie eine höhere Anzahl von Schulungen benötigten46. Zu den Komplikationen dieses Ansatzes gehören Nadelspuren in der Netzhaut, Rückfluss von Zellen in den Glaskörperraum, Blutungen aus der Aderhaut/Netzhaut und iatrogener Katarakt. Bei ausreichendem Training werden diese Komplikationen jedoch deutlich seltener beobachtet46.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Methode die hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen in den subretinalen Raum von rd10-Mäusen bringen kann, wie die OCT-Scans zeigen. Dieser Ansatz kann zur Erforschung neuartiger therapeutischer Verbindungen, der Transplantation verschiedener Zelltypen und der Gentherapie zur Behandlung von Erkrankungen der äußeren Netzhaut und RPE-bedingten Erkrankungen verwendet werden.
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Disclosures
Hwee Goon Tay ist Mitbegründer von Alder Therapeutics AB. Andere Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.
Acknowledgments
Wir danken Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee und Yingying Chung für die technische Unterstützung bei der Herstellung der 32 hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen nach der Kryokonservierung. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse des National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) und des National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) an H.G.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
- Molday, R. S., Moritz, O. L.
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
- Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
- Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
- Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
- Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
- Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
- Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
- Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
- Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
- Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
- Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
- Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
- Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
- Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
- Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
- Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
- Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
- Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
- Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
- Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
- Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
- Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
- Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
- Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
- Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
- Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
- Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
- Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
- Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
- Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
- Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
