Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

आरडी 10 चूहों में मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज की उप-रेटिना डिलीवरी

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/65848
Automatic Translation
*1, *2, 2,3, 1,3,4
1Singapore National Eye Centre, Singapore Eye Research Institute, 2Centre for Vision Research, Duke-NUS Medical School, 3Ophthalmology and Visual Sciences Academic Clinical Program, DUKE-NUS Medical School, 4Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore
* These authors contributed equally

Summary

हम पोस्ट-क्रायोप्रेज़र्व्ड एचईएससी-व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज कोशिकाओं की तैयारी और आरडी 10 चूहों में इन कोशिकाओं के उप-रेटिना वितरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं का पुनर्जनन उन्नत चरणों में वंशानुगत और उम्र बढ़ने वाले रेटिना रोगों दोनों के उपचार के लिए एक आशाजनक चिकित्सा है। हमने दिखाया है कि मानव पुनः संयोजक रेटिना-विशिष्ट लैमिनिन आइसोफॉर्म मैट्रिक्स फोटोरिसेप्टर पूर्वज के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) के भेदभाव का समर्थन करने में सक्षम है। इसके अलावा, इन कोशिकाओं के उप-रेटिना इंजेक्शन ने आरडी 10 कृंतक और खरगोश मॉडल में आंशिक बहाली भी दिखाई है। उप-रेटिना इंजेक्शन को एक स्थापित विधि के रूप में जाना जाता है जिसका उपयोग फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियल (आरपीई) परत को दवा यौगिकों को वितरित करने के लिए किया जाता है, जो लक्ष्य स्थान से निकटता के कारण होता है। इसका उपयोग रेटिना रोगों के इलाज के लिए उप-रेटिना अंतरिक्ष में एडेनो-जुड़े वायरल वैक्टर देने के लिए भी किया गया है। murine नेत्रगोलक के आकार में बाधा के कारण murine मॉडल में दवा यौगिकों और कोशिकाओं के उप-रेटिना वितरण चुनौतीपूर्ण है. यह प्रोटोकॉल इंजेक्शन के लिए एचईएससी-व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज कोशिकाओं की तैयारी और आनुवंशिक रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा उत्परिवर्ती, आरडी 10 चूहों में इन कोशिकाओं की उप-रेटिना वितरण तकनीक के लिए विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण सेल थेरेपी को लक्षित क्षेत्र में अनुमति देता है, विशेष रूप से रेटिना की बाहरी परमाणु परत, जहां फोटोरिसेप्टर अध: पतन के लिए अग्रणी बीमारियां होती हैं।

Introduction

विरासत में मिली रेटिना की बीमारियां और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन फोटोरिसेप्टर सेल हानि और अंततः अंधापन का कारण बनता है। रेटिना फोटोरिसेप्टर रेटिना की बाहरी खंड परत है जिसमें फोटोट्रांसडक्शन (यानी, न्यूरोनल संकेतों में प्रकाश का रूपांतरण) के लिए जिम्मेदार विशेष कोशिकाएं शामिल हैं। रॉड और शंकु फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं रेटिना रंजित परत (आरपीई)1से सटे हुए हैं। सेल हानि की भरपाई के लिए फोटोरिसेप्टर सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी एक उभरता हुआ और विकासशील चिकित्सीय दृष्टिकोण रहा है। भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी)2,3,4,प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी)-व्युत्पन्न आरपीई कोशिकाओं, और रेटिना पूर्वज कोशिकाओं (आरपीसी)4,5,6,7,8 क्षतिग्रस्त फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं को बहाल करने के लिए इस्तेमाल किया गया. उप-रेटिना अंतरिक्ष, रेटिना और आरपीई के बीच एक सीमित स्थान, क्षतिग्रस्त फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं, आरपीई, और म्यूएलर कोशिकाओं को बदलने के लिए इन कोशिकाओं को जमा करने के लिए एक आकर्षक स्थान है क्योंकि इसके आसपास 9,10,11.

जीन और सेल थेरेपी पूर्व-नैदानिक अध्ययनों में विभिन्न रेटिना रोगों के लिए पुनर्योजी चिकित्सा के लिए उप-रेटिना स्थान का उपयोग कर रहे हैं। इसमें जीन या जीन संपादन उपकरण की कार्यात्मक प्रतियों की डिलीवरी या तो विरोधी भावना ओलिगोन्यूक्लियोटाइड थेरेपी12,13 या सीआरआईएसपीआर/कैस 9 या एडेनो-जुड़े वायरस (एएवी) आधारित रणनीति 14,15,16 के माध्यम से आधार संपादन, सामग्री का आरोपण (जैसे, आरपीई शीट, रेटिना प्रोस्थेटिक्स 17,18,19) और विभेदित स्टेम सेल-व्युत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड20 के माध्यम से शामिल है, 21,22 रेटिना और आरपीई से संबंधित बीमारियों के इलाज के लिए। RPE31-जुड़े लेबर जन्मजात अमोरोसिस (LCA)23,24, CNGA3-लिंक्ड achromatopsia25, MERTK से जुड़े रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा26, कोरॉइडेरेमिया 27,28,29,30 के इलाज के लिए उप-रेटिना स्पेस में hESC-RPE24 का उपयोग करके नैदानिक परीक्षण एक प्रभावी दृष्टिकोण साबित हुआ है। क्षतिग्रस्त क्षेत्र के आसपास के क्षेत्र में कोशिकाओं का प्रत्यक्ष इंजेक्शन उपयुक्त क्षेत्र, सिनैप्टिक एकीकरण और अंतिम दृश्य सुधार पर सेल निपटान की संभावना में काफी सुधार करता है।

भले ही मानव और बड़ी आंखों वाले मॉडल (यानी, सुअर 32,33,34,35, खरगोश 36,37,38,39,40, और गैर-मानव प्राइमेट 41,42,43) में उप-रेटिना इंजेक्शन स्थापित किया गया है, लेकिन म्यूरिन मॉडल में ऐसा इंजेक्शन अभी भी चुनौतीपूर्ण है नेत्रगोलक आकार और विशाल की विकृति के कारण माउस आंख पर कब्जा करने वाला लेंस44,45,46। हालांकि, आनुवंशिक रूप से संशोधित मॉडल केवल छोटे जानवरों में आसानी से उपलब्ध हैं और बड़े जानवरों (यानी, खरगोश और गैर-मानव प्राइमेट्स) में नहीं, इसलिए चूहों में उप-रेटिना इंजेक्शन रेटिना आनुवंशिक विकारों में उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण की जांच करने के लिए ध्यान आकर्षित करता है। कोशिकाओं या एएवी को उप-रेटिना अंतरिक्ष में पहुंचाने के लिए तीन प्रमुख दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा रहा है, अर्थात् ट्रांस-कॉर्नियल मार्ग, ट्रांस-स्क्लरल मार्ग और पार्स प्लाना मार्ग (चित्र 2देखें)। ट्रांस-कॉर्नियल और ट्रांस-स्क्लरल मार्ग इंजेक्शन साइट 11,44,45,47,48,49से मोतियाबिंद गठन, सिनेकिया, कोरॉइडल रक्तस्राव और भाटा से जुड़े हैं। हमने इंजेक्शन प्रक्रिया के प्रत्यक्ष दृश्य के रूप में पार्स प्लाना दृष्टिकोण को अपनाया, और इंजेक्शन साइट को माइक्रोस्कोप के तहत वास्तविक समय में प्राप्त किया जा सकता है।

हमने हाल ही में एक विधि का वर्णन किया है जो मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) को पुनः संयोजक मानव रेटिना-विशिष्ट लैमिनिन आइसोफॉर्म एलएन 523 का उपयोग करके ज़ेनोफ्री, रासायनिक रूप से परिभाषित स्थितियों के तहत फोटोरिसेप्टर पूर्वज में अलग कर सकता है। चूंकि एलएन 523 रेटिना में मौजूद पाया गया था, इसलिए हमने अनुमान लगाया कि मानव रेटिना के बाह्य मैट्रिक्स आला को इन विट्रो में पुन: व्यवस्थित किया जा सकता है और इस तरह एचईएससी36 से फोटोरिसेप्टर भेदभाव का समर्थन किया जा सकता है। एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण से पता चला है कि फोटोरिसेप्टर पूर्वज शंकु-रॉड होमोबॉक्स और रिकवरी को सह-व्यक्त करते हुए 32 दिनों के बाद उत्पन्न हुए थे। एक रेटिना अध: पतन 10 (आरडी 10) उत्परिवर्ती माउस मॉडल है कि autosomal मानव रेटिनाइटिस pigmentosa की नकल दिन 32 hESC व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर progenitors में vivo की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एचईएससी-व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज कोशिकाओं को पी 20 पर आरडी 10 चूहों के उप-रेटिना अंतरिक्ष में इंजेक्ट किया गया था, जहां फोटोसेप्टर शिथिलता और अध: पतन36 चल रहे हैं। यहां, हम पोस्ट-क्रायोप्रेज़र्व्ड एचईएससी-व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज की तैयारी और आरडी 10 चूहों के उप-रेटिना अंतरिक्ष में वितरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस विधि का उपयोग चूहों में उप-रेटिना अंतरिक्ष में एएवी, सेल निलंबन, पेप्टाइड्स या रसायनों को प्रशासित करने के लिए भी किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इन विवो प्रयोगों को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित दिशानिर्देशों और प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था SingHealth (IACUC) और एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (ARVO) ओप्थाल्मिक और विजन रिसर्च में जानवरों के उपयोग के लिए बयान। पिल्ले को P17 (पूर्व-प्रत्यारोपण) से P30 (पोस्ट-ट्रांसप्लांटेशन) तक इम्यूनोसप्रेस्ड किया गया था, उन्हें साइक्लोस्पोरिन (260 g/L) युक्त पीने का पानी खिलाकर।

1. क्रायोप्रेज़र्वेशन के बाद दिन 32 hESC व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज की तैयारी

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूर्व-गर्म फोटोरिसेप्टर भेदभाव माध्यम (पीआरडीएम)।
  2. तरल नाइट्रोजन से दिन 32 एचईएससी-व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज कोशिकाओं युक्त एक क्रायोवियल को पुनः प्राप्त करें। सूखी बर्फ पर रखें।
  3. 3-5 मिनट के लिए पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोवियल को पिघलाएं। पीआरडीएम के 1 एमएल में दिन 32 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 4 मिन के लिए 130 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
  4. सतह पर तैरनेवाला निकालें और पीआरडीएम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  5. सेल गिनती के लिए मिश्रण के 10 माइक्रोन निकालें. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 0.2% ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं को मिलाएं। सेल गिनती कक्ष स्लाइड में विंदुक सेल मिश्रण. स्वचालित सेल काउंटर द्वारा सेल नंबर और व्यवहार्यता निर्धारित करें।
  6. अगले चरण के लिए आगे बढ़ें जब सेल व्यवहार्यता 70% से ऊपर है. शेष सेल निलंबन को 4 मिनट के लिए 130 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। सतह पर तैरनेवाला निकालें और प्रत्यारोपण के लिए 3 x 105 कोशिकाओं/μL की एकाग्रता पर पीआरडीएम में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  7. दृश्यमान सेल गुच्छों के लिए निरीक्षण करें। माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 10 माइक्रोन पिपेट टिप का उपयोग करके बार-बार सेल क्लंप को फिर से निलंबित करें जब तक कि कोई दृश्यमान सेल क्लंप नहीं देखा जाता है। सुई के माध्यम से सेल समाधान के बाहर निकालना के लिए निरीक्षण करने के लिए 33 जी इंजेक्शन सिरिंज में लोड.

2. आरडी 10 चूहों में एचईएससी की उप-रेटिना डिलीवरी

  1. जानवरों की तैयारी
    1. इंट्रापेरिटोनियल दृष्टिकोण द्वारा 27G सुई से जुड़ी 1 एमएल ट्यूबरकुलिन सिरिंज में केटामाइन (20 मिलीग्राम/किग्रा शरीर के वजन) और xylazine (2 मिलीग्राम/किग्रा शरीर के वजन) के संयोजन का उपयोग करके माउस (P20, पुरुष/महिला, 3-6 ग्राम) को एनेस्थेटाइज करें। माउस को ब्यूप्रेनोर्फिन (0.05 मिलीग्राम/किग्रा) का एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन पूर्व-खाली एनाल्जेसिक के रूप में प्रशासित करें।
    2. संज्ञाहरण प्रशासित करने के बाद, पुतली फैलाव के लिए 1% tropicamide और 2.5% phenylephrine के प्रत्येक ड्रॉप टपकाना. आंख को सूखापन और संज्ञाहरण से संबंधित मोतियाबिंद से बचाने के लिए कॉर्निया पर एक नेत्र जेल लागू करें।
    3. पूरी तरह से संवेदनाहारी जब तक एक खाली पिंजरे में माउस रखें. पंजा पैड चुटकी द्वारा उचित संवेदनाहारी स्तर का आकलन करें और पुष्टि करें कि क्या जानवर कठिन चुटकी पर प्रतिक्रिया नहीं करता है।
    4. जब माउस पूरी तरह से संवेदनाहारी है, 38 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म पैड सेट पर जानवर जगह है.
  2. कोशिकाओं की उप-रेटिना डिलीवरी
    1. 1-पोर्ट ट्रांस-विट्रियल पार्स प्लाना दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए, जैसा कि यहां किया गया है, एक बाँझ वातावरण में उप-रेटिना इंजेक्शन करें। इंजेक्शन करने के लिए एक सीधा प्रकाश पथ के साथ एक ईमानदार ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें.
    2. सुई हब को हटाकर 10 माइक्रोन ग्लास सिरिंज तैयार करें। ग्लास सिरिंज पर 33G कुंद सुई माउंट. धातु हब कवर ले लो और ध्यान से सिरिंज पर सुई सुरक्षित.
    3. रिसाव और सुई की धैर्य के किसी भी लक्षण के लिए जाँच करने के लिए आसुत जल के साथ फ्लश. सिरिंज खाली करें और इसे सावधानी से किनारे पर रखें।
    4. एक तकिया पर संवेदनाहारी माउस रखें, उपचार आंख खुर्दबीन के उद्देश्य के लिए सीधे ऊपर देख के साथ. 0.5% प्रोपेराकाइन हाइड्रोक्लोराइड लागू करें और 30 एस की प्रतीक्षा करें। आंख पर नेत्र जेल के 150 माइक्रोन लागू करें और उस पर एक गोल कवर पर्ची रखें।
    5. कॉर्निया, आईरिस, पुतली, लेंस और कंजाक्तिवा को देखकर आंख की किसी न किसी परीक्षा करें। पुतली के माध्यम से, फोकल विमान को समायोजित करके माउस आंख के फंडस की कल्पना करें। सिर को तब तक समायोजित करें जब तक कि ऑप्टिक सिर पुतली के केंद्र में स्थित न हो जाए और तकिया पर उचित स्थिति द्वारा सिर की गति को कम करें।
    6. धीरे एक समान सेल निलंबन पाने के लिए कई बार hESCs के साथ ट्यूब के आधार नल. 33 जी कुंद सुई के साथ 10 माइक्रोन ग्लास माइक्रोलीटर सिरिंज का उपयोग करके, कोशिकाओं/मीडिया के 2 माइक्रोन को वापस ले लें। सिरिंज में सेल सेटलमेंट/क्लंपिंग से बचने के लिए इंजेक्शन से ठीक पहले कोशिकाओं को वापस ले लें।
    7. 30G डिस्पोजेबल सुई का उपयोग करके, लिम्बस के पीछे 2 मिमी एक स्क्लेरेक्टॉमी घाव बनाएं। लेंस को छूने से बचने के लिए ~ 45 डिग्री पर सुई के कोण रखें. एक बार सुई की नोक आंख में कल्पना की है, धीरे सुई वापस ले. सुई चुभन चोट से बचने के लिए उपयोग के बाद तेज बिन में सुई त्यागें.
    8. ग्लास सिरिंज ले लो और स्क्लेरेक्टॉमी घाव में कुंद सुई डालें। लेंस को छूने के बिना, कुंद सुई अग्रिम जब तक यह प्रवेश घाव के विपरीत रेटिना तक पहुँच जाता है. सुनिश्चित करें कि रक्तस्राव से बचने के लिए इंजेक्शन क्षेत्र प्रमुख रेटिना रक्त वाहिकाओं से स्पष्ट है।
    9. धीरे रेटिना घुसना जब तक श्वेतपटल पर एक दबाव शाखा देखा जाता है. श्वेतपटल के समानांतर सुई के कुंद अंत रखें कांच का अंतरिक्ष में कोशिकाओं के लीक से बचने के लिए.
    10. धीरे-धीरे सेल निलंबन या पीआरडीएम मीडिया (नियंत्रण) के 2 माइक्रोन को उप-रेटिना अंतरिक्ष में इंजेक्ट करें जबकि सिरिंज पर कोमल दबाव बनाए रखा जाता है। एक सफल इंजेक्शन के साथ, इंजेक्शन स्थल पर एक दृश्यमान ब्लीब (यानी, सेल निलंबन / मीडिया के साथ उठाया रेटिना) का गठन किया जाना चाहिए।
      नोट: केवल कोमल दबाव रेटिना फाड़ और सुई टिप पर कोशिकाओं की रुकावट से बचने के लिए इंजेक्शन के दौरान इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    11. ब्लीब की पुष्टि करने के बाद, कोशिकाओं को व्यवस्थित करने के लिए 10 एस की प्रतीक्षा करें। धीरे से आंख से सुई को वापस लें।
  3. इंट्राऑपरेटिव ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी (OCT) ब्लीब की स्कैनिंग (वैकल्पिक)
    1. धीरे-धीरे सिर को हिलाकर माइक्रोस्कोप के नीचे ब्लीब की कल्पना करने के लिए माउस आंख की स्थिति बनाएं। सिर को धीरे से पकड़कर स्थिति को सुरक्षित करें। कोई अतिरिक्त पुतली फैलाव आवश्यक नहीं है। कवर स्लिप और आंख पर जेल को न हटाएं। यह ब्लीब की कल्पना करने के लिए एक स्पष्ट ऑप्टिकल मीडिया देता है।
    2. ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के अंतर्निहित iOCT फ़ंक्शन का उपयोग करके इंट्रा-ऑपरेटिव OCT करें।
    3. OCT स्क्रीन पर क्यूब विकल्प दबाएं और तीर बटन दबाकर स्कैनिंग क्षेत्र को ब्लीब पर रखें। सर्वश्रेष्ठ OCT गुणवत्ता के लिए केंद्रीकरण और फ़ोकस को स्लाइड करके OCT को समायोजित करें। ब्लेब क्षेत्र के OCT स्कैन को प्राप्त करने के लिए कैप्चर/स्कैन दबाएं। स्कैन की गुणवत्ता की जांच करने के लिए छवियों की समीक्षा करें।
  4. वसूली
    1. कवर पर्ची निकालें और धुंध के साथ आंख से जेल को साफ करें। संक्रमण को रोकने के लिए इंजेक्शन के बाद एक बार एंटीबायोटिक मरहम लागू करें।
    2. पशु एक गर्म प्रकाश के तहत संज्ञाहरण से उबरने के लिए जब तक वे पर्याप्त चेतना हासिल स्टर्नल recumbency बनाए रखने और घर पिंजरे में लौटने के लिए अनुमति दें. सूजन, संक्रमण और संकट के संकेतों के लिए इंजेक्शन के बाद कम से कम 3 दिनों के लिए पशु की निगरानी करें।
      नोट: 150 डब्ल्यू गर्म प्रकाश पशु पिंजरे से कम से कम 30 सेमी दूर होना चाहिए, और जलने की चोट से बचने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए।
    3. ब्यूप्रेनोर्फिन (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) 8 घंटे 1 दिन या प्रति पशुचिकित्सा की सिफारिश के लिए चमड़े के नीचे इंजेक्शन का प्रशासन करें। यदि आंख की सूजन या संक्रमण देखा जाता है, तो उचित उपचार के लिए पशु चिकित्सा पेशेवर से परामर्श करें।
  5. उपकरणों की सफाई और नसबंदी
    1. 100% इथेनॉल 10x के साथ 10 माइक्रोन ग्लास माइक्रोलीटर सिरिंज और 33 जी कुंद सुई फ्लश करें। आसुत जल के साथ सिरिंज चमकती द्वारा इथेनॉल दूर धो लें.
    2. कांच सिरिंज और सुई से मिलता-जुलता है। भंडारण के लिए सिरिंज सूखी.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

10 माइक्रोन ग्लास सिरिंज निर्माता के निर्देशों (चित्रा 1) के अनुसार इकट्ठा किया गया था, और सेल निलंबन / मीडिया देने के लिए इस्तेमाल किया कुंद सुई चित्रा 1 बी में दिखाया गया है. उप रेटिना इंजेक्शन के लिए विभिन्न दृष्टिकोण चित्रा 2 में सचित्र हैं. हम इस प्रोटोकॉल (चित्रा 2सी) में पार्स प्लाना दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। एक ग्लास सिरिंज पर घुड़सवार कुंद सुई को एक स्क्लेरोटॉमी घाव के माध्यम से डाला गया था और दुनिया भर में उप-रेटिना स्थान तक पहुंचा गया था। जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, सुई के प्रक्षेपवक्र, रेटिना के माध्यम से प्रवेश, और कोशिकाओं की डिलीवरी इंजेक्शन प्रदर्शन करते समय सीधे माइक्रोस्कोप के नीचे निगरानी की गई थी। कोशिकाओं/मीडिया के सफल वितरण इंजेक्शन साइट (चित्रा 3 बी) पर एक धब्बा देख द्वारा पुष्टि की गई थी. एक सफल ब्लीब को पानी के गुब्बारे के समान हल्के सफेद रंग के रूप में पहचाना जा सकता है। इंजेक्शन स्थल पर कांच के स्थान में कोशिकाओं/मीडिया के रिसाव और एक ब्लीब बनाने में विफलता द्वारा एक असफल वितरण देखा जाता है। ओसीटी स्कैन इंजेक्शन क्षेत्र पर किया गया था, और स्कैन ने सेल-उपचारित आंख(चित्रा 4ए)में फ्लोटिंग व्यक्तिगत एचईएससी दिखाया, जबकि मीडिया-उपचारित आंख ने उप-रेटिना स्पेस(चित्रा 4बी)में कोशिकाओं के बिना स्पष्ट तरल पदार्थ दिखाया। व्यक्तिगत एचईएससी को उप-रेटिना स्पेस(चित्रा 4ए)में वितरित हाइपररिफ्लेक्टिव सामग्री के रूप में पहचाना जाता है। इंजेक्शन की सफलता दर की गणना ब्लीब के सफल गठन के साथ आंखों की संख्या को ध्यान में रखते हुए की गई थी। हमने उन अनुप्रयोगों को शामिल किया जिन्होंने हमारी प्रयोगशाला में इस दृष्टिकोण को अपनाया और इंजेक्शन की सफलता दर(तालिका 1)।

Figure 1
चित्रा 1: इंजेक्शन के दौरान इस्तेमाल किए जाने वाले उपकरण। (ए) 10 माइक्रोन ग्लास सिरिंज एक 33 जी कुंद सुई के साथ मुहिम शुरू की है. (बी) 33 जी कुंद सुई की ज़ूम-इन तस्वीर। (सी) जानवर के सिर पर आराम करने के लिए तकिया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: उप-रेटिना इंजेक्शन के विभिन्न मार्ग। (ए) ट्रांस-कॉर्नियल मार्ग: इंजेक्शन सुई उप-रेटिना अंतरिक्ष में प्रवेश करने के लिए कॉर्निया और पुतली से गुजरती है। (बी) ट्रांस-स्क्लेरल मार्ग: उप-रेटिना स्थान को सीधे श्वेतपटल के माध्यम से पहुँचा जाता है। (सी) पार्स प्लाना मार्ग: इंजेक्शन सुई को लिम्बस पर एक चीरा के माध्यम से कांच के स्थान में डाला जाता है। सुई रेटिना को भेदकर उप-रेटिना स्थान तक पहुंचती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: उप-रेटिना इंजेक्शन के दौरान आंख की फंडस छवियां। (ए) उप-रेटिना इंजेक्शन किए जाने से पहले, सुई की नोक को रेटिना को छूने वाले कांच के स्थान में देखा जा सकता था, जिससे प्रमुख रेटिना रक्त वाहिकाओं से बचा जा सकता था। (बी) उप-रेटिना इंजेक्शन के बाद, इंजेक्शन साइट (पीले बिंदीदार रेखा) पर एक दृश्य ब्लीब का गठन किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: इंजेक्शन आंखों के इंट्राऑपरेटिव ओसीटी स्कैन। इंजेक्शन के तुरंत बाद स्कैन किया गया। (ए) एचईएससी ने आंख का इलाज किया: शीर्ष पैनल ने आंख पर ओसीटी स्कैन (सियान और गुलाबी क्रॉस-अनुभागीय लाइनों) का स्थान दिखाया; एचईएससी उप-रेटिना अंतरिक्ष (पीले बिंदीदार रेखा, मध्य और नीचे पैनल) में उपचारित आंख में मनाया गया था। (बी) मीडिया-उपचारित आंख: शीर्ष पैनल ने आंख पर ओसीटी स्कैन (सियान और गुलाबी क्रॉस-अनुभागीय लाइनों) का स्थान दिखाया; कोशिकाओं के बिना स्पष्ट तरल पदार्थ मीडिया-इंजेक्शन आंख (पीले बिंदीदार रेखा, मध्य और नीचे पैनल) में उप-रेटिना अंतरिक्ष में मनाया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुप्रयोगों प्राप्तकर्ता तनाव सफलता दर
एएवी आरपीई 65आरडी 12 / 80%
एएवी सी57बीएल/6 95%
hESC व्युत्पन्न पूर्वज कोशिकाएँ आरडी10-/- 95%

तालिका 1: विभिन्न अनुप्रयोगों में उप-रेटिना इंजेक्शन की सफलता दर।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

उप-रेटिना इंजेक्शन का उपयोग आरपीई और रेटिना रोगों 23,25,26,27,28,31,40 के इलाज के लिए सेल निलंबन प्रत्यारोपण के लिए किया गया है। यह दृष्टिकोण न केवल सेल प्रत्यारोपण और जीन थेरेपी दृष्टिकोण के लिए कृंतक अध्ययन में अत्यधिक आवश्यक है, बल्कि रेटिना रोगों के लिए उपन्यास चिकित्सीय यौगिकों का मूल्यांकन करने के लिए भी आवश्यक है। वर्तमान में, तीन प्रमुख मार्गों का उपयोग कोशिकाओं या एएवी को उप-रेटिना स्पेस यानी ट्रांस-कॉर्नियल रूट, ट्रांस-स्क्लेरल और पार्स प्लाना मार्गों में पहुंचाने के लिए किया जा रहा है।

ट्रांस-कॉर्नियल दृष्टिकोण में, इंजेक्शन सुई कॉर्निया, पुतली और अंत में, रेटिना से होकर कोशिकाओं को उप-रेटिना स्थान में पहुंचाती है और एक सफल ब्लीब बनाती है। ट्रांस-कॉर्नियल दृष्टिकोण का लाभ प्राप्तकर्ता47 में एक पूर्ण रेटिना टुकड़ी बनाने की क्षमता है। यह बड़ी संख्या में कोशिकाओं को वितरित कर सकता है; हालांकि, संरचनात्मक रचना और सेल एकीकरण का अध्ययन करने के लिए अनुदैर्ध्य अवलोकन इस दृष्टिकोण में चुनौतीपूर्ण है। इसके अलावा, जटिलताओं में मोतियाबिंद गठन, सिनेकिया और कॉर्निया अस्पष्टता शामिल है, जिससे अनुदैर्ध्य अवलोकन 11,45,47,48 को चुनौती देते हैं। वैकल्पिक रूप से, ट्रांस-स्क्लरल दृष्टिकोण का उपयोग उप-रेटिना अंतरिक्ष44,49 में एएवी देने के लिए भी किया जाता है। यह दृष्टिकोण नवजात चूहों के लिए उपयोगी है और सुरक्षित माना जाता है क्योंकि सुई के लिए ओकुलर मीडिया से गुजरना आवश्यक नहीं है। हालांकि, कोरॉइडल रक्तस्राव, इंजेक्शन साइट से समाधान का भाटा, रेटिना का छिद्र, और कांच के स्थान में रिसाव को नजरअंदाज नहीं किया जाना चाहिए।

हमने 33G कुंद सुई का उपयोग करके hESC-व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज को उप-रेटिना अंतरिक्ष में पेश करने के लिए पार्स प्लाना दृष्टिकोण अपनाया। इस दृष्टिकोण में, इंजेक्शन सुई लिंबस क्षेत्र में चीरा के माध्यम से डाला गया था. सुई को तब कांच की गुहा के माध्यम से पारित किया गया था और अंत में रेटिना के माध्यम से उप-रेटिना स्थान तक पहुंचा था। सेल गुच्छों अक्सर मनाया गया और कोशिकाओं के वितरण अवरुद्ध कर सकते हैं जब अनुपयुक्त सुई आकार का उपयोग. माइक्रोफ्यूज ट्यूब में कोशिकाओं का पुनरुत्थान इंजेक्शन सिरिंज में लोड करने से पहले 10 माइक्रोन पिपेट टिप का उपयोग करके परिश्रमपूर्वक किया जाना चाहिए। हमने शुरू में एक 34G सुई का उपयोग करने का प्रयास किया, जहां कोशिकाओं द्वारा सुई की रुकावट अक्सर देखी जाती थी। सुई का एक उपयुक्त आकार विशिष्ट सेल प्रकार, विशेष रूप से संकीर्ण बोर सुइयों के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए कम व्यवहार्य कोशिकाओं देने के लिए जब50. इस दृष्टिकोण के फायदों में से एक इंजेक्शन के दौरान प्रत्यक्ष दृश्य है, जिससे सर्जन को सेल डिलीवरी के लिए विशिष्ट स्थान की निगरानी और सावधानीपूर्वक चयन करने की अनुमति मिलती है। प्रक्रिया के दौरान इंजेक्शन और सुई का क्षेत्र स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए। संज्ञाहरण प्रेरित मोतियाबिंद और कॉर्निया अस्पष्टता एक विशिष्ट स्थान पर कोशिकाओं के उचित वितरण को बहुत प्रभावित कर सकती है।

इंजेक्शन प्रदर्शन करते समय, सुई को लंबवत रेटिना में प्रवेश करना चाहिए, और सुई का कुंद अंत श्वेतपटल के समानांतर होना चाहिए ताकि कांच की जगह(चित्रा 3)में इंजेक्शन कोशिकाओं के रिसाव को कम किया जा सके। इंजेक्शन करते समय सिरिंज पर केवल कोमल दबाव लागू किया जाना चाहिए। एक मजबूत दबाव से रेटिना के आँसू, रक्तस्राव, कोरॉइडल स्पेस में कोशिकाओं का रिसाव, सुई से गुजरने के लिए कोशिकाओं की विफलता और नेत्रगोलक का पंचर हो सकता है। इष्टतम दबाव का आश्वासन दिया जा सकता है जब सुई टिप सिर्फ रेटिना के माध्यम से पारित कर दिया, और एक छोटे से सफेद दबाव डॉट सुई टिप पर देखा जाता है. इंजेक्शन के बाद, सुई धीरे धीरे और धीरे इंजेक्शन अंतरिक्ष में इंजेक्शन कोशिकाओं के रिसाव को रोकने के लिए इंजेक्शन जगह से वापस ले लिया जाना चाहिए.

इस दृष्टिकोण की सीमा चुनौतीपूर्ण सीखने की अवस्था है। एक अध्ययन से पता चला है कि एक प्रशिक्षित नेत्र रोग विशेषज्ञ को 95% सफलता दर प्राप्त करने के लिए चूहों में 364 इंजेक्शन करने की आवश्यकता होती है, जबकि सर्जिकल अनुभव वाले कम अनुभवी प्रशिक्षुओं को अधिक संख्या में प्रशिक्षण46 की आवश्यकता होती है। इस दृष्टिकोण की जटिलताओं में रेटिना में सुई ट्रैक, कांच के स्थान में कोशिकाओं का भाटा, कोरॉइड/रेटिना से रक्तस्राव और आईट्रोजेनिक मोतियाबिंद शामिल हैं। हालांकि, प्रशिक्षण की एक पर्याप्त राशि के साथ, इन जटिलताओं काफी कम46 मनाया जाता है.

अंत में, हमारी विधि hESC व्युत्पन्न photoreceptor progenitors आरडी 10 चूहों के उप रेटिना अंतरिक्ष में वितरित कर सकते हैं, के रूप में स्पष्ट रूप से OCT स्कैन द्वारा दिखाया गया है. बाहरी रेटिना और आरपीई से संबंधित बीमारियों के उपचार के लिए उपन्यास चिकित्सीय यौगिकों, विभिन्न सेल प्रकार प्रत्यारोपण और जीन थेरेपी का पता लगाने के लिए इस दृष्टिकोण को अपनाया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hwee Goon Tay एल्डर थेरेप्यूटिक्स AB के सह-संस्थापक हैं। अन्य लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम वेई शेंग टैन, लुआन चियांग Xue येन, Xinyi ली, और Yingying चुंग क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद दिन 32 hESC व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज की तैयारी के लिए तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए धन्यवाद. इस काम को नेशनल मेडिकल रिसर्च काउंसिल यंग इन्वेस्टिगेटर रिसर्च ग्रांट अवार्ड (NMRC/OFYIRG/0042/2017) और नेशनल रिसर्च फाउंडेशन 24th कॉम्पिटिटिव रिसर्च प्रोग्राम ग्रांट (CRP24-2020-0083) से H.G.T. को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.3% Tobramycin Novartis NDC  0078-0813-01 Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone Novartis NDC 0078-0876-01 Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride Alcon NDC 0998-0016-15 0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe Turemo SS01T2713
1% Tropicamide Alcon NDC 0998-0355-15 1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride Alcon NDC 0998-0342-05 2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate Costar 3526
30 G Disposable needle Becton Dickinson (BD) 305128
33 G, 20 mm length blunt needles Hamilton 7803-05
Automated Cell Counter NanoEnTek Model: Eve
B27 without Vitamin A Life Technologies 12587001 2%36
Buprenorphine Ceva Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7 Sigma C0742 5 µM36
Cyclosporine Novartis 260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells DUKE-NUS Medical School Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze Winner Industries Co. Ltd. 1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium Gibco 11710–035
hESC cell line H1 WiCell Research Institute WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02-50 10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Prospec-Tany Technogene CYT-272 10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) Ceva Santé Animale KETALAB03
LN-521 Biolamina LN521-02 1 µg36
mFreSR STEMCELL Technologies 5854
Microlitre glass syringe (10 mL) Hamilton 7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) Selleckchem S2215 10 µM36
N-2 supplement Life Technologies A13707-01 1%36
Non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140–050 1x36
NutriStem XF Media Satorius 05-100-1A
Operating microscope Zeiss OPMI LUMERA 700 With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) DUKE-NUS Medical School See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate Gibco 11360–070 1 mM36
Rd10 mice Jackson Laboratory B6.CXB1-Pde6brd10/J mice Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g 
Retinoic acid Tocris Bioscience 0695/50 0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm) Fisher Scientific 12-545-80
SB431542 Sigma S4317 0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g) Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) Troy Laboratories LI0605
β-mercaptoethanol Life Technologies 21985–023 0.1 mM36

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  2. Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
  3. Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
  4. Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
  5. Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
  6. Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
  7. Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
  8. Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
  9. Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
  10. Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
  11. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
  12. Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
  13. Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
  14. Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
  15. Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
  16. Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
  17. Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
  18. Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
  19. Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
  20. Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
  21. McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
  22. Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
  23. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
  24. Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
  25. Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
  26. Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
  27. MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
  28. Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
  29. Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
  30. Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
  31. Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
  32. Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
  33. Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
  34. Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
  35. Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
  36. Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
  37. Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
  38. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
  39. Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
  40. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
  41. Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
  42. Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
  43. Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
  44. Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
  45. Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
  46. Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
  47. Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
  48. Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
  49. Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
  50. Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).

Tags

उप-रेटिना डिलीवरी मानव भ्रूण स्टेम सेल फोटोरिसेप्टर पूर्वज रेटिना रोग लैमिनिन आइसोफॉर्म मैट्रिक्स भेदभाव आरडी 10 चूहे उप-रेटिना इंजेक्शन बहाली कृंतक और खरगोश मॉडल फार्मास्युटिकल यौगिक रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियल (आरपीई) परत एडेनो-जुड़े वायरल वैक्टर म्यूरिन मॉडल नेत्रगोलक आकार की बाधा सेल थेरेपी रेटिना की बाहरी परमाणु परत फोटोरिसेप्टर अध: पतन
<em>आरडी 10</em> चूहों में मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज की उप-रेटिना डिलीवरी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tun, S. B. B., Shepherdson, E., Tay, … More

Tun, S. B. B., Shepherdson, E., Tay, H. G., Barathi, V. A. Sub-Retinal Delivery of Human Embryonic Stem Cell Derived Photoreceptor Progenitors in rd10 Mice. J. Vis. Exp. (200), e65848, doi:10.3791/65848 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter