جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عامل النسخ أربعة ، والدوكسيسيكلين محرض Lentiviral نظام تنبيغ

مرحباً، اسمي براد هاميلتون. أنا من قسم البحث والتطوير هنا في STEM Gen. سنعرض لكم اليوم إجراءً حول كيفية توليد خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات من أرومات ليفية جنينية للفئران.

يمكن استخدام هذا الإجراء لتوليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات وكذلك لدراسة عملية إعادة البرمجة. لذا، فلنبدأ. ابدأ باستزراع الخلايا الليفية الجنينية للفئران، أو خلايا MEF، في طبق بقطر 15 سنتيمتر مغطى بالجيلاتين بكثافة 4 × 10⁵ خلية لكل طبق.

أضف الآن 30 milliliters من وسط نمو meth واحضر الخلايا لمدة يومين عند 37 °C و 5% carbon dioxide حتى تصل نسبة الالتحام إلى 80% تقريبًا. وعند الانتهاء من التحضين، اسحب الوسط وأضف 30 milliliters من وسط النمو المضاف إليه الفيروس lentivirus المركز.

قم بهز الطبق برفق لضمان التوزيع المتساوي للوسط. قم بحضن الخلايا طوال الليل عند 37 °C و 5% CO2 حتى يكتمل نقل الجينات الفيروسي. لننتقل الآن إلى إعادة البرمجة المحفزة بواسطة doxycycline.

لبدء عملية إعادة البرمجة بعد 20 إلى 24 ساعة من عملية نقل الجينات، يتم استخدام التريبسين للخلايا المنقولة إليها الجينات ثم يتم طردها مركزياً عند 200 Gs لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يتم سحب الوسط بعناية من فوق كتلة الخلايا وإعادة تعليق الخلايا في وسط نمو. وبمجرد تعليقها، يتم استزراع الخلايا المنقولة إليها الجينات بتركيز مناسب لحجم طبق المزرعة الخلوية المستخدم.

نستخدم هنا 2.5 × 10⁵ خلية لكل طبق قطر 10 cm في تجارب كفاءة إعادة البرمجة وعزل مستعمرات IPS، و2 × 10⁴ خلية لكل بئر في أطباق ذات 4 آبار في تجارب الكيمياء المناعية. ولمراقبة كفاءة ترانسدكشن (transduction)، يتم تحضين الخلايا طوال الليل عند 37 °C و5% CO2. وفي هذه المرحلة، يمكن تجميد الخلايا في النيتروجين السائل للتحليلات المستقبلية إذا لزم الأمر.

في اليوم التالي، يتم سحب الوسط واستبداله بوسط نمو طازج مُدعم بالـ doxycycline بتركيز نهائي قدره 2 µg/mL. كما ندرج مجموعة ضابطة سلبية تحتوي على وسط بدون doxycycline. وأخيرًا، يتم تحضين الخلايا عند 37 °C و 5% CO2.

لقد بدأنا عملية إعادة البرمجة. وبشكل عام، ستصبح مستعمرات الخلايا الجذعية متعددة القدرات كبيرة بما يكفي لعزلها بعد 16 إلى 22 يوماً.

قبل أن نستعرض هذا الإجراء، نحتاج أولاً إلى التحقق من كفاءة ترانسدكشن (transduction) باستخدام الكيمياء لتحديد كفاءة عملية الترانسدكشن. يُجرى اختبار الكيمياء المناعية على الخلايا التي أعيد زرعها في أطباق ذات أربع آبار بعد 48 ساعة من الحث باستخدام الدوكسيسيكلين. يجب تعديل جميع الأحجام المذكورة في هذا البروتوكول وفقاً لحجم طبق زراعة الخلايا، وابدأ بغسل الخلايا برفق.

بعد غسل الخلايا بـ PBS لا يحتوي على أيونات المغنيسيوم أو الكالسيوم، يتم تثبيت الخلايا باستخدام 500 microliters من 4%paraform aldehyde في PBS لمدة 15 دقيقة. وفي درجة حرارة الغرفة، تُغسل الخلايا مرة أخرى بلطف مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك، يتم نفاذ الخلايا عن طريق إضافة 500 microliters من 0.2%Tween 20 مبرد في PBS مع الحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد غسل الخلايا مرتين إضافيتين، أضف 200 µL من محلول الحجب (blocking buffer) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة. الآن أضف 200 µL من الجسم المضاد الأولي المطلوب.

نستخدم هنا علامات تعدد القدرات T 4K LF four وSOX two وcmic. تُحضن الخلايا طوال الليل عند 4 °C، وفي اليوم التالي، وبعد غسل الخلايا برفق مرتين باستخدام PBS، تُحضن مع 200 µL من الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، مع حماية الأطباق من الضوء.

نستخدم هنا الأجسام المضادة الثانوية المناسبة والمقترنة بالفلوروفورات من أجل التصوير، وذلك باستخدام مجهر فلوري مقلوب بعد فترة التحضين. اغسل الخلايا مرتين إضافيتين، ثم أضف DPI وحضنها مرة أخرى لمدة 10 دقائق لتصوير النواة. وأخيرًا، بعد الغسلة الأخيرة، أضف antifa aqua mount قبل تصوير الخلايا باستخدام المجهر الفلوري المقلوب لتحديد كفاءة ترنسدكشن.

ابدأ بعملية عزل وتوسيع الخلايا الجذعية متعددة القدرات. بعد بدء عملية إعادة البرمجة، راقب المزارع يومياً واستبدل الوسط المناسب كل 48 ساعة. نستخدم وسطاً مضافاً إليه doxycycline لاستزراع الخلايا خلال الـ 12 يوماً الأولى، ثم نقوم لاحقاً بإزالة doxycycline من الوسط.

يتم اختيار مستعمرات الخلايا الجذعية المحفزة وافرة القدرة (IPS) يدوياً من أجل التوسيع باستخدام الدوكسيسيكلين. يجب مراقبة الخلايا المستقلة يومياً لرصد التغيرات المورفولوجية التي تشير إلى عملية إعادة البرمجة. ستختلف كل تجربة عن الأخرى، ولكن تكون المستعمرات بشكل عام كبيرة بما يكفي للعزل في غضون 16 إلى 22 يوماً بعد تحفيز DS، وذلك في اليوم السابق لبدء عملية عزل مستعمرات إعادة البرمجة ومعالجتها بالتريبسين.

قم بتجهيز لوحة ذات 24 بئراً عن طريق استزراع طبقة مغذية من خلايا mets المعرضة لإشعاع غاما بكثافة 5 × 10⁴ خلية لكل بئر. قم بتحضين الخلايا طوال الليل عند 37 °C و 5% carbon dioxide. وفي اليوم التالي، قم بالتقاط كل مستعمرة IPS يدوياً ومعالجتها بالتريبسين لتفكيك تجمعات الخلايا، ثم أعد زرع خلايا IPS في وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفئران في الآبار الفردية للوحة ذات الـ 24 بئراً التي تم تجهيزها مسبقاً، ثم قم بتحضين الخلايا عند 37 °C و 5% carbon dioxide.

تغيير الوسط الغذائي كل 24 ساعة. مراقبة مستعمرات IPS يومياً للتحقق من النمو وفلورة GFP. قمنا بتحضين المزارع لمدة ستة أيام قبل نقلها إلى أطباق ذات أربع آبار لإجراء تحليل تعدد القدرات.

حدد أي من آبار لوحة الـ 24 wheel تعبر بشكل منتظم عن GFP؛ حيث يمكن نقل الآبار التي تظهر تعبيراً جيداً عن GFP، وتكثيفها، وتمريرها بنسبة 1:8 إلى ألواح ذات أربعة آبار تم تحضيرها مسبقاً بطبقات مغذية من خلايا mes المعرضة لأشعة غاما. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الألواح لإجراء تحليل ICC للتحقق من تعدد القدرات لبدء تحليل تعدد القدرات. اغسل الخلايا بلطف مرتين باستخدام PBS لا يحتوي على أيونات المغنيسيوم أو الكالسيوم.

أضف 0.5 milliliters لكل بئر من 0.2%between 20 في PBS المبرد بالثلج، ثم حضن الخلايا لمدة 10 دقائق. بعد ثلاث غسلات إضافية بـ PBS، قم بحجب الارتباط غير النوعي باستخدام 200 microliters من محلول الحجب (blocking buffer) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. الآن، أضف 200 microliters من الجسم المضاد الأولي المطلوب.

لقد استخدمنا هنا SSEA-1 وNanog وOCT4، ثم حضنّا الخلايا طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وبعد غسل الخلايا بلطف مرتين، يتم تحضينها مع 200 µL من الجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، مع الحفاظ عليها بعيداً عن الضوء. نستخدم هنا الأجسام المضادة الثانوية المناسبة والمقترنة بـ fluorophore من أجل التصوير، وذلك باستخدام مجهر فلوري مقلوب؛ وبعد غسلتين إضافيتين، يتم إضافة DPI وتحضين الخلايا لمدة 10 دقائق.

الآن وبعد إجراء غسلة نهائية، أضف antifa aqua mount قبل تصوير الخلايا باستخدام المجهر الفلوري المقلوب. كما يمكن تحليل مستعمرات IPS للكشف عن نشاط الفوسفاتاز القلوي باستخدام أطقم التحليل المتاحة تجارياً. ويمكن استخدام مجموعة stem gent docs inducible mouse TF lentivirus لإعادة برمجة MES إلى خلايا IPS بعد ترانسدكشن (transduction) لـ MES للتعبير عن عوامل النسخ.

يمكن الكشف عن T four وSOX two وKLF four وseic في الخلايا المعالجة بـ doxycycline، بينما لا يمكن الكشف عن تعبير يذكر أو لا يوجد تعبير على الإطلاق في الخلايا غير المعالجة. ستتقدم التغيرات المورفولوجية بمرور الوقت لتكوين مستعمرات أكبر تشبه الخلايا الجذعية الجنينية (ES cell-like colonies) ذات حواف مستعمرات محددة ونمو ثلاثي الأبعاد. وعند إزالة docs، يحدث تراجع ملحوظ في المورفولوجيا الخلوية لبعض المستعمرات الشبيهة بالخلايا الجذعية الجنينية.

ومع ذلك، حافظت العديد من المستعمرات على مورفولوجيا IPS. وعندما يتم انتقاء هذه المستعمرات من IPS وتمريرها، فإنها تظهر تعبيراً نموذجياً لمؤشرات تعدد القدرات مثل الفوسفاتاز القلوي، وnano T four وSSEA one.

عبرت خلايا الميث المستخدمة في هذه التجربة عن بروتين GFP من موضع nag الداخلي. وبناءً على ذلك، عند إعادة برمجة هذه الخلايا إلى حالة تعدد القدرات، يمكن استخدام تعبير GFP كمؤشر أولي على نجاح عملية إعادة البرمجة. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحفيز إعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية للفأر لإنتاج خلايا جذعية متعددة القدرات باستخدام نظام مضاد للفيروسات قابل للتحفيز بواسطة الدوكسيسيكلين يعتمد على أربعة عوامل نسخ.

عند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر أنه عند تصميم تجارب إعادة البرمجة، يجب مراعاة عدة متغيرات لتحسين كفاءة عملية إعادة البرمجة. أولاً، من الممكن تعديل نسبة الفيروس النشط إلى الخلايا المستهدفة خلال خطوة العدوى الأولية لزيادة أو تقليل كفاءة ترصيف الفيروسات، مما يؤثر بالتالي على عدد الفيروسات المدمجة في مجموعة الخلايا المستهدفة. ثانياً، يمكن أن يؤثر ضبط مدة تعريض الخلايا للمستندات على عدد مستعمرات IPS المتولدة.

ثالثاً، يمكن أن تؤثر القدرة التكاثرية للخلايا المستهدفة على عملية إعادة البرمجة، حيث تكون الخلايا التي تنمو وتنقسم بنشاط أكثر استجابة لإعادة البرمجة. وأخيراً، عند تعديل البروتوكول ليتناسب مع أعداد مختلفة من الخلايا أو أطباق زراعة أنسجة ذات أحجام مختلفة، يوصى بتعديل أعداد الخلايا المستهدفة بشكل تناسبي مع مساحة سطح طبق الزراعة. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.