جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عامل النسخ أربعة ، والدوكسيسيكلين محرض Lentiviral نظام تنبيغ

مرحبا ، اسمي براد هاميلتون. أنا في قسم البحث والتطوير هنا في STEM Gen. سنعرض لكم اليوم إجراء لكيفية توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات من الخلايا الليفية الجنينية للفأر.

يمكن استخدام هذا الإجراء لتوليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ولدراسة عملية إعادة البرمجة. لذلك دعونا نبدأ. ابدأ بزرع الخلايا الليفية الجنينية للفأر ، أو خلايا الميثامفيتامين في طبق مغطى بالجيلاتين بطول 15 سم بكثافة أربعة في 10 من الخلايا الخامسة لكل طبق.

أضف الآن 30 مل من وسط نمو الميثامفيتامين واحتضان الخلايا لمدة يومين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تتماسك بنسبة 80٪ تقريبا. عند الانتهاء ، احتضان استنشاق الوسط وإضافة 30 مل من النمو. متوسط مكمل بفيروس العدسات المركز.

هز الطبق برفق لضمان التوزيع المتساوي للوسط. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع اكتمال نقل الفيروس. دعنا ننتقل إلى إعادة البرمجة المستحثة عن الدوكسيسيكلين.

لبدء إعادة البرمجة من 20 إلى 24 ساعة ، فإن التربسين بعد التنبيغ هو الخلايا المنقولة ويقوم بطردها عند 200 جيجابايت لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بشفط الوسائط بعناية من حبيبات الخلية وأعد تعليق الخلايا في وسط النمو. بمجرد تعليق البذور ، يتم تحويل الميس بتركيز مناسب لحجم طبق زراعة الخلية الذي تستخدمه.

نحن هنا نستخدم 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل طبق 10 سنتيمترات لإعادة برمجة تجارب الكفاءة وعزل مستعمرة IPS ومرتين في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر في أربع ألواح بئر لتجارب الكيمياء المناعية. لمراقبة كفاءة التنبيغ ، احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في هذه المرحلة ، يمكن تجميد الخلايا في النيتروجين السائل لتحليلها في المستقبل إذا لزم الأمر.

في اليوم التالي ، استنشق الوسط واستبدله بوسط نمو جديد تم استكماله بالدوكسيسيكلين إلى تركيز نهائي قدره ميكروغرامين لكل ملليلتر. نقوم بتضمين عنصر تحكم سلبي يحتوي على وسيط بدون دوكسيسيكلين. أخيرا ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

لقد بدأنا عملية إعادة البرمجة. بشكل عام. ستكون مستعمرات الخلايا الجذعية متعددة القدرات كبيرة بما يكفي للعزل بعد 16 إلى 22 يوما.

قبل أن نوضح هذا الإجراء ، نحتاج أولا إلى التحقق من كفاءة التحويل باستخدام الكيمياء لتحديد كفاءة التحويل. يتم إجراء اختبار الكيمياء المناعية على الخلايا المعاد طلاؤها في أربع ألواح بئر بعد 48 ساعة من تحريض الدوكسيسيكلين. يجب ضبط جميع الأحجام المدرجة في هذا البروتوكول وفقا لحجم لوحة زراعة الخلية ، وتبدأ بغسل الخلايا برفق.

بمجرد أن تحتوي PBS على أيونات المغنيسيوم أو الكالسيوم ، قم بإصلاح الخلايا ب 500 ميكرولتر من الألدهيد 4٪ في PBS لمدة 15 دقيقة. في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الخلايا مرة أخرى برفق مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك ، قم بحفر الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من المثلج البارد 0.2٪ Tween 20 في PBS تحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد غسل الخلايا مرتين أخريين. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة. أضف الآن 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي المطلوب.

نحن هنا نستخدم علامات تعدد القدرات T 4K LF أربعة و SOX اثنين و CMIC. احتضان الخلايا طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي. بعد غسل الخلايا برفق مرتين باستخدام PBS ، احتضنها ب 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، مما يحمي الألواح من الضوء.

نحن هنا نستخدم الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المقترنة بالفلورو فور للتصور ، باستخدام مجهر فلوري مقلوب بعد الحضانة. اغسل الخلايا مرتين أخريين ثم أضف DPI واحتضن مرة أخرى لمدة 10 دقائق لتصور النوى. أخيرا ، بعد الغسيل الأخير ، أضف حامل أنتيفا أكوا قبل تصوير الخلايا بالمجهر الفلوري المقلوب لتحديد كفاءة التحويل.

البدء في عزل وتوسيع الخلايا الجذعية متعددة القدرات. بعد بدء عملية إعادة البرمجة ، راقب الثقافات كل يوم واستبدل الوسيط المناسب كل 48 ساعة. نستخدم الدوكسيسيكلين المكملة بوسط لزراعة الخلايا لأول 12 يوما ثم نزيل الدوكسيسيكلين لاحقا من الوسط إلى ذلك.

الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو مستعمرات IPS التي يتم اختيارها يدويا للتوسع هي الدوكسيسيكلين. يجب مراقبة الخلايا المستقلة يوميا بحثا عن التغيرات المورفولوجية التي تدل على عملية إعادة البرمجة. ستكون كل تجربة مختلفة ، لكن المستعمرات بشكل عام كبيرة بما يكفي للعزل بين 16 إلى 22 يوما بعد تحريض DS في اليوم السابق لبدء عملية عزل مستعمرات التربسين المعاد

قم بإعداد صفيحة 24 بئرا عن طريق البذر بطبقة تغذية جاما مشعة من mets بكثافة خمسة في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، اختر يدويا كل مستعمرة IPS وحاول تلطيفها لفصل مجاميع الخلايا التي تعيد خلايا IPS في وسط الخلايا الجذعية الجنينية للفأر في الآبار الفردية للوحة 24 بئر السابقة تحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

تغيير الوسائط كل 24 ساعة. راقب مستعمرات IPS يوميا للنمو وتألق GFP. قمنا باحتضان ثقافاتنا لمدة ستة أيام قبل التعبئة في أربع أطباق بئر لتحليل تعدد القدرات.

حدد الآبار الموجودة في لوحة العجلات 24 التي تعبر بشكل موحد عن آبار GFP التي تحتوي على تعبير جيد عن GFP يمكن أن تتعثر ، وتصفيتها ، وتنتقل من واحد إلى ثمانية إلى أربع ألواح آبار سبقتها طبقات تغذية مشعة جاما من mes. يمكن بعد ذلك استخدام هذه اللوحات لتحليل ICC لتعدد القدرات لبدء تحليل تعدد القدرات. اغسل الخلايا برفق مرتين باستخدام PBS الذي لا يحتوي على أيونات المغنيسيوم أو الكالسيوم.

أضف 0.5 مل لكل بئر من البرد المثلج 0.2٪ بين 20 في PBS واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق. بعد ثلاث غسلات أخرى في كتلة PBS ، ربط غير محدد ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. أضف الآن 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي المطلوب.

هنا استخدمنا SSEA واحد نانوج و OCT أربعة يحتضن الخلايا بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. بعد غسل الخلايا برفق مرتين ، احتضنها ب 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، مع إبعادها عن الضوء. نحن هنا نستخدم الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المقترنة بقوة الفلورو للتصور ، باستخدام مجهر فلوري مقلوب بعد غسلتين أخريين ، وإضافة DPI واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق.

الآن بعد الغسيل النهائي ، أضف حامل أنتيفا أكوا قبل تصوير الخلايا بالمجهر الفلوري المقلوب. يمكن أيضا تحليل مستعمرات IPS لنشاط الفوسفاتيز القلوي باستخدام المجموعات المتاحة تجاريا. يمكن استخدام مجموعة فيروس العدسات TF المحفز للفأر لإعادة برمجة mes إلى خلايا IPS بعد نقل تعبير MES لعوامل النسخ.

يمكن اكتشاف T four و SOX two و KLF four و seic في الخلايا المعالجة بالدوكسيسيكلين ، ولكن يمكن اكتشاف القليل من التعبير أو عدم الكشف عنه في الخلايا غير المعالجة. ستتقدم التغييرات المورفولوجية بمرور الوقت لتوليد مستعمرات أكبر تشبه الخلايا الجذعية الجذعية مع حواف مستعمرة محددة ونمو ثلاثي الأبعاد. عند إزالة المستندات ، هناك ارتداد ملحوظ للتشكل الخلوي لبعض المستعمرات الشبيهة بالخلايا الجذعية الدماغية.

ومع ذلك ، حافظت العديد من المستعمرات على مورفولوجيا IPS الخاصة بها. يتم عرض مستعمرات IPS هذه عند انتقاءها وتمريرها. التعبير النموذجي عن علامة متعددة القدرات للفوسفاتيز القلوي ، نانو تي أربعة و SSEA واحد.

عبر نوع خلايا الميثامفيتامين المستخدمة في هذه التجربة عن GFP من موضع التذمر الداخلي. عند إعادة برمجته إلى حالة تعدد القدرات ، يمكن استخدام تعبير GFP كمؤشر أولي لإعادة البرمجة الناجحة. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحفيز إعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية للفأر للحث على الخلايا الجذعية متعددة القدرات باستخدام نظام مضاد للفيروسات المحفز بأربعة عوامل نسخ دوكسيسيكلين.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه عند تصميم تجارب إعادة البرمجة ، يجب مراعاة العديد من المتغيرات لتحسين كفاءة إعادة البرمجة. أولا ، من الممكن تعديل نسبة الفيروس النشط إلى الخلية المستهدفة أثناء خطوة العدوى الأولية لزيادة أو تقليل كفاءة النقل ، وبالتالي التأثير على عدد الفيروسات المتكاملة في مجموعة الخلايا المستهدفة. ثانيا ، يمكن أن يؤثر ضبط طول الفترة الزمنية التي تتعرض فيها الخلايا للمستندات على عدد مستعمرات IPS التي تم إنشاؤها.

ثالثا ، يمكن أن تؤثر القدرة التكاثرية للخلايا المستهدفة على إعادة البرمجة لأن الخلايا ، التي تنمو بنشاط وتنقسم تكون أكثر قابلية لإعادة البرمجة. أخيرا ، عند تعديل البروتوكول لأرقام الخلايا المختلفة أو أطباق زراعة الأنسجة ذات الأحجام المختلفة ، يوصى بتعديل أعداد الخلايا المستهدفة بشكل متناسب مع مساحة سطح طبق الاستزراع. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.