انقسام اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام : أداة قوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات

يعتمد نظام الميث (myth system) على مفهوم اليوبيكويتين المنقسم، والذي يشير إلى قدرة اليوبيكويتين على الانفصال بشكل مستقر إلى نصفين، أحدهما طرفي نهائي (UBI) والآخر طرفي كربوكسيلي (CUB)، بحيث يكونان قادرين على إعادة التشكل إلى جزيء يوبيكويتين كاذب كامل الطول. وبينما تكون عملية إعادة التشكل هذه تلقائية عند استخدام النوع البري NUBI، فإن إدخال طفرة ISIN 13 إلى الجلايسين، مما ينتج شظية تسمى NUBG، يقلل بشكل كبير من ألفته تجاه CUV، وبالتالي يمنع تكوين اليوبيكويتين الكاذب. وإذا تم دمج NUBG وCUB مع البروتين A والبروتين B على التوالي، وكانت البروتينات A وB قادرة على التفاعل، فعندئذ يمكن تكوين جزيء اليوبيكويتين الكاذب مرة أخرى.

في هذا النظام، تدمج الطعوم الغشائية المدمجة مع جزء CUB المرتبط بعامل نسخ اصطناعي. وبينما تدمج الفرائس مع جزء NUBG، يؤدي التفاعل بين الطعم والفريسة إلى إعادة تشكيل اليوبيكويتين الكاذب، والذي يمكن بدوره أن يتم التعرف عليه بواسطة إنزيمات إزالة اليوبيكويتين السيتوبلازمية الممثلة في شكل مقصات. تقوم هذه الإنزيمات بالقطع بعد الطرف الكربوكسيلي (C terminus) لجزء CUB، مما يؤدي إلى تحرير عامل النسخ، الذي يمكنه بعد ذلك دخول النواة وتنشيط نظام مراسل يسمح بالعزل والتعريف الانتقائي للخلايا التي تحدث فيها تفاعلات الطعم والفريسة.

أهلاً بكم، أنا جاني سنايدر من مختبر Igor STAARs في قسمي الوراثة الجزيئية والكيمياء الحيوية بجامعة تورنتو. سأعرض لكم اليوم إجراءً خاصاً بنظام الهجين الثنائي للغشاء أو M2H، ونحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التفاعلات بين بروتينات الغشاء المدمجة. لذا، لنبدأ الآن.

قبل إجراء تحليل myth، تحقق من أن بروتين الطعم الخاص بك يمتلك طرفه N و/أو طرفه C في سيتوبلازم الخلية. يجب دمج وسم CUB Lex A VP 16 مع البروتين عند هذا الطرف. ونظراً لأن الإنزيمات المزيلة لليوبيكويتين والضرورية لتحرير عامل النسخ تقع في السيتوبلازم، فإذا كانت توبولوجيا بروتين الطعم الخاص بك غير معروفة، يمكنك إنشاء تركيبات موسومة عند كلا الطرفين N و C، وباستخدام اختبار التحكم N-U-B-G-I الموصوف لاحقاً، لمعرفة ما إذا كان أي منهما مناسباً للاستخدام في myth، مما يشير إلى أن طرفاً معيناً هو سيتوبلازمي.

بعد ذلك، حدد أيًا من المتغيرين الرئيسيين لتقنية myth هو المناسب لتجربتك. بالنسبة لبروتينات الخميرة الأصلية، فإن طريقة integrated myth أو immy هي الخيار الأمثل. في Imy تكون Bates مُعلمة داخليًا بوسم CUB Lex a VP 16، مما يبقيها تحت تحكم محفزها الأصلي.

يعد هذا الأمر مفيداً لأن مستوى تعبير النوع البري لـ Bates يساعد في القضاء على المشكلات المرتبطة بفرط تعبير البروتين، مثل زيادة عدد النتائج الإيجابية الكاذبة لبروتينات الخميرة غير الأصلية، ويمكن استخدام traditional myth أو T myth حيث يتم التعبير عن CU B Lex A V VP 16 tag bait بشكل مفرط من بلازميد. سنركز على T myth في هذا البروتوكول لأن هذا الشكل من myth أكثر قابلية للتطبيق على نطاق واسع، وباستثناء بناء الطعم الأولي والوسط المستخدم، يتم تنفيذ كلا شكلي myth بطريقة متطابقة أساساً. يجب استنساخ الطعم في ناقل مناسب لعملية الوسم والتعبير.

تتوفر حاليًا مجموعة متنوعة من ناقلات T myth، مثل BV four و p, a, BV four و PCM BV four، والتي تسمح ببناء البروتينات الموسومة طرفياً بـ c terminally tagged Bates و Beit Cub Lexie و VP 16 تحت تحكم محفزات TF one strong و A DH one و weak CYC one على التوالي. وبمجرد اختيار المؤثر للـ team، يتم إجراء هضم إنزيمي للبلزميد عند موقع التقييد المناسب. ويجب أن يحدث القطع فقط في المنطقة المجاورة مباشرة لوسم CU B Lxe VP 16، إما في الاتجاه العلوي (upstream) للوسم من أجل الوسم الطرفي C، أو في الاتجاه السفلي (downstream) من أجل الوسم الطرفي N.

على سبيل المثال، عند استخدام ناقل PAM BV، يعد SFI one خياراً مثالياً؛ فبعد هضم البلازميد وتخزينه عند درجة حرارة -20 °C حتى يحين موعد استخدامه، تتمثل الخطوة التالية في تصميم بادئات لتضخيم واستنساخ الجين المستهدف. يجب أن يتطابق الطرف '5 للبادئ الأمامي مع ما يقرب من 35 إلى 40 نيوكليوتيد تقع في الاتجاه العلوي من موقع التقييد، بينما يجب أن يتطابق الطرف '3 مع أول 18 إلى 20 نيوكليوتيد من الجين المستهدف، وهو DRB two الذي يشفر مستقبل beta two العام.

في مثالنا، يجب أن يتطابق الطرف الخماسي (5') للبادئ العكسي مع المتممة العكسية لحوالي 35 إلى 40 نيوكليوتيد في اتجاه المصب من موقع التقييد. ومع تطابق الطرف الثلاثي (3') مع المتممة العكسية لآخر 18 إلى 20 نيوكليوتيد من الجين المستهدف مع حذف رمز التوقف إذا كانت علامة CUB Lex say VP 16 توضع عند الطرف الكربوكسيلي (C terminus) كما هو موضح في المثال، وبناءً على ما إذا كان الوسم يتم عند الطرف النيتروجيني (N) أو الكربوكسيلي (C)، تأكد من أن 35 إلى 40 نيوكليوتيد المختارة من تسلسل البلازميد المستخدمة في البادئ الأمامي أو العكسي تؤدي إلى استنساخ الجين المستهدف في إطار القراءة الصحيح مع علامة CUB Lex, a VP 16. وبما أنه في مثالنا سيتم وسم الطرف الكربوكسيلي لبروتين A DRB two.

لقد تم اختيار القواعد الـ 35 لـ A MBV في البادئ العكسي بحيث تقع تسلسلات جين A DRB two وCUB ضمن نفس إطار القراءة، قم بتضخيم الجين المستهدف عن طريق PCR باستخدام البادئات المختارة. ستعتمد معاملات PCR على الإنزيم المحدد والبادئات النوعية المستخدمة لتوفير بيئة يمكن أن يحدث فيها إعادة التركيب المتماثل لإصلاح الفجوة. يتم تحويل البلازميد المهضوم مسبقاً والجين المستهدف المضخم إلى سلالة خميرة مناسبة باستخدام بروتوكول تحويل الخميرة القياسي مثل ذلك الذي وصفه geets وwoods.

بمجرد نمو الخميرة المحولة على الطبق، اختر مستعمرة واحدة من السلالة وقم بتلقيحها في خمسة ملليلتر من وسط SD ناقص الليوسين. يتم إنماء الأوساط السائلة عند 30 درجة مئوية طوال الليل، وبعد نمو المزرعة ليلة كاملة ووصولها إلى مرحلة التشبع، قم بطرد الخلايا مركزياً عند 700 ×g لمدة خمس دقائق ثم أزل الراشح، واستخلص DNA البلازميد الطعم من كتلة الخلايا المترسبة باستخدام أي طقم استخلاص صغير (mini prep kit) تجاري.

اتبع البروتوكول القياسي مع إجراء تعديل واحد لضمان تحلل كافٍ لخلايا الخميرة؛ حيث تضاف خرزات زجاجية من صودا لايم بتركيز 0.5 millimolar إلى الكتلة الخلوية بعد إعادة التعليق الأولية، ثم يتم الرج بقوة باستخدام جهاز الفورتكس لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، استكمل البروتوكول التجاري كالمعتاد. قم بتحويل حمض DNA المستخلص من الخميرة إلى سلالة e coli كيميائية الكفاءة ومناسبة لتكاثر البلازميد، على أن تكون كفاءة التحويل 1×10⁷ خلية لكل microgram DNA على الأقل.

بعد استخلاص الحمض النووي البلازميدي (plasma DNA) من بكتيريا e coli المحولة، تحقق من البناء الصحيح لبلازميد الطعم عن طريق التسلسل قبل الاستخدام؛ ويجب تحليل سلالات الطعم للتأكد من تموضع بروتينات الطعم بشكل صحيح في غشاء الخميرة. يتم تحديد التموضع باستخدام المجهر الفلوري. إن تضمين جزيء YFP في تسلسل وسم الطعم سيتيح التصوير المباشر للخلايا الحية، وهو أمر شائع الاستخدام في imy.

بدلاً من ذلك، يمكن استخدام نهج التألق المناعي القياسي باستخدام جسم مضاد ضد مكونات Lex A أو VP 16 للوسم بعد التحقق من التموضع الصحيح للطعم. ومن الضروري التأكد من أن الطعم لا ينشط ذاتياً، أي أنه لا ينشط نظام المراسل بمفرده أو في وجود فريسة غير متفاعلة؛ ولضمان عدم تنشيط الطعم ذاتياً، نستخدم اختبار N-U-B-G-I. في هذا الاختبار.

يتم تحويل الطعم باستخدام بروتينات صيد موجبة متفاعلة وبروتينات صيد سالبة غير متفاعلة كعناصر تحكم، ثم تُنقط تخفيفات مختلفة من كل مُحوّل على أوساط انتقائية مناسبة. يجب أن ينمو الطعم على الوسط الانتقائي في وجود التحكم الموجب وألا ينمو في وجود التحكم السالب ليكون صالحًا للاستخدام في نظام Yeast Two-Hybrid. وبمجرد التحقق من صحة الطعم، يمكن تحويل سلالة مراسل Yeast Two-Hybrid التي تحتوي على الطعم باستخدام مكتبة صيد ذات صلة للفحص بحثًا عن تفاعلات البروتين-بروتين.

لبدء عملية تحويل الخميرة هذه على نطاق واسع، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من سلالة المراسل myth التي تحتوي على الطعم الخاص بك في 5 mL من وسط SD الخالي من الليوسين، ثم قم بالتحضين طوال الليل عند 30 °C مع الرج. قم بتخفيف المزرعة التي حُضنت طوال الليل في 200 mL من وسط SD الخالي من الليوسين وحضنها عند 30 °C مع الرج حتى تصل قيمة OD 600 إلى 0.6 إلى 0.7. عند الوصول إلى قيمة OD 600 المستهدفة، قم بتقسيم المزرعة ذات الـ 200 mL على أربعة أنابيب طرد مركزي ذات غطاء لولبي سعة 50 mL، ثم قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

بعد غسل الرواسب بالماء المقطر مرتين والمعقم ومحلول الليثيوم أسيتات trissy DTA، نقوم بتعليق كل راسب في 600 µL من محلول الليثيوم أسيتات trissy DTA في كل من أربعة أنابيب طرد مركزي لولبية سعة 15 mL. يتم إضافة 2.5 mL من محلول PEG الليثيوم أسيتات إلى 600 µL من الخلايا المعاد تعليقها، و100 µL من محلول DNA الحيوانات المنوية لسلمون السلمون، و7 µg من DNA مكتبة الفريسة. رُج الأنابيب لمدة دقيقة واحدة لضمان الخلط الجيد، ثم تُحضن في حمام مائي عند درجة حرارة 30 °C لمدة 45 دقيقة.

قم بالخلط لفترة وجيزة كل 15 دقيقة بعد فترة التحضين التي تستغرق 45 دقيقة. أضف 160 µL من ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو DMSO إلى كل أنبوب واخلط فوراً عن طريق قلب الأنابيب. يتم التحضين في حمام مائي عند درجة حرارة 42 °C لمدة 20 دقيقة.

عند اكتمال الصدمة الحرارية، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي ثم أعد تعليقها. علّق كل راسبة في 3 mL من محلول 2X YPD. اجمع جميع العينات معاً في أنبوب طرد مركزي واحد سعة 50 mL ذو غطاء لولبي.

قم بتحضين الخلايا عند 30 °C لمدة 90 دقيقة لاستعادة نشاط الخلايا. قم بطرد الخلايا مركزياً وأعد تعليق الراسب الخلوي في 4.9 mL من كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9% باستخدام 100 µL من الخلايا المعاد تعليقها. قم بإعداد تخفيف تسلسلي بمقدار عشرة أضعاف في كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9% يتراوح من 10x إلى 10,000x، ثم ازرع 100 µL من تخفيفات 100x و 1000x على أوساط انتقائية وحضنها عند 30 °C لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.

تُستخدم هذه الأطباق كمجموعة ضابطة وتُستعمل لحساب كفاءة التحول بشكل متساوٍ. قم بتقسيم الـ 4.8 ملليلتر المتبقية من الخلايا المعلقة وأضفها إلى أطباق كبيرة بقطر 150 مليمتر، ثم حضنها عند درجة حرارة 30 °C لمدة تتراوح من ثلاثة إلى أربعة أيام. وبمجرد نمو المستعمرات، قم بإعادة تعليق مستعمرات منفردة، حيث تمثل كل منها خلايا تحتوي على زوج محتمل من الطعم والفريسة المتفاعلين، في 100 µL من كلوريد الصوديوم بتركيز 0.9%، ثم ازرع حصصاً بحجم 5 µL في أوساط انتقائية تحتوي على XG واتركها لتنمو لمدة تتراوح من يومين إلى أربعة أيام فقط.

يتم اختيار المستعمرات التي تظهر نموًا قويًا ولونًا أزرق لإجراء المزيد من التحاليل. بعد عزل البلازميدات من مستعمرات الخميرة الإيجابية وتسلسلها، يتم تجميع وتحليل جميع بيانات التسلسل لتكوين القائمة الأولية للمتفاعلات. ولإعادة التحقق من هذه التفاعلات، يتم استخدام اختبار الاعتماد على الطعم.

في هذا الاختبار، يتم تحويل جميع بلازميدات الفريسة التي تعبر عن المتفاعلات المحددة مرة أخرى إلى سلالة الطعم الأصلية، وكذلك إلى السلالة التي تحمل طعماً اصطناعياً ضابطاً يتكون من نطاق واحد عبر غشائي مدمج مع CUB Lex وعلامة VP 16؛ ثم تُعاد معلقة المستعمرات المنفردة الناتجة عن عمليات التحويل هذه في 100 µL من الماء المقطر المزدوج المعقم، وتوضع أحجام قدرها 5 µL في نقاط على الأوساط الانتقائية المناسبة مضافاً إليها X sc. ومن الناحية المثالية، يجب اختيار عدة محولات لكل فريسة، كما ينبغي وضع نقاط من كل من الطعم الأصلي والطعم الاصطناعي على نفس الطبق. تُحضن الأطباق لمدة تتراوح بين يومين إلى أربعة أيام عند 30 °C؛ وتعتبر الخميرة التي تحمل الطعم الاصطناعي في فريسة تسبب تنشيط نظام المراسل "منفلتة"، وبناءً عليه تُزال تلك الفريسة المحددة من قائمة المتفاعلات.

يتم تحفيز النمو والتلون بالأزرق في الخميرة التي تحتوي على الطعم (bait) المستهدف ولكن ليس في الطعم الاصطناعي، وهو ما يؤكد وجود تفاعل محدد. أما في حالة عدم نمو الخميرة التي تحمل الفريسة (prey) والطعم المستهدف.

يتم استبعاد هذه الفريسة من قائمة المتفاعلات. وتشكل الفريسات المتبقية القائمة الكاملة للمتفاعلات التي تم تحديدها في مسح الـ myth. عند الانتهاء من إجراء الـ myth، سيكون لديك خريطة تفاعلات منزلية.

تمثل هذه المجموعة تفاعلات مرشحة يجب على الباحث تحليلها بشكل أكبر باستخدام دراسات محددة يتم تحديدها لكل حالة على حدة. ولتقييم الأهمية البيولوجية لكل منها، فقد عرضنا لكم للتو كيفية تنفيذ إجراء تهجين ثنائي الغشاء E أو إجراء myth لتحديد الشركاء المتفاعلين مع البروتين محل الدراسة. وعند تنفيذ إجراء myth، من المهم التحقق من أن الطرف النيتروجيني N أو الطرف الكربوكسيلي C للبروتين محل الدراسة يقع في السيتوبلازم الخاص بالخلية، وتصميم استراتيجية الوسم بناءً على ذلك.

بالإضافة إلى ذلك، من المهم تقييم ما إذا كانت سلالات الطُعم تعبر عن الطُعم بشكل صحيح وما إذا كان الطُعم متمركزاً في مكانه الصحيح. علاوة على ذلك، من المهم إجراء اختبار NUB GI Control، حيث يفيد هذا الاختبار في المساعدة على تحديد شروط الفحص. وأخيراً، تأكد من التحقق بشكل مستقل من جميع التفاعلات التي تكتشفها باستخدام myth.

من شأن اتباع هذه الخطوات البسيطة أن يضمن حصولك على أفضل نتائج ممكنة من هذا الإجراء التجريبي. حسناً، هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.