انقسام اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام : أداة قوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات

يعتمد نظام الأسطورة على مفهوم تقسيم اليوبيكويتين ، والذي يشير إلى قدرة اليوبيكويتين على الفصل بثبات إلى نصفين CUB الطرفيين الطرفيين و UBI و C الطرفيين القادرين على إعادة التكوين إلى جزيء يوبيكويتين زائف كامل الطول. في حين أن إعادة التكوين هذه تلقائية عند استخدام إدخال NUBI من النوع البري ل ISIN 13 إلى طفرة الجلايسين ، فإن إنتاج جزء يسمى NUBG يقلل بشكل كبير من تقاربه مع CUV ، وبالتالي يمنع تكوين اليوبيكويتين الزائف. إذا تم دمج NUBG و CUB مع البروتين A والبروتين B على التوالي و A و B قادرين على التفاعل ، فيمكن تكوين جزيء يوبيكويتين الزائف مرة أخرى.

في الأسطورة ، يتم دمج الطعوم الغشائية المتكاملة للهجوم الذي يتكون من جزء CUB المرتبط بعامل نسخ اصطناعي. بينما يتم دمج المديح في جزء NUBG ، يؤدي التفاعل بين الطعم والفريسة إلى إعادة تكوين اليوبيكويتين الزائف ، والذي بدوره يمكن التعرف عليه عن طريق الإنزيمات العصارية الخلوية في كل مكان الموضحة على أنها مقص. تنشق هذه الإنزيمات بعد الطرف C من CUB الذي يطلق عامل النسخ ، والذي يمكن أن يدخل بعد ذلك إلى نظام المراسل المنشط والمنشط مما يسمح بالعزل الانتقائي وتحديد الخلايا التي تحدث فيها تفاعلات فريسة BA.

مرحبا ، أنا جاني سنايدر من مختبر إيغور ستارز في أقسام علم الوراثة الجزيئية والكيمياء الحيوية في جامعة تورنتو. سأريكم اليوم إجراء لاستخدام الغشاء هجينين أو أسطوريين ، ونستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تفاعلات بروتينات الغشاء المتكاملة. لذلك دعونا نبدأ.

قبل إجراء تحليل الأسطورة ، تحقق من أن بروتين الطعم الخاص بك له نهايته N و / أو C في العصارة الخلوية للخلية. يجب دمج علامة CUB Lex A VP 16 مع البروتين الخاص بك في مثل هذه النهاية. نظرا لأن الإنزيمات الموجودة في كل مكان ضرورية لإطلاق عامل النسخ موجودة في العصارة الخلوية ، إذا لم تكن طوبولوجيا بروتين الطعم الخاص بك معروفة ، فيمكنك إنشاء تركيبات موسومة في كل من نهاية NNC وباستخدام اختبار التحكم N-U-B-G-I الموصوف قريبا ، تحقق مما إذا كان أي منهما مناسبا للاستخدام في الأسطورة ، مما يشير إلى أن نهاية معينة هي خلوية.

بعد ذلك ، حدد أي من النوعين الرئيسيين للأسطورة مناسب لتجربتك. بالنسبة لبروتينات الخميرة الأصلية ، فإن الأسطورة المتكاملة أو الإيمية هي الطريقة المفضلة. في Imy ، تم وضع علامة على Bates داخليا باستخدام علامة CUB Lex a VP 16 ، مما يتركها تحت سيطرة المروج الأصلي.

هذا مفيد لأن مستوى التعبير من النوع البري لبيتس يساعد في القضاء على المشكلات المرتبطة بالإفراط في التعبير عن البروتين ، مثل زيادة عدد الإيجابيات الخاطئة لبروتينات الخميرة غير الأصلية ، أو الأسطورة التقليدية أو أسطورة T حيث يتم التعبير عن طعم علامة CU B Lex A V VP 16 بشكل مفرط بالصدمات الكهربائية موضعيا من البلازميد. سنركز على أسطورة T في هذا البروتوكول نظرا لأن هذا الشكل من الأسطورة قابل للتطبيق على نطاق واسع باستثناء بناء الطعم الأولي والوسائط المستخدمة ، يتم تنفيذ كلا الشكلين من الأسطورة بطريقة متطابقة بشكل أساسي. يجب استنساخ الطعم في متجه مناسب لوضع العلامات والتعبير.

حاليا مجموعة متنوعة من نواقل أسطورة T مثل BV four و p و a و BV four و PCM BV four ، والتي تسمح ببناء b bates ذات العلامات النهائية ، و Beit Cub Lexie ، و VP 16 تحت سيطرة TF قوي جدا ، وواحد قوي A DH واحد ، ومروج CYC واحد ضعيف على التوالي. بمجرد اختيار مستجيب الفريق ، يقوم التقييد بهضم البلازميد في موقع التقييد المناسب. يجب أن يحدث الانقسام فقط في المنطقة المجاورة مباشرة لعلامة CU B Lxe VP 16 في المنبع من العلامة لوضع العلامات الطرفية C أو المجرى للوسم الطرفي N.

على سبيل المثال ، عند استخدام متجه PAM BV ، يعد SFI واحدا خيارا مثاليا ، بعد هضم البلازميد ، وتخزينه عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى يصبح جاهزا للاستخدام ، والخطوة التالية هي تصميم بادئات لتضخيم واستنساخ الجين محل الاهتمام. يجب أن تتطابق الأطراف الأولية الخمسة للبرايمر الأمامي مع ما يقرب من 35 إلى 40 نيوكليوتيد في اتجاه المنبع من موقع التقييد. بينما يجب أن تتطابق النهاية الأولية الثلاثة مع أول 18 إلى 20 نيوكليوتيد من الجين المستهدف ، وهو DRB اثنين يشفران مستقبلات بيتا اثنين ومستقبلات عامة.

في مثالنا ، يجب أن تتطابق النهاية الأولية الخمسة للبرايمر العكسي مع المكمل العكسي لما يقرب من 35 إلى 40 نيوكليوتيد في اتجاه مجرى موقع التقييد. مع مطابقة الطرف الأولي الثلاثة للمكمل العكسي لآخر 18 إلى 20 نيوكليوتيد من الجين المستهدف ، يحذف رمز التوقف إذا كان CUB Lex يقول إن علامة VP 16 يتم وضعها في الطرف C كما هو الحال في المثال الموضح ، اعتمادا على ما إذا كان يتم تنفيذ العلامات الطرفية N أو C ، تأكد من أن 35 إلى 40 نيوكليوتيدات محددة من تسلسل البلازميد المستخدم في التمهيدي الأمامي أو العكسي تؤدي إلى استنساخ الجين المستهدف في إطار باستخدام CU B Lex ، علامة VP 16. نظرا لأنه في مثالنا ، سيتم وضع علامة على محطة C للبروتين A DRB.

تم اختيار الأساس ال 35 لتسلسل A MBV في التمهيدي العكسي بحيث تقع تسلسل الجينات A DRB two و CUB داخل نفس إطار القراءة ، مما يؤدي إلى تضخيم الجين محل الاهتمام بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الاشعال المحددة. ستعتمد معلمات تفاعل البوليميراز المتسلسل على إنزيم معين وبادئات محددة تستخدم لتوفير بيئة يمكن أن يحدث فيها إعادة التركيب المتماثل لإصلاح الفجوة. يتم تحويل البلازميد المهضوم مسبقا والجين المضخم ذي الأهمية إلى سلالة خميرة مناسبة باستخدام بروتوكول تحويل الخميرة القياسي مثل ذلك الموصوف بواسطة geets and woods.

بمجرد أن تنمو الخميرة المحولة على الطبق ، اختر مستعمرة واحدة من السلالة وقم بتلقيحها في خمسة ملليلتر من SD ناقص الليوسين. تنمو الوسائط السائلة عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها بعد أن نمت الثقافة بين عشية وضحاها ووصلت إلى التشبع. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 700 GS كل خمس دقائق وقم بإزالة الحمض النووي لبلازما الطعم المعزول الطافي من حبيبات الخلية باستخدام أي مجموعة تحضير صغيرة تجارية.

اتبع البروتوكول القياسي بتعديل واحد لضمان تحلل خلايا الخميرة الكافي بحجم صغير من 0.5 مللي مولار من حبات زجاج الجير الصودا إلى الحبيبات بعد تعليق الإعادة الأولية والدوامة بقوة لمدة خمس دقائق. ثم تابع البروتوكول التجاري كالمعتاد. قم بتحويل الحمض النووي للخميرة المعزولة إلى سلالة إشريكية قولونية مختصة كيميائيا مناسبة لتكاثر البلازميد بكفاءة تحويل واحدة على الأقل 10 إلى الخلايا السابعة لكل ميكروغرام من الحمض النووي.

بعد حصاد الحمض النووي للبلازما من الإشريكية القولونية المحولة ، تحقق من البناء الصحيح لبلازميد الطعم عن طريق التسلسل قبل استخدام سلالات الطعم يجب تحليلها للتأكد من أن بروتينات الطعم موضعية بشكل صحيح في غشاء الخميرة. يتم تحديد التوطين باستخدام الفحص المجهري الفلوري. سيسمح إدراج جزيء YFP في تسلسل علامة الطعم بالتصور المباشر للخلايا الحية ويستخدم بشكل شائع في imy.

بدلا من ذلك ، يمكن استخدام نهج التألق المناعي القياسي باستخدام الجسم المضاد ضد مكونات Lex A أو VP 16 للعلامة بعد تحديد الموقع المناسب للطعم. من الضروري التأكد من أن الطعم لا يتم تنشيطه ذاتيا IE ، ولا يقوم بتنشيط نظام المراسل بمفرده أو في وجود ثناء غير متفاعل للتأكد من أن الطعم لا يتم تنشيطه ذاتيا ، فإننا نستخدم اختبار N-U-B-G-I. في هذا الاختبار.

يتم تحويل الطعم من خلال الثناء الإيجابي وغير المتفاعل على التحكم السلبي ، ثم يتم رصد تخفيفات مختلفة لكل محول على وسائط انتقائية مناسبة. يجب أن ينمو Abate على وسائط انتقائية في وجود التحكم الإيجابي ولا ينمو في وجود التحكم السلبي من أجل أن يكون مناسبا للاستخدام في الأسطورة. بمجرد التحقق من صحة الطعم ، يمكن تحويل سلالة مراسل الأسطورة التي تحتوي على الطعم بمكتبة فريسة ذات أهمية للكشف عن تفاعلات بروتين البروتين.

لبدء هذا التحول الخميرة على نطاق واسع ، قم بتلقيح مستعمرة واحدة من سلالة مراسل الأسطورة التي تحتوي على الطعم الخاص بك في خمسة ملليلتر من SD مطروحا منه وسائط الليوسين واحتضانها طوال الليل عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز. خفف المزرعة الليلية إلى 200 مل من SD ناقص وسائط الليوسين واحتضانها عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز حتى تصل إلى OD 600 من 0.6 إلى 0.7. عندما يتم الوصول إلى الهدف OD 600 ، قسم ثقافة 200 مل بين أربعة أنابيب طرد مركزي ذات غطاء لولبي سعة 50 مليلتر وحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

بعد غسل الكريات بالماء المقطر المعقم ومحلول DTA ثلاثي أسيتات الليثيوم ، نقوم بتعليق كل حبيبات في 600 ميكرولتر من محلول DTA لأسيتات الليثيوم إلى كل من أربعة أنابيب طرد مركزي لولبية سعة 15 ملليلترا. أضف 2.5 مل من محلول أسيتات الليثيوم PEG ، واثنين من 600 ميكرولتر من الخلايا المعلقة ، و 100 ميكرولتر من محلول الحمض النووي للحيوانات المنوية في السلمون وسبعة ميكروغرامات من الحمض النووي لمكتبة الفريسة أربعة. أرسل رسالة نصية إلى الأنابيب لمدة دقيقة واحدة لضمان الخلط الشامل ثم احتضانها في حمام مائي 30 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.

تخلط لفترة وجيزة كل 15 دقيقة بعد الحضانة لمدة 45 دقيقة. أضف 160 ميكرولترا من ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو DMSO إلى كل أنبوب واخلطه على الفور عن طريق قلب الأنابيب. احتضن في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

عند اكتمال الصدمة الحرارية ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة التحرير. كل من الكريات في ثلاثة ملليلتر من اثنين من X-Y-P-A-D. اسحب جميع العينات معا في أنبوب طرد مركزي واحد بغطاء لولبي سعة 50 مل.

احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة لاستعادة الخلايا. الطرد المركزي للخلايا وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 4.9 مل من كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪ باستخدام 100 ميكرولتر من الخلايا المعلقة. قم بإعداد التخفيف التسلسلي عشرة أضعاف في كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪ يتراوح من 10 × إلى 10 ، 000 × لوح ، 100 ميكرولتر من تخفيف 100 × و 1000 × على وسائط انتقائية واحتضانه عند 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.

تعمل هذه اللوحات كعنصر تحكم وتستخدم لحساب كفاءة التحويل بالتساوي. قسم 4.8 مل المتبقية من الخلايا المعلقة واللوحة على ألواح كبيرة 150 ملم واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. بمجرد نمو المستعمرات ، تقوم المستعمرات المفردة بتعليق كل منها يمثل خلايا تحتوي على زوج فريسة طعم متفاعل محتمل في 100 ميكرولتر من 0.9٪ كلوريد الصوديوم ولوحة خمسة ميكرولتر في وسائط انتقائية تحتوي على XG تسمح بالنمو لمدة يومين إلى أربعة أيام فقط.

يتم اختيار المستعمرات التي تظهر نموا قويا واللون الأزرق لمزيد من التحليل. بعد عزل البلازميدات وتسلسلها من مستعمرات الخميرة الإيجابية ، قم بتجميع وتحليل جميع بيانات التسلسل لتجميع قائمتك الأولية للتفاعلات. لإعادة التحقق من هذه التفاعلات ، يتم استخدام اختبار تبعية الطعم.

في هذا الاختبار ، يتم تحويل جميع بلازما الفريسة التي تعبر عن التفاعلات المحددة مرة أخرى إلى سلالة الطعم الأصلية بالإضافة إلى السلالة التي تؤوي طعما اصطناعيا للتحكم يتكون من مجال غشاء واحد مدمج في CUB Lex ، علامة VP 16 تعيد تعليق المستعمرات الفردية من هذه التحولات في 100 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم بشكل مزدوج وتحديد خمسة أحجام ميكرولتر تحت الوسائط الانتقائية المناسبة بالإضافة إلى X sc. من الناحية المثالية ، يجب اختيار محولات متعددة لكل فريسة ويجب رصد كل من الطعم الأصلي والطعم الاصطناعي على نفس اللوحة. احتضان الصفائح لمدة يومين إلى أربعة أيام عند 30 درجة مئوية الخميرة التي تحمل الطعم الاصطناعي في الفريسة التي تسبب تنشيط نظام المراسل تعتبر مختلطة ويتم إزالة تلك الفريسة المحددة من قائمة المتفاعلات.

الثناء الذي يسبب النمو واللون الأزرق في الخميرة مع الطعم المثير للاهتمام ولكن ليس الطعم الاصطناعي. تأكيد تفاعل معين. ومع ذلك ، فإن الخميرة التي تؤوي الفريسة والطعم الذي يثير اهتمامك لا تنمو.

تتم إزالة هذه الفريسة من قائمة المتفاعلات. يشكل الثناء المتبقي القائمة الكاملة للتفاعلات التي تم تحديدها في شاشة الأسطورة. عند الانتهاء من إجراء الأسطورة ، سيكون لديك خريطة منزلية تفاعلية.

يمثل هذا مجموعة من تفاعلات المرشحين التي يجب على الباحث تحليلها بشكل أكبر باستخدام دراسات محددة يتم تحديدها على أساس كل حالة على حدة. لتقييم الأهمية البيولوجية لكل منها ، أوضحنا لك للتو كيفية تنفيذ إجراء الغشاء E هجين أو أسطوري لتحديد الشركاء المتفاعلين مع البروتين ذي الأهمية. عند تنفيذ إجراء الأسطورة ، من المهم التحقق من أن تكون موضع اهتمامك له نهايته و / أو نهاية C الموجودة في cito للخلية ، وتصميم استراتيجية وضع العلامات وفقا لذلك.

بالإضافة إلى ذلك ، من المهم أن تقيم بعناية أن سلالات الطعم الخاصة بك تعبر بشكل صحيح عن الطعم وأن الطعم موضعي بشكل صحيح. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم إجراء اختبار NUB GI Control لأن هذا مفيد للمساعدة في تحديد ظروف الفحص. أخيرا ، تأكد من التحقق بشكل مستقل من جميع التفاعلات التي تكتشفها باستخدام الأسطورة.

يجب أن يضمن اتباع هذه الخطوات البسيطة حصولك على أفضل النتائج الممكنة من إجراء الأسطورة. حسنا ، هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.