لإنتاج C. ايليجانس الجينات المحورة عبر Recombineering مع galK إختيار ماركر

الهدف العام من التجربة التالية هو توليد الجينات المعدلة وراثيا باستخدام الحمض النووي الجيني للدودة المنقولة في استنساخ مكتبة SMID. يحافظ استخدام الحمض النووي الجيني على جميع عناصر التحكم الأصلية مثل المعززات في ثلاث مناطق UTR رئيسية. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل FO smid إلى سلالة SW 1 0 6 E القولونية للاستفادة من آلية إعادة تركيب لامدا الحمراء المحفزة.

كخطوة ثانية ، يتم إدخال جين GAL K في الموقع المطلوب في FO smid ، والذي يشير إلى الموقع الذي سيتم فيه وضع GFP أو علامة النقر. بعد ذلك ، يتم استبدال جين Gade ب GFP أو TAC عبر إعادة التركيب المتماثل ، متبوعا بالاختيار السلبي باستخدام deoxy galactose من أجل إنشاء الجينات المعدلة. تم الحصول على النتائج التي تظهر أنه يمكن إنشاء هذه الجينات المعدلة وراثيا بسرعة ونجاح بناء على التحقق من إدخال T بواسطة مستعمرة PCR.

مرحبا ، اسمي سفينة الحب. أعمل في مختبر فيشر في جامعة بيتسبرغ. اليوم أعرض تقنية صنع الجينات المعدلة وراثيا أنيقة.

لماذا إعادة الدمج مع GK كعلامة قابلة للتحديد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية لإنشاء Cogan Transgenes هي أننا في هذه التقنية نستخدم الحمض النووي الجيني للجين محل الاهتمام ، وبالتالي نكون قادرين على تغطية جميع العناصر الحاسمة لتنظيم الجينات مثل عناصر التحكم في ثلاث مناطق UTR رئيسية ، ونصوص التوابل البديلة ، والمحفزات البديلة ، والإجابات البعيدة التي قد يتم تفويتها في الأساليب التقليدية القائمة على الاستنساخ القياسي. لذلك دعونا نبدأ.

اطلب استنساخ FO smid للجين محل الاهتمام أو GOI من خدمة الجينات باستخدام Worm Base كدليل. عند اختيار المستنسخة ، نختار تلك التي تحتوي على GOI في وسط التسلسل. قد تكون المستنسخة التي تستبعد الجينات المجاورة مفضلة ، ولكن قد يكون من الصعب العثور على الثقافة.

استنساخ SMID لحكومة الهند في LB يحتوي على 12.5 ميكروغرام لكل مليلتر من الكلورامفينيكول ، يتم إرسال smid في سلالة EPI 300 ويمكن زراعته عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بزراعة 1.5 مل ليلة واحدة من SMID عند 37 درجة مئوية وقم بإعداد الحمض النووي smid بشكل صغير. باستخدام مجموعة إعداد Epicenter SMID ، نتبع البروتوكول البديل الموضح في التعليمات ، والذي يتضمن إضافة مزيج Ribo الأقصر في خطوة سابقة ، حدد تركيز الحمض النووي للبرمجيات الحرة والمفتوحة المصدر.

عادة ما يكون استخدام مجال مقياس الطيف الضوئي منخفضا جدا ولكنه كاف. للتثقيب الكهربائي الناجح. قم بإعداد خلايا SW 1 0 6 ذات كفاءة كهربائية عن طريق زراعة ثقافة خمسة ملليلتر بين عشية وضحاها في وسائط LB عند 32 درجة مئوية في أنبوب غطاء مفاجئ سعة 14 ملليلترا.

في صباح اليوم التالي. تلقيح مليلتر واحد من الثقافة في 100 مل من رطل في قارورة سعة لترين. تنمو SW 1 0 6 بكتيريا إلى OD 600 من 0.6 إلى 0.8.

لا تصدم الحرارة. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 5 ، 000 Gs لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الحبيبات عن طريق دوامة لطيفة في مليلتر واحد من الجلسرين البارد 10٪.

ثم أضف 50 مل من المثلج البارد ، 10٪ الجلسرين. كرر خطوة الغسيل هذه مرة واحدة. أخيرا بيليه SW 1 0 6 عن طريق الطرد المركزي مرة أخرى ، ولا يمكن ل DEC كل شيء باستثناء حوالي 500 ميكرولتر من كل مادة طافية Resus.

الكريات عن طريق تجميد 100 ميكرولتر علي واط في النيتروجين السائل أو على الثلج الجاف وتخزينها على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للتحول. قم بتحويل الحمض النووي للفوسون إلى خلايا SW 1 0 6 ذات كفاءة كهربائية عن طريق استعراض البكتيريا بحوالي 50 نانوغراما من الحمض النووي fos في كوفيت فجوة 0.1 سم باستخدام EOR 25 10 electro perter عند 1 ، 350 فولت. استرجع البكتيريا في مليلتر واحد من LB لمدة ساعة واحدة عند 32 درجة مئوية صفيحة Eloqua على ألواح LB مع الكلورامفينيكول واحتضانها عند 32 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

التحقق من وجود الجين المعني باستخدام مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق زراعة خمسة ملليلتر بين عشية وضحاها في LB مع 12.5 ميكروغرام لكل مليلتر كلورامفينيكول عند 32 درجة مئوية. بعد ذلك عند 0.5 ميكرولتر من المزرعة إلى تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي مع oligos المرافق وزيادة الحضانة الأولية 95 درجة مئوية إلى خمس دقائق لتقطيع البكتيريا قبل التفاعل. أخيرا ، قم بإعداد مخزون الجلسرين للتخزين طويل الأجل لإدخال جين gal K في FO smid الذي يحمل الجين الذي تهمك.

أولا ، قم بإعداد المماسح بالحد الأدنى من ألواح الوسائط التي تحتوي على 0.2٪ جالاكتوز. انظر الجزء المكتوب من هذا البروتوكول للحصول على الوصفة. بعد ذلك ، قم بتضخيم شريط P mod four gal أو k أو g أو P mod four gal K GT.

نحن نستخدم الانصهار أو الذهاب إلى جل. تنقية منتج PCR الناتج. حدد العائد على مادة هلامية أو باستخدام مقياس الطيف الضوئي NanoDrop.

قم بتخزين منتج PCR على أربع درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام ، قم بتلقيح خمسة ملليلتر من الكلورامفينيكول مع SW 1 0 6 خلايا تحتوي على الحمض النووي الحفرة تنمو بين عشية وضحاها عند 32 درجة مئوية. أضف ملليلتر واحد من المزرعة الليلية إلى 100 مل من رطل وكلورامفينيكول. في قارورة سعة لترين تنمو إلى OD من 0.6 إلى 0.8.

يستغرق هذا عادة من ثلاث إلى أربع ساعات أثناء نمو الثقافة. اضبط حمام مائي مهتز على 42 درجة مئوية للتدفئة باستخدام قارورة معقمة سعة 250 مليلتر في الحامل. يعد استخدام حمام مائي مهتز للخطوة التالية أمرا بالغ الأهمية للحصول على كفاءة عالية.

بعد ذلك ، انقل 50 مل من ثقافة SW 1 0 6 إلى قارورة 250 مليلتر وصدمة حرارية عند 42 درجة مئوية و 100 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة بالضبط في حمام الماء المهتز. اترك البكتيريا المتبقية عند 32 درجة مئوية لاستخدامها كعنصر تحكم غير مستحث. قم بتبريد البكتيريا المستحثة وغير المستحثة على الجليد لمدة 10 دقائق.

انقل العينات إلى أنبوبين معقمين للطرد المركزي والحبيبات عند حوالي 5 ، 000 Gs لمدة خمس دقائق. اسكب كل المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من الجلسرين المثلج البارد بنسبة 10٪ عن طريق دوامة لطيفة. أضف 49 مل أخرى من المثلج البارد ، 10٪ الجلسرين.

كرر هذا الغسيل ثم الحبيبات مرة أخرى. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق قلب الأنابيب وإعادة تعليق الحبيبات في كمية صغيرة من السائل المتبقي Eloqua إلى 100 عينات ميكرولتر. جمد على الثلج الجاف واحفظه على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر في اليوم التالي.

موكب كهربائي ، الخلايا المستحثة وغير المستحثة SW 1 0 6 مع 150 نانوغرام من منتج PCR المحضر باستخدام كوفيت فجوة 0.1 سم في حشرجة كهربائية einor 25 طن. ضبط على 1 ، 350 فولت. استعادة البكتيريا في مليلتر واحد من LB في أنبوب فالكون 14 ملليلتر.

احتضان عند 32 درجة مئوية لمدة أربع ساعات ونصف بعد الحضانة بيليه البكتيريا عند 13 ، 200 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية وإعادة تعليقها في M تسعة متوسطة. يرجى الرجوع إلى الجزء المكتوب من هذا البروتوكول للحصول على الوصفة. كرر هذا الغسيل خطوة مرتين.

لإزالة أي وسط غني ، قم بتكسير الخلايا مرة واحدة أكثر من إعادة تعليقها في مليلتر واحد من M تسعة قبل التخفيف التسلسلي للطلاء على المماسح. الحد الأدنى من المتوسط يحتضن من ثلاثة إلى خمسة أيام عند 32 درجة مئوية في حاضنة. كن صبورا لأن الإيجابيات الحقيقية تنمو ببطء على خط مستعمرة على ماكون أجار لتنقية المستعمرة والتحقق من أنها إيجابية GLK.

يجب أن تتحول المستعمرات إلى اللون الوردي الفاتح. اختر مستعمرة واحدة وقم بتلقيح خمسة ملليلتر بالإضافة إلى احتضان ثقافة الكلورامفينيكول بين عشية وضحاها عند 32 درجة مئوية. تأكد من إدخال قفص غال في الموقع المناسب عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام oligos المرافقة.

راجع الجدول الأول في الجزء المكتوب من هذا البروتوكول. بالنسبة لتسلسلات oligo ، أضف 0.5 ميكرولتر من المزرعة إلى تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي وقم بزيادة الحضانة الأولية 95 درجة مئوية إلى خمس دقائق لتكوين البكتيريا. يجب أن يكون حجم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل تصاعديا بسبب وجود جين GAL K.

أخيرا ، قم بإعداد مخزون الجلسرين للتخزين. قم بإعداد المماسح بالحد الأدنى من ألواح الوسائط التي تحتوي على 0.2٪ ديوكسي جالاكتوز أو DOG و 0.2٪ جلسرين. انظر الجزء المكتوب من هذا البروتوكول للحصول على الوصفة. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

قم بتضخيم أجزاء العلامات من PMO أو 4G أو FP أو PBS 1761 أو PBS 1479 باستخدام نفس oligos المستخدمة في الجولة الأولى أو باستخدام GFP أقصر أو اضغط على oligos محددة. إذا كنت تقوم بعمل تركيبات متعددة ، فمن المفيد بشكل خاص استخدام oligos الأقصر حيث يمكن استخدام نفس منتج PCR لجميع التركيبات Gel. قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل وقياس التركيز على مادة هلامية أو باستخدام مقياس الطيف الضوئي ولد خلايا مستحثة وغير مستحثة W 1 0 6 خلايا تحمل SMID مع جين Gale K كما هو موضح سابقا ، وأكلت خلايا SW 1 0 0 المستحثة والناجمة عن unin مع حوالي 100 نانوجرام من منتج PCR باستخدام الأطباء البيطريين Q بفجوة 0.1 سم في EINOR 25 10 ator مجموعة عند 1 ، 350 فولت.

استرجع في مليلتر واحد من الجهد المنخفض في أنبوب غطاء المفاجئة سعة 14 مليلتر واحتضانه في شاكر 32 درجة مئوية لمدة أربع ساعات ونصف. اغسل وخفف الخلايا في M تسعة كما هو موضح سابقا. ضع البكتيريا على المماسح ، والحد الأدنى من الوسط الذي يحتوي على 0.2٪ DOG و 0.2٪ Glycerol يحتضن الصفائح عند 32 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام لتأكيد وجود الإدخال.

استخدام أربع مستعمرات لتلقيح خمسة ملليلتر الثقافات بين عشية وضحاها في LB مع 12.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. يقوم الكلورامفينيكول بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة كما هو موضح سابقا. نحن نستخدم كلا من oligos الخاصة بالنقر في GFP الأقصر والأوليغوس المحيط لإثبات الإدراج الصحيح والموقع الصحيح.

يبلغ GFP حوالي 800 زوج أساسي. TAP حوالي 550 زوجا أساسيا و gal KT هو 1.4. تقوم Kilobases أخيرا بإعداد مخزون الجلسرين للتخزين طويل الأجل.

يعطي تعديل FO smed عن طريق إعادة التجميع نتائج قوية ويتم ملاحظة معدلات نجاح تزيد عن 90٪ في خطوة الاختيار السلبية بشكل روتيني. بالإضافة إلى ذلك ، يستغرق هذا البروتوكول حوالي أسبوعين حتى يكتمل ، مما يجعل تحضير الجينات المعدلة وراثيا سريعا إلى حد ما ، كما أظهر مستعمراتنا ال 48 التي تم تحديدها على لوحات DOG وتستخدم في مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام العلم GFP Oligos ، الذي أدى إلى تضخيم إدراج GFP في هذه التجربة. 47 مستعمرة صحيحة ومستعمرة واحدة لم يتم تعديلها بشكل صحيح ، كما هو موضح أن 48 مستعمرة تم تحديدها على لوحات DOG وتستخدم لمستعمرة PCR باستخدام العلم GFP Oligos ، مما أدى إلى تضخيم إدراج GFP في هذه التجربة.

46 من أصل 48 مستعمرة صحيحة ولم يتم تعديل مستعمرتين بشكل صحيح. أهم نقطة يجب وضعها في الاعتبار أثناء إجراء هذه التجربة هي أن بكتيريا SW 1 0 6 يجب أن تنمو عند 32 درجة مئوية وليس في درجات حرارة أعلى لأن النمو عند درجة حرارة أعلى سيحدد الطفرات ذات الطفرات التي تضعف آلية لامدا الحمراء. لذا حظا سعيدا في تجربتك.