قياس نشاط رابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم في الشبكية بواسطة الماوس Electroporation يزدرع

يصف هذا البروتوكول وسيلة بسيطة وغير مكلفة لقياس نشاط رابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم (أي محسن / المروجين) يعيشون في شبكية العين عن طريق الماوس electroporation ازدراع. موصوفة إعداد الحمض النووي ، وتشريح شبكية العين ، electroporation ، ثقافة يزدرع الشبكية ، وبعد التثبيت التحليل النوعي والكمي.

الهدف العام من هذا الإجراء هو التنقية الكهربائية لغرسات شبكية العين في الفئران باستخدام مراسلي النسخ الفلوري وتحديد مستويات التعبير الخاصة بهم. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل أنسجة شبكية الفئران حديثي الولادة عن طريق التشريح. الخطوة الثانية من الإجراء هي الكهربائي لشبكية العين باستخدام تركيبات مراسل الحمض النووي الفلوري.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي زراعة شبكية العين المثقوبة كهربائيا كغرسات لمدة ثمانية أيام. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في حصاد تخطيط الشبكية وتحديد مستويات التعبير لمراسلي الفلورسنت. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح مستويات التعبير النسبية لتركيبات مراسل المروج المختلفة في شبكية الفأر النامية من خلال x explan electroporation ، متبوعا بتحليل البيانات الكمية.

اسمي جو كوربو وأنا عضو هيئة تدريس في قسم علم الأمراض والمناعة في كلية الطب بجامعة واشنطن في سانت لويس. واليوم سنقدم بروتوكول فيديو يوضح تقنية التثقيب الكهربائي X في شبكية الفئران حديثي الولادة لغرض تحديد نشاط العناصر التنظيمية CYS الخاصة بالمستقبلات الضوئية وإظهار أن هذا البروتوكول سيكون طالبة دراسات عليا من مختبري ، سيندي مونتانا. قم أولا بتعقيم غرفة التثقيب الكهربائي وجميع الأدوات بنسبة 70٪ من الإيثانول استعدادا لجمع العين.

تطهير كل من القفازات وسطح الطاولة بالإيثانول والحفاظ على ظروف معقمة طوال العملية. بعد ذلك ، في ماصة غطاء محرك الأنسجة ، قم بستة ملليلتر من وسط التشريح في طبق بتري معقم 60 ملم ، وثلاثة ملليلتر من الوسط في طبقين معقمين مقاس 35 ملم. بالعودة إلى سطح الطاولة ، قم بتطهير رأس وعنق جرو فأر حديث الولادة بنسبة 70٪ من الإيثانول.

بعد قطع رأس الرأس بسرعة باستخدام المقص ، انقل الرأس إلى طبق معقم 100 ملم ، وقم بقطع فروة الرأس بمقص صغير لفضح العينين تحت مجهر تشريح. باستخدام ملقط منحني ، أخرج العين برفق من المدار ثم ضع العين في طبق 35 ملم يحتوي على تشريح. متوسط. استمر في جمع العيون بحيث يكون هناك ثلاث إلى أربع عيون لكل حصة من الحمض النووي ليتم فتحها كهربائيا ، مع الحفاظ على العينين ووسط التشريح في درجة حرارة الغرفة حتى الانتهاء.

قم بتطهير كل من شفرة الحلاقة وغلاف ماصة نقل البلاستيك المعقمة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم استخدم شفرة الحلاقة لقطع طرف الماصة عاليا بما يكفي بحيث يمكن سحب العين بأكملها. باستخدام الماصة الموسعة ، انقل عين واحدة من الطبق مقاس 35 ملم إلى الطبق 60 ملم تحت مجهر تشريح بقوة عالية. استخدم ملقطا دقيقا لإزالة أي أنسجة مثل العضلات خارج العين والدهون من سطح العين.

ثم قم بإزالة العصب البصري عن طريق الضغط عليه في القاعدة. من أجل عزل شبكية العين ، قم بعمل ثقب صغير في الصلبة عند الحافة ، وتبدو الصلبة والظهارة المصطبغة في الشبكية لامعة بالنسبة لأنسجة الشبكية ، وهي Matt Gray. أدخل شقة واحدة من كلا زوجي الملقط في الحفرة وقم بتمزيق الصلبة و RPE برفق.

تأكد من ترك العدسة في مكانها. استخدم الماصة الموسعة لنقل الشبكية المقطوعة إلى الطبق الثاني الذي يحتوي على وسط مقاس 35 ملم. اجمع كل شبكية العين وقم بتخزينها في حاضنة زراعة الأنسجة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.

حتى يعمل التثقيب الكهربائي في غطاء لزراعة الأنسجة لكل DNA Eloqua المراد تثقيله بالكهرباء ، املأ طبقا معقما مقاس 35 ملم بوسط تشريح وطبقا ثانيا بوسط ثقافة. باستخدام ماصة P 200، اغسل الغرف الموجودة في طبق التثقيب الكهربائي بقطعة معقمة XPB S3 مرات. املأ الغرف بكميات 60 ميكرولتر من الحمض النووي واملأ أي غرف غير مستخدمة ب 60 ميكرولترا من XPBS واحد.

قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بطبق التثقيب الكهربائي وأدخل الإعدادات المناسبة على الكهربائي. استخدم ملقطا دقيقا لإمساك شبكية العين بواسطة العدسة ونقلها إلى غرف التثقيب الكهربائي. وضع ما يصل إلى أربع شبكية في كل حجرة.

رتب شبكية العين بحيث تميل العدسة على القضيب المعدني المتصل بالقطب الموجب. امسح الملقط بين كل غرفة لتجنب انتقال الحمض النووي من غرفة إلى أخرى. بمجرد محاذاة جميع شبكية العين ، اضغط على ابدأ على الكهربائية.

يجب أن تتشكل فقاعات صغيرة على الشريط المعدني المتصل بالقطب السالب. افصل الأقطاب الكهربائية وقم بإيقاف تشغيل الكهرباء باستخدام الملقط. حرك شبكية العين برفق بعيدا عن جدران الغرفة.

انقل شبكية العين من الغرف إلى أطباق 35 ملم تحتوي على وسط تشريح. باستخدام ماصة نقل معقمة، انقل شبكية العين من وسط التشريح إلى أطباق 35 ملم تحتوي على وسط ثقافة. قم بتسمية آبار صفيحة ثقافة معقمة مكونة من ستة آبار واملأ كل بئر بثلاثة ملليلتر من الثقافة. متوسط.

استخدم ملقطا معقما لتعويم مرشحات نواة واتمان المستديرة فوق الوسط في كل بئر بحيث يكون الجانب اللامع من المرشحات متجها لأعلى. بمساعدة منظار التشريح، انقل شبكية واحدة إلى الفلتر باستخدام جانب عدسة ماصة نقل معقمة لأسفل. إذا هبطت شبكية العين بجانب العدسة لأعلى، اسحبها مرة أخرى إلى الماصة وحاول مرة أخرى.

لا تضع أكثر من أربع شبكية في كل بئر واحتفظ بها في قطرات منفصلة. بمجرد وضع شبكية العين في الآبار ، انقل لوحة الثقافة إلى حاضنة زراعة الأنسجة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وتنمو للفترة الزمنية المطلوبة. عادة ما يتم رؤية ثمانية أيام هنا ينتج عن التثقيب الكهربائي الناجح التعبير عن بنية الحمض النووي عبر ربع إلى ثلث سطح الشبكية.

يتم قياس مستويات التألق من خلال مقارنة المناطق المثقبة بالكهرباء بشكل موحد والتي تعبر عن بنية CRE بمناطق خارج شبكية العين ثم تطبيعها للتحكم في تعبير GFP. يتم تحويل المستقبلات الضوئية للقضيب على وجه الخصوص بكفاءة مظهر. فيما يلي نتائج التثقيب الكهربائي حيث يقوم مروجان محددان بقضيب بدفع التعبير عن GFP و DS الأحمر في الطبقة النووية الخارجية.

من خلال تراكب نمطي التعبير مع تلطيخ DPI الموضح هنا باللون الأزرق ، يكون التعبير المحدد لمستقبل الصور واضحا. لم يلاحظ أي تعبير في الطبقة البينية أو طبقة الخلية العقدية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تشريح الزراعة الكهربائية وزراعة نبتلات شبكية الفئران لغرض تحديد نشاط العناصر التنظيمية لكيس الشبكية.

شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.