تطوير الخلايا العصبية والبلاعم في المختبر

ابدأ بالخلايا العصبية العقدية الجذرية الظهرية للفئران المعزولة في وسط النمو.

ضعها في صفيحة متعددة الآبار مطلية بالبوليمر لتعزيز الارتباط العصبي.

بعد ذلك ، خذ فأرا مقطعا للقتل الرحيم وحقن PBS المثلج في تجويفه البريتوني.

قم بتدليك الصفاق برفق لإخراج البلاعم من جدار الصفاق.

اضغط على الفأر لجمع السائل البريتوني ومعالجته بمحلول تحلل لتحلل خلايا الدم الحمراء بشكل انتقائي ، والتي تظهر على أنها ملوثات. جهاز الطرد المركزي وإعادة تعليق الخلايا في وسط ثقافة.

انقل البلاعم إلى ملحق مسامي موجود داخل البئر الذي يحتوي على الخلايا العصبية المستنبتة.

تسمح هذه الثقافة المشتركة للخلايا العصبية والضامة بأن تكون على مقربة.

عالج الزراعة المشتركة باستخدام db-cAMP واحتضانها لتسهيل دخولها إلى الخلايا. هذا ينشط الخلايا العصبية لإفراز جزيئات الإشارات.

تحث جزيئات الإشارات هذه ، جنبا إلى جنب مع db-cAMP ، البلاعم على تبني نمط ظاهري مؤيد للتجدد وإفراز العوامل الأساسية لنمو الخلايا العصبية.

قبل إعداد الثقافة ، قم بتغطية صفيحة مكونة من 6 آبار مسبقا ب poly-D-lysine واللامينين. بعد ذلك ، قم باحتضان الصفيحة المكونة من 6 آبار مع 0.01 بولي دي ليسين عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل. بعد ذلك ، اغسل الطبق مرتين بالماء المقطر.

ثم احتضان اللوحة بمحلول اللامينين بتركيز 3 ميكروغرام لكل مليلتر لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل الطبق مرتين بالماء المقطر ، وجفف الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل.

الآن ، قم بشق الجلد المغطى بالعمود الفقري للفأر القتل الرحيم بشفرة جراحية ، وقم بتشريح العضلات الفقرية بشكل ثنائي لكشف عظام العمود الفقري. قم بإزالة عظام العمود الفقري بدقة باستخدام مدخل جراحي ضيق الرأس حتى يتم الكشف عن DRG بالكامل.

تحت مجهر تشريح ، قم بإزالة DRG بشكل ثنائي من S1 وصولا إلى المستوى C1 باستخدام مقص استئصال القزحية والملقط ذي الرؤوس الدقيقة. انقل DRG إلى أنبوب Eppendorf سعة 1.5 ملليلتر باستخدام طرف ماصة أزرق بنهاية قطع.

بعد ذلك ، قم بإزالة DMEM بعد دوران سريع لعدة ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. أضف 1 مليلتر من DMEM يحتوي على 125 وحدة لكل مليلتر من الكولاجيناز من النوع 11 واحتضان الأنبوب لمدة 90 دقيقة مع دوران لطيف باستخدام لف أو شاكر عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، تخلص من DMEM المحتوي على الكولاجيناز وأضف 1 مليلتر من DMEM الطازج. انقل DRG إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر باستخدام طرف ماصة أزرق بنهاية قطع. بعد ذلك ، قم بتحريك الماصة لأعلى ولأسفل برفق ، على الأقل ، 15 مرة لعمل تعليق خلوي متجانس.

قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 239 جم لمدة ثلاث دقائق وتخلص بعناية من المادة الطافية بالحطام العائم. أضف 1 مليلتر من الوسط العصبي العصبي المكمل ب B27 وأعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل من خمس إلى 10 مرات.

بعد ذلك ، قم بتمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر مغطاة فوق أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. بعد ذلك ، ضع جميع الخلايا العصبية DRG المجمعة على بئرين من الصفيحة المكونة من 6 آبار.

لتحضير البلاعم البريتونية الأولية من فأر بالغ ، قم بشق جلد البطن برفق لكشف الصفاق وتجنب قطع الصفاق لمنع تسرب سائل الغسيل.

بعد ذلك ، قم بثقب الصفاق باستخدام حقنة بإبرة قياس 22 وحقن 10 ملليلتر من PBS المثلج في التجويف البريتوني. قم بتدليك الصفاق بلطف لمدة دقيقة إلى دقيقتين. بعد ذلك ، اسحب الإبرة ، واضغط على PBS من خلال موقع ثقب الإبرة ، واجمع سائل الغسيل في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لسائل الغسيل عند 239 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات المكونات الخلوية. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات ب 3 ملليلتر من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية مرة أخرى عند 239 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا المحببة في 1 مليلتر من وسط B27 العصبي العصبي. صفيحة نصف جميع البلاعم التي تم جمعها على إدراج ثقافة الخلية بمساحة فعالة تبلغ 4.2 سم مربع ، والتي توضع فوق بئر DRG المنفصلة.

بعد أربع ساعات من زراعة البلاعم العصبية المشتركة ، أضف 2 ميكرولتر من محلول AMP دائري 100 ميكرومولار ديسيبل إلى الثقافات المشتركة للبلاعم العصبية. بعد 24 ساعة ، املأ بئرا فارغة ب 1 مليلتر من وسط زراعة البلاعم في نفس الطبق المكون من 6 آبار.

انقل إدراج ثقافة الخلية في الزراعة المشتركة للبلاعم العصبية إلى البئر الفارغ باستخدام وسط زراعة البلاعم.