اختيار وعزل المستعمرات من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة برمجتها من الخلايا الليفية الكبار

في مقال الفيديو هذا ، تتم إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية البالغة لتوليد خلايا جذعية متعددة القدرات باستخدام نواقل الفيروسات القهقرية. أولا ، يتم تحويل الخلايا الليفية البشرية بنواقل الفيروسات القهقرية التي تشفر عوامل النسخ. T ثلاثة أربعة ، SOX اثنين ، KLF أربعة ، و CMIC.

يتم زراعة الخلايا الليفية المصابة على خلايا التغذية الجنينية للفأر لمدة 14 إلى 28 يوما. يتم تلطيخ الثقافات الناتجة بالجسم المضاد TRA 180 1 لتحديد مستعمرات الخلايا المعاد برمجتها. ثم يتم نقل المستعمرات الإيجابية إلى MEF تحتوي على ألواح للتوسع.

يؤكد التلوين الكيميائي المناعي cyto التعبير عن علامات متعددة القدرات وإنشاء خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات. يجب بعد ذلك إجراء دراسات إضافية لتوصيف الخطوط. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في برمجة الخلايا الجسدية ومزارع الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان لأنه من الصعب تحديد مستعمرات IPSC الصحيحة.

توضيح الإجراء من قبل الدكتورة سولا بولاك ما بعد دكتوراه أو زميل من مختبري. ابدأ هذا الإجراء عن طريق طلاء خلايا Phoenix AM FO بكثافة حوالي سبعة إلى 8 ملايين خلية لكل صفيحة 10 سنتيمترات في 10 ملليلتر من ارتفاع الجلوكوز DMEM في الحاضنة والثقافة طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإعداد خلطات التعداء التي تتكون من 12 ميكروغراما من ناقل يشفر إما T ثلاثة أربعة SOX ، واثنين من klf ، وأربعة cmic أو جين GFP و 35 ميكرولتر ، عدد قليل من الجينات ستة في حجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر من مصل الدم الخالي من الجلوكوز العالي DMEM مع L الجلوتامين.

احتضن الخلطات لمدة 20 دقيقة. ثم لنقل خلايا العنقاء ، قم بتقطيع مجمعات الحمض النووي برفق إلى الصفائح التي تحتوي على خلايا العنقاء ، والتي يجب أن تكون متقاربة بنسبة 70 إلى 80٪. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية بعد ست إلى ثماني ساعات.

استنشق الوسط واستبدله بثمانية ملليلتر من نسبة عالية من الجلوكوز DMEM بالمضادات الحيوية. ثم أعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 12 ساعة بعد الحضانة. استخدم ماصة لشفط وجمع الوسط المحتوي على الفيروس.

ثم استبدل الوسيط وكرر هذه العملية كل 12 ساعة حتى يتم جمع الوسط أربع مرات. قم بتخزين الوسط عند أربع درجات مئوية. بمجرد جمع كل الوسيط ، اجمع جميع الأجزاء ، ثم اسكبه من خلال مرشح علوي للأنبوب 0.45 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر لإزالة الخلايا المنفصلة والحطام.

يمكن الاحتفاظ بالوسط المصفى ، الذي يحتوي على جزيئات فيروسية ، في الثلاجة لمدة أسبوعين دون فقدان النشاط المعدي. لا ينصح بالتجميد. في اليوم السابق لإجراء التنبيغ ، قم بإذابة المخزون المجمد من الخلايا الليفية البشرية البالغة وأضف مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر من ستة ألواح مغلفة بالجيلاتين.

في اليوم التالي في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، اجمع بين 3.5 ملليلتر لكل من T four SOX two و klf four و cmic viral medium ، وأضف poly brain إلى التركيز النهائي البالغ ستة ميكروغرام لكل لتر كعنصر تحكم. تحضير مليلتر واحد من الوسط الفيروسي GFP ، وثلاثة ملليلتر من الثقافة ، والدماغ المتوسط والبولي بتركيز نهائي قدره ستة ميكروغرام لكل مليلتر. استنشق الوسط من الصفيحة التي تحتوي على الخلايا الليفية البشرية.

ثم أضف أربعة ملليلتر من الوسائط الفيروسية المختلطة أو جهاز الطرد المركزي المتوسط للتحكم في الألواح عند 1600 جم لمدة ساعة واحدة عند 20 درجة مئوية بعد الطرد المركزي. احتضن الألواح لمدة 12 ساعة تقريبا. ثم استبدل الوسط الفيروسي بوسط ثقافة الخلايا الليفية واحتضنه لمدة 12 ساعة أخرى.

كرر هذه العملية من العدوى إلى المزرعة في وسط الخلايا الليفية ، مرتين إضافيتين بعد آخر عدوى. استزراع الخلايا الليفية في DMEM لمدة 48 ساعة. ثم تحقق من كفاءة إصابة عمليات النقل المتوازية بوسط الفيروسات القهقرية GFP.

بعد ذلك لبدء إعادة البرمجة من الخلايا الجسدية إلى الخلايا متعددة القدرات. يتم زراعة الخلايا الليفية المصابة في وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو الخلايا الليفية أو الخلايا الليفية أو MEFs بكثافة حوالي ضعفين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر من الجيلاتين المعالج. ستة ألواح آبار في وسط نمو الخلايا الليفية في اليوم التالي.

قم بتقسيم الخلايا الليفية البشرية المصابة باستخدام 0.05٪ تريبسن في EDTA وبذرها بكثافة حوالي 1.2 في 10 إلى الرابعة لكل بئر في وسط نمو الخلايا الليفية. في اليوم التالي. استبدل الوسط بوسائط HES التي تحتوي على 0.5 مللي مولار من زبدات الصوديوم للأيام السبعة الأولى من إعادة البرمجة.

قم بتغيير الوسيط يوميا. استبدل الوسائط بوسائط HES بدون زبدات الصوديوم واستمر في إعادة البرمجة لمدة سبعة إلى 21 يوما إضافية. قم بتغيير الوسيط يوميا كل يوم.

افحص الخلايا المنقولة بحثا عن التغيرات المورفولوجية. ستبدأ مستعمرات الخلايا في الظهور بعد حوالي 10 أيام من نقل الخلايا الليفية المنقولة إلى الخلايا المغذية. يشار الآن إلى المستعمرات التي تحتوي على الخلايا المعاد برمجتها باسم الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية أو خلايا IPS البشرية.

ستكون مستعمرات خلايا IPS البشرية جاهزة للعزل في غضون 14 إلى 28 يوما بعد طلاءها على خلايا التغذية MEF. في هذه المرحلة ، يمكن نقل مستعمرات خلايا IPS البشرية إلى ألواح تحتوي على MEF أو مغطاة ب matrigel هنا. يتم عرض النقل إلى الألواح المحتوية على MEF قبل يوم واحد من قطف مستعمرات خلايا IPS البشرية بذرة 24 لوحة بئر تحتوي على خلايا مغذية MEF مشعة جاما في وسط نمو الخلايا الليفية.

احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في اليوم الذي سيتم فيه قطف مستعمرات خلايا IPS البشرية. استنشق وسط نمو الخلايا الليفية من ME Fs واشطفها باستخدام PBS لإزالة أي آثار ل FBS. بعد ذلك ، أضف 0.5 مل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو وسط HES الذي يحتوي على 10 مثبطات صخور ميكرومولار Y 2 7 6 3 2 إلى كل بئر بعد ذلك ، باستخدام مجهر مركب في غطاء تدفق رقائقي ، افحص لوحات إعادة البرمجة لتكوين مستعمرة خلية IPS البشرية.

إذا لزم الأمر ، قم بإزالة الخلايا الليفية المحيطة بمستعمرات خلايا IPS البشرية بإبرة قياس 21. اشطف الألواح باستخدام PBS وأضف وسط HES طازج يحتوي على الجسم المضاد المحدد TRA 180 1 Stain alive. أعد الخلايا إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.

بعد 30 دقيقة ، استبدل الوسط بوسط HES طازج مكمل ب 10 مثبطات صخور ميكرومولار. ثم عرض المستعمرات تحت المجهر الفلورسنت. ضع علامة على TRA من واحد إلى 81 مستعمرة إيجابية.

باستخدام علامة موضوعية باستخدام إبرة قياس 21. قم بقص مستعمرات خلايا IPS البشرية الإيجابية TRA 180 1 إلى عدة قطع صغيرة. بعد ذلك ، باستخدام شظايا نقل الماصة الأوتوماتيكية لمستعمرات خلايا IPS البشرية إلى آبار فردية من لوحة 24 بئر باستخدام ME Fs.

ضع الألواح في الحاضنة واترك مستعمرات خلايا IPS البشرية بالالتصاق لمدة 24 إلى 36 ساعة بتغيير الوسط يوميا. ستكون مستعمرات خلايا IPS البشرية ذات التشكل الصحيح مثل HE مرئية بعد 48 ساعة من النقل الأولي إلى 24 لوحة بئر تمر يدويا بمستعمرات خلايا IPS البشرية كل ستة إلى ثمانية أيام عن طريق قطعها بلوحة إبرة قياس 21. توسيع الثقافات إلى بئر 12 وبعد ذلك على صفيحة من ستة آبار بعد التوسع النسيلي.

وإنشاء خطوط خلايا IPS البشرية تحلل التعبير عن علامات تعدد القدرات TRA one 60 SSEA four و T three و four SOX two و nanog باستخدام الكيمياء المناعية بمجرد إنشاء الخطوط. قد يستلزم التوصيف التفصيلي في المختبر وفي الجسم الحي. تحليل التمايز ، تحليل النمط النووي ، تحليل دراسات مثيلة إسكات الجينات المعدلة ودراسات التعبير الجيني.

التنبيغ الفعال مع وسيط يحتوي على الفيروسات القهقرية أمرا بالغ الأهمية لإعادة البرمجة الناجحة لتحديد فعالية نقل الفيروس. تم تصور الخلايا الليفية البشرية البالغة المشتقة من مريض ترنح فريدريش بعد إصابتين متتاليتين بوسط الفيروس القهقري GFP عندما أصيبت الخلايا الليفية عن طريق حضانة بسيطة بوسط فيروسي ، يتم نقل أقل من 20٪ من الخلايا. ومع ذلك ، عندما أعقبت إضافة وسائط الفيروسات القهقرية GFP على الفور ، زادت كفاءة التنبيغ بشكل كبير.

هنا يتم نقل أكثر من 80٪ من الخلايا لإجراء توصيف أولي لمستعمرات خلايا IPS البشرية المعزولة. تم تقييم التعبير عن علامات تعدد القدرات المميزة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية بواسطة الكيمياء المناعية كما هو موضح هنا. كانت مستعمرات خلايا IPS البشرية المعزولة إيجابية لعلامات تعدد القدرات.

T ثلاثة أربعة SOX اثنان نانو SSEA أربعة و TRA واحد 60 DNA. تم الكشف عن تلطيخ Cos باستخدام DPI الموضح على الألواح العلوية في كل من مستعمرات خلايا IPS البشرية والخلايا المغذية. توضح هذه النتائج أن خلايا IPS البشرية التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول إعادة البرمجة هذا تعبر عن علامات تعدد القدرات المناسبة المميزة للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات غير المتمايزة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية بنجاح إلى خلايا جذعية متعددة القدرات باستخدام معاملة الفيروسات القهقرية المحددة المحفز البشري الصحيح ، ومستعمرات الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، وإجراء التوصيف الأولي لأجهزة الكمبيوتر HI.