تطوير الكمية Recombinase البلمرة التضخيم الفحص مع الرقابة الداخلية إيجابي

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام تبسيط البوليميراز المركب الكمي لتحديد تركيز الحمض النووي للعينات غير المعروفة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إضافة التحكم الإيجابي الداخلي للحمض النووي المستهدف أولا ، وبادئات الحمض النووي والمجسات المصنفة بالفلورسنت إلى التفاعل. كخطوة ثانية ، يتم وضع التفاعلات في جهاز PCR في الوقت الفعلي ، والذي يقوم بتسخين التفاعلات لتنشيط الإنزيمات ويراقب مضان المجسات للكشف عن توليد مكبرات الصوت المستهدفة والتحكم.

بعد ذلك ، يتم تحليل بيانات الفلورسنت باستخدام برنامج نصي لإنشاء المنحنى القياسي والتحقق من صحة الفحص. تظهر النتائج أنه يمكن قياس عينات الحمض النووي بدقة ضمن ترتيب واحد من حيث الحجم للتركيز الصحيح بناء على تجارب التحقق المستخدمة لتحديد الحمض النووي المستهدف لفيروس نقص المناعة البشرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ، هي أن RPA متساوي الحرارة ، لذلك ليست هناك حاجة إلى جهاز تدوير حراري باهظ الثمن.

تتطلب تقنية RPA أيضا تضخيما أقل لدرجة الحرارة ، وتتحمل العينات المتسخة ، وتضخم الهدف إلى مستويات يمكن اكتشافها في غضون دقائق ، وتستخدم إنزيمات lly للسماح بسهولة النقل والتخزين في درجة حرارة الغرفة. للبدء في تنظيف جميع أسطح الطاولة والمعدات بمحلول مبيض بنسبة 50٪ لإنشاء مساحة عمل نظيفة للتضخيم المسبق ، قم بإزالة محلول أسيتات المغنيسيوم 280 مللي مولار ، ومخزن الجفاف ، وكريات التفاعل من الفريزر تحت الصفر 20 درجة مئوية وإذابة المحاليل في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتجميع مزيج رئيسي عن طريق نقل 383.5 ميكرولتر من مخزن الجفاف إلى أنبوب جديد من الصخور الدقيقة عند 41.6 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى المخزن المؤقت والدوامة لخلط 35 ميكرولتر من أسيتات المغنيسيوم إلى أنبوب منفصل.

أعد أسيتات المغنيسيوم في محاليل مخزون المخزن المؤقت لمعالجة الجفاف إلى الفريزر. ثم احصل على البرايمر وprob quas من الثلاجة أربع درجات مئوية. ضعها في مساحة عمل التضخيم المسبق وأطفئ الأضواء لتقليل التعرض للضوء عند 27.3 ميكرولتر من كل من 10 ميكرومولار أولية للأمام والعكسية إلى المزيج الرئيسي.

التالي عند 7.8 ميكرولتر من 10 ميكرومولار عرافة تسمى HIV 1D NA. التحقيق في المزيج الرئيسي ودوامة الأنبوب. ثم قم بإرجاع حلول مخزون المسبار التمهيدي إلى كواشف التخزين للتحكم الإيجابي الداخلي يمكن إضافتها هنا كما هو موضح في بروتوكول النص لتجميع تفاعلات QRPA. ضع أولا كريات الإنزيم المجففة بالتجميد في أنبوبين فرديين من ماصتين منخفضتي الارتفاع بثمانية آبار من شرائط أنبوب PCR 37.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في أنبوب يحتوي على حبيبات.

حرك محتويات الأنبوب برفق باستخدام طرف الماصة لإذابة الحبيبات دون تكوين فقاعات. قم بإزالة الطرف من التفاعل بعناية لمنع فقدان الحجم والتأكد من تغيير أطراف الماصة بين كل أنبوب. انقل الأنابيب إلى كتلة باردة مبردة 96 جيدا لمدة خمس دقائق على الأقل لتبريد المزيج الرئيسي.

في غضون ذلك ، قم بتحميل برنامج التدوير الحراري بالبروتوكول ويشار إلى تخطيط اللوحة في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بقص شريطين من المواد اللاصقة البلاستيكية الشفافة بحيث تكون أعرض قليلا من أنابيب PCR. واحصل أيضا على غطاءين شريطيين مسطحين لأنبوب PCR ، مع إضافة قالب البلازميد الأول لفيروس نقص المناعة البشرية كما هو موضح في بروتوكول النص.

ثم أضف 10 ميكرولتر من القالب إلى أنبوب PCR المناسب. مرة أخرى ، حرك المزيج برفق باستخدام طرف الماصة. بعد ذلك ، أضف 2.5 ميكرولتر من أسيتات المغنيسيوم إلى كل غطاء أنبوب ، ثم ضع الأغطية برفق فوق أنابيب التفاعل حتى لا تكون مغلقة تماما.

يجب أن يكون أسيتات المغنيسيوم مرئيا بوضوح من خلال الغطاء. ضع شرائط أنبوب PCR في جهاز طرد مركزي دقيق وقم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 10 ثوان لتجميع كل السائل الموجود في قاع الأنبوب وإزالة أي فقاعات. يؤدي الجمع بين محلول أسيتات المغنيسيوم والمزيج الرئيسي إلى بدء تفاعل QRPA.

قم بإزالة أنابيب PCR بسرعة إلى الكتلة الباردة لوقف التفاعل. بعد ذلك ، قم بإزالة الأغطية ببطء لمنع تلويث التفاعلات وإغلاق الأنابيب بغشاء ختم دقيق شفاف. انقل الأنابيب إلى جهاز التدوير الحراري وفقا للمواقع الموجودة في تخطيط اللوحة.

أغلق غطاء جهاز التدوير الحراري وانقر فوق بدء التشغيل. تأكد من تعيين اسم ملف للتجربة عند انتهاء التشغيل. اعرض بيانات التألق الأولية وقم بتصديرها إلى جدول بيانات يقوم بإنشاء ملف يسمى نتائج تضخيم القياس الكمي.

لبناء المنحنى القياسي. أولا ، قم بتنزيل البرنامج النصي للمنحنى القياسي ، ثم افتح MATLAB أو برنامج تحليل بيانات مشابه. افتح البرنامج النصي واضغط على تشغيل لتشغيل البرنامج النصي.

اكتب عدد ملفات البيانات المراد تحليلها عند مطالبتك بذلك. بعد ذلك، اكتب عدد العينات وعدد النسخ المتماثلة في كل ملف تدريب. في نافذة الأوامر.

اكتب أقل تركيز للحمض النووي في 10 نسخ قائمة على السجل تم استخدامها لبناء المنحنى القياسي واضغط على Enter. في المثال هنا. أقل تركيز هو سجل واحد على أساس 10 نسخ.

ثم اكتب الفرق في التركيز بين كل معيار DNA في موجه الأوامر واضغط على Enter هنا. الفاصل الزمني للتركيز هو سجل واحد يعتمد على 10 نسخ. بعد ذلك ، أدخل قيمة عتبة الميل في نافذة الأوامر واضغط على Enter.

عادة ما تكون هذه القيمة بين ثلاثة وخمسة. اكتب عدد الانحرافات المعيارية فوق الخلفية للحد الموجب، المعروف أيضا باسم Z، ثم اضغط على إدخال قيم Z النموذجية التي تتراوح من واحد إلى خمسة. بعد ذلك، حدد المعدات التي تم استخدامها لجمع البيانات في هذه الحالة.

اكتب واحدا للدورة الحرارية ، ثم اضغط على Enter. إذا كان هناك عنصر تحكم إيجابي داخلي، فحدد القيمة الافتراضية أو قيمة جديدة للحد عن طريق كتابة Y أو N استنادا إلى ما إذا كان الحد الجديد ضروريا أم لا. أخيرا ، حدد جميع ملفات جداول البيانات التي سيتم استخدامها لإنشاء المنحنى القياسي.

سيقوم البرنامج النصي بعد ذلك باستيراد جميع البيانات وتحليلها تلقائيا. تم إجراء QRPA في الوقت الفعلي على عينات مكررة تحتوي على أرقام نسخ مختلفة من فيروس نقص المناعة البشرية 1D NA. يحدث بداية التضخيم القابل للاكتشاف المشار إليه بزيادة التألق في وقت مبكر للعينات ذات أرقام نسخ الحمض النووي الأعلى مقارنة بالعينات ذات أرقام النسخ الأقل. تم استخدام بيانات التألق الخام لتوليد منحنى قياسي من تضخيم التركيزات المعروفة لفيروس نقص المناعة البشرية 1D NA. كانت هذه البيانات مناسبة لمنحنى أسي ، وتشير قيمة R التربيعية إلى جودة عالية في الملاءمة.

تم استخدام المنحنى القياسي للتنبؤ بتركيزات عينات الحمض النووي الإضافية ذات التركيز المعروف. يسمح ضبط قيمة Z إلى واحد بالتنبؤ الدقيق بتركيزات الحمض النووي المنخفضة. في المقابل ، من الأفضل التنبؤ بتركيزات الحمض النووي العالية بقيمة Z خمسة.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن RPA يفتقر إلى الدورات الحقيقية للحد من معدل تضخيم الحمض النووي. لذلك يجب التحكم في معدل التضخيم بدقة. يعد الاتساق بين التجارب أمرا بالغ الأهمية ، لذا تأكد من استخدام نفس الحصص التمهيدية لجميع التجارب.

حماية مكونات التفاعل من الحرارة والضوء. أضف أسيتات المغنيسيوم مباشرة قبل بدء جمع البيانات ، واحتفظ بالتفاعلات في الكتلة الباردة حتى البداية. التجربة.