نظام مبسط لMechanosensing تقييم خلية وDurotaxis في المختبر

تهاجر العديد من خلايا الثدييات بشكل تفضيلي نحو مصفوفة أو ركيزة أكثر صلابة من خلال التاكسي الجافي. الهدف من هذا البروتوكول هو توفير نظام مختبري بسيط يمكن استخدامه لدراسة سلوكيات التاكسي الخلوي ومعالجتها من خلال دمج ركائز polydimethylsiloxane (PDMS) ذات الصلابة المحددة ، والتفاعل مع أغطية زجاجية.

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير نظام مبسط لتحليل الخلية الجامدة التي من خلالها تهاجر العديد من خلايا الثدييات بشكل تفضيلي نحو ركيزة أكثر صلابة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير ركائز البولي ميثيل سوبوكسان أو PDMS ذات الصلابة المحددة. بعد ذلك ، يتم سكب PDMS المحضر في كل بئر من ستة ألواح آبار وتتم إزالة أي فقاعات هواء.

ثم يتم الانتهاء من غرف Durex عن طريق وضع زلة غطاء معقمة أعلى PDMS في كل بئر لإنشاء تراكب. الخطوة الأخيرة هي زرع الخلايا في غرف Duro Taxes بكثافة تمنح الخلايا مساحة كافية للهجرة دون تفاعلات كبيرة مع الخلايا الأخرى. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري للخلايا الحية لدراسة axxis في الخلايا المهاجرة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل بولي أكريلاميد ، هي أن هناك خطوة واحدة بين PDMS الناعم والزجاج الصلب بدلا من بدائل الهلام المتدرجة. كما أن طلاء PDMS بمصفوفة خارج الخلية لا تتطلب مكونات مثل الفبرونيكتين ربطا كيميائيا متقاطعا ، وهو أمر مطلوب للمواد الهلامية بولي أكريلاميد. لتحضير صفيحة واحدة لزراعة الأنسجة بستة آبار أولا ، قم بتمزيق الميزان بأنبوب مخروطي سعة 50 مل.

قم بوزن ما يقرب من 10 جرامات من محلول بولي ثنائي ميثيل سوبوكسان أو PDMS الأساسي في أنبوب 50 ملليلتر. للحصول على ركيزة 90 إلى واحدة ، اقسم الوزن المقاس لمحلول قاعدة PDMS على 90. لتحديد الكمية الصحيحة من محلول الربط المتقاطع المطلوب ، أضف الكمية المحسوبة من محلول الربط المتشابك PDMS إلى خليط الربط المتشابك الأساسي A-P-D-M-S المختلط بقوة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

باستخدام ملعقة صغيرة في هذه المرحلة ، سيحتوي الخليط على عدد صغير من فقاعات الهواء. جهاز الطرد المركزي ركيزة PDMS في جهاز طرد مركزي على الطاولة لمدة خمس دقائق عند 50 مرة. G- أضف درجة حرارة الغرفة لإزالة الفقاعات إذا كانت لا تزال هناك فقاعات.

بعد ال خمسة دقائق طرد مركزي ثانية ماصة واحدة [ملليتر] من ال 90 إلى واحدة [بدمس] ركيزة داخل كل بئر من الأنسجة ثقافة يعالج. ستة ألواح بئر. يمكن التخلص من أي فقاعات هواء متبقية موجودة في PDMS في هذه المرحلة عن طريق فرقعتها بإبرة قياس 21.

اترك PDMS ينتشر لمدة 30 دقيقة في البئر. بعد ذلك قم بغلي زجاج 12 ملم رقم واحد ، وقم بتغطية الغطاء في الماء المقطر لمدة خمس دقائق ، أي ما مجموعه ثلاث مرات. ضع غطاء مجفف واحد في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة عن طريق لمس جانب واحد من الغطاء برفق.

انزلق إلى محلول PDMS ثم قم بإسقاط زلة الغطاء على نظام إدارة المفاتيح الرقمية. عندما يستقر زلة الغطاء ، سيبدأ نظام إدارة الغطاء في التعدي على حواف زلة الغطاء ، لكنه لن يغطيها بالكامل. سيؤدي هذا إلى إنشاء واجهة بين PDMS والزجاج بعد المعالجة.

احتضان الطبق على حرارة 70 درجة مئوية في فرن لمدة 16 ساعة لعلاج PDMS. أخيرا ، ضع اللوحة في غطاء مزرعة الخلايا وقم بتعقيمها بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق. قم بتغطية كل حجرة durox بملليلتر واحد من الفيبرونيكتين في محلول ملحي مخزن بالفوسفات بدون كالسيوم ومغنيسيوم لمدة ساعة واحدة عند 30 درجة مئوية.

تأكد من غمر السطح بالكامل في محلول الفيبرونيكتين في محلول PBS. قم بإعداد ألبومين مصل الأبقار 1٪ أو BSA بوزن 0.5 جرام BSA وإذابته في 50 مل من مرشح PBS. عقم المحلول من خلال مرشح نقطة 22 ميكرون قبل التسخين عند 80 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بشفط محلول الفبرونيكتين واغسل الغرف ثلاث مرات باستخدام PBS. أضف ملليلترا واحدا من BSA المشوه بالحرارة في PBS إلى كل بئر واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وعيون التربسين ، واحسب الخلايا المفضلة بينما تحجب غرف الدوركس بالحرارة. ينفط BSA المشوه محلول BSA من الغرف قبل خلايا الطلاء مباشرة.

لوحة 10 ، 000 خلية بحجم ملليلترين في كل بئر من غرفة doax. باستخدام الوسيط المطلوب لنوع الخلية المعين الذي تختاره ، اسمح للخلايا بالالتصاق والانتشار على الركيزة لمدة أربع ساعات في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، قم بإجراء تصوير الخلايا الحية على مجهر مقلوب باستخدام تباين الطور مع هدف 10 ×. يجب أن يكون المجهر مزودا بغرفة مرطبة بيئية مغلقة ، مما يسمح بالتحكم في درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون أثناء التصوير على المدى الطويل.

التصوير ، بعد انتشار الخلايا لمدة 3.5 ساعة تقريبا ، قم بتجميع اللوحة في غرفة المجهر. اترك العينات تتوازن في الغرفة لمدة 30 دقيقة. قم بإعداد زيارة تلقائية متعددة النقاط على المجهر إن وجدت.

ركز على الواجهة بين PDMS وانزلاق الغطاء الزجاجي واختر نقاطا للتصوير في جميع أنحاء الواجهة. بمتوسط 40 نقطة لكل صورة غرفة Durex ، ستظهر الخلايا كل 10 دقائق لمدة تصل إلى 16 ساعة ، ستظهر منطقة الاهتمام كسطرين مع الخط الخارجي المقابل لحافة زلة الغطاء والخط الداخلي المقابل للواجهة الفعلية بين PDMS وقلة الغطاء. لتحليل البيانات، قم بإنشاء جدول بيانات مثل الجدول المعروض في بروتوكول النص.

احسب عدد أحداث العبور من نظام إدارة الرسومات الرقمي إلى السطح الزجاجي والعكس صحيح من كل فيلم تم إنشاؤه. يتم تعريف حدث العبور على أنه نواة الخلية التي تمر عبر الحدود بين PDMS والزجاج في أي من الاتجاهين. سجل عدد أحداث العبور في العمود المناسب في جدول بيانات Excel لتحديد المعابر المتعددة.

احسب عدد المرات التي عبرت فيها الخلية الواجهة. يجب تسجيل هذا الرقم في عمود Excel المقابل للركيزة التي توجد عليها الخلية في نهاية الفيلم. كرر التحليل لكل خلية تعبر الواجهة في الفيلم.

استبعاد الخلايا التي تنتقل خارج مجال العرض أثناء التصوير. احسب النسبة المئوية للخلايا التي هاجرت من PDMS إلى السطح الزجاجي وبالتالي خضعت لدورو تكساس. للقيام بذلك.

أضف عدد أحداث العبور من الناعم إلى الصعب وأحداث العبور المتعددة التي انتهت على الثابت واقسمها على إجمالي عدد أحداث العبور. احسب النسبة المئوية للمعابر المتعددة بقسمة إجمالي المعابر المتعددة على العدد الإجمالي للمعابر للبدء في فهم الآلية الجزيئية التي تتوافق بها الخلايا مع الإشارات الميكانيكية في بيئتها. يمكن هدم بروتينات معينة باستخدام IRNA كما هو موضح هنا.

حوالي 70٪ من الخلايا المعالجة بالضوابط أظهرت axxis. في تناقض صارخ ، عندما تم هدم فجوة القرص المضغوط باستخدام الحمض النووي الريبي ، لم يكن للخلايا أي تفضيل فيما إذا كانت قد هاجرت إلى الركيزة الصلبة أو الناعمة. علاوة على ذلك ، عبرت خلايا الضربة القاضية لفجوة CD الحدود المضاعفة.

في حين أن التحكم في الخلايا المعالجة إيرنا عموما تعبر الحدود مرة واحدة فقط المسارات التمثيلية للسيطرة. تظهر خلايا إيرنا أن الخلايا تهاجر بشكل عام عبر الحدود مرة واحدة وتبقى بشكل تفضيلي على السطح الأكثر صلابة مقارنة بفجوة القرص المضغوط. عالجت إيرنا الخلايا التي لم تظهر تفضيلا لأي من الصلابة وتعبر الحدود عدة مرات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير ركائز PDMS وتجميع غرف duris وتحديد ضرائب DUR.