نظام مبسط لMechanosensing تقييم خلية وDurotaxis

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير نظام مبسط لتحليل صلابة الخلايا، حيث تهاجر العديد من الخلايا الثديية تفضيلياً نحو الركائز الأكثر صلابة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضير ركائز من البولي ميثيل سيلوكسان (Polymethyl siloxane) أو PDMS ذات صلابة محددة. بعد ذلك، يتم صب PDMS المحضر في كل بئر من أطباق الزراعة ذات الستة آبار، مع إزالة أي فقاعات هوائية.

يتم بعد ذلك استكمال غرف Durex بوضع شريحة غطاء معقمة فوق الـ PDMS في كل بئر لإنشاء طبقة تغطية. وتتمثل الخطوة النهائية في استزراع الخلايا داخل غرف Duro taxes بكثافة تمنح الخلايا مساحة كافية للهجرة دون حدوث تفاعلات كبيرة مع الخلايا الأخرى. وفي النهاية، يُستخدم مجهر الخلايا الحية لدراسة axxis في الخلايا المهاجرة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل بولي أكريلاميد، في وجود خطوة واحدة فقط بين مادة PDMS اللينة والزجاج الصلب بدلاً من بدائل الهلام المتدرج. كما أن طلاء PDMS بمكونات المصفوفة خارج الخلية مثل fibronectin لا يتطلب ربطاً كيميائياً متقاطعاً، وهو أمر ضروري لهلامات بولي أكريلاميد. لتحضير لوح زراعة أنسجة واحد بستة آبار، قم أولاً بمعايرة الميزان باستخدام أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter.

زن حوالي 10 جرام من محلول قاعدة بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) في أنبوب سعة 50 ملليلتر. وللحصول على ركيزة بنسبة 90 إلى 1، اقسم الوزن المقاس من محلول قاعدة PDMS على 90. ولتحديد الكمية الصحيحة المطلوبة من محلول عامل الربط التشابكي، أضف الكمية المحسوبة من محلول PDMS crosslinker إلى الأنبوب، ثم اخلط مزيج قاعدة PDMS وعامل الربط التشابكي بقوة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

عند استخدام ملعقة صغيرة في هذه المرحلة، سيحتوي الخليط على عدد قليل من فقاعات الهواء. قم بطرد ركيزة PDMS مركزياً في جهاز طرد مركزي مكتبي لمدة خمس دقائق عند 50 ×g. اترك الخليط في درجة حرارة الغرفة لإزالة الفقاعات في حال استمرار وجودها.

بعد مرور خمس دقائق، قم بالطرد المركزي مرة أخرى، ثم انقل 1 mL من ركيزة PDMS بنسبة 90:1 إلى كل بئر من آبار طبق زراعة الأنسجة المكون من ستة آبار. ويمكن في هذه المرحلة التخلص من أي فقاعات هواء متبقية في الـ PDMS عن طريق تفجيرها باستخدام إبرة قياس 21 gauge.

اترك الـ PDMS يتوزع لمدة 30 دقيقة في البئر. بعد ذلك، اغلي شرائح زجاجية غطائية رقم 1 بقطر 12 مليمتر في ماء مقطر لمدة خمس دقائق، لثلاث مرات إجمالاً. ضع شريحة غطائية جافة واحدة في كل بئر من أطباق زراعة الأنسجة عن طريق لمس أحد جانبي الغطاء برفق.

اغمر شريحة الغطاء في محلول PDMS ثم أسقطها فوق الـ PDMS. ومع استقرار شريحة الغطاء، سيبدأ الـ PDMS في الزحف فوق حواف الشريحة، لكنه لن يغطيها بالكامل. سيؤدي ذلك إلى تكوين واجهة بين الـ PDMS والزجاج بعد عملية المعالجة.

قم بتحضين الطبق عند 70 °C في فرن لمدة 16 ساعة لمعالجة الـ PDMS. وأخيراً، ضع الطبق في غطاء زراعة الخلايا وقم بتعقيمه باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 10 دقائق. قم بطلاء كل غرفة durox بـ 1 mL من الفبرونكتين في محلول ملحي منظم بالفوسفات خالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة ساعة واحدة عند 30 °C.

تأكد من غمر السطح بالكامل في محلول الفبرونكتين (fibronectin) في محلول PBS. قم بتحضير ألبومين المصل البقري (BSA) بنسبة 1% المعالج حرارياً عن طريق وزن 0.5 جرام من BSA وإذابته في 50 ميليلتر من محلول PBS المرشح. قم بتعقيم المحلول باستخدام مرشح بمسامية 0.22 ميكرون قبل التسخين عند 80 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة.

بعد ذلك، يتم سحب محلول الفبرونيكتين وغسل الحجرات ثلاث مرات باستخدام PBS. أضف 1 mL من BSA المسخن والممسوخ في PBS إلى كل بئر، والتحضين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم استخدم التريبسين لفك الالتصاق، وقم بعد الخلايا المختارة بينما يتم حجب الحجرات باستخدام BSA المسخن والممسوخ. يتم سحب محلول BSA من الحجرات مباشرة قبل زراعة الخلايا.

قم بتوزيع 10,000 خلية في حجم قدره 2 mL في كل بئر من آبار غرفة doax. وباستخدام الوسط الغذائي المطلوب لنوع الخلايا المحدد، اترك الخلايا لتلتصق وتنتشر على الركيزة لمدة 4 ساعات في حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 °C مع 5%CO2، ثم قم بإجراء تصوير حي للخلايا باستخدام مجهر مقلوب بتقنية تباين الطور وعدسة شيئية بقوة 10x. يجب أن يكون المجهر مزودًا بغرفة بيئية رطبة ومغلقة، مما يسمح بالتحكم في درجة الحرارة عند 37 °C و5%CO2 أثناء التصوير طويل الأمد.

بالنسبة للتصوير، بعد انتشار الخلايا لمدة 3.5 hours تقريباً، قم بتركيب الطبق في حجرة المجهر. اترك العينات لتتوازن في الحجرة لمدة 30 minutes. قم بإعداد نظام الزيارة الآلية متعددة النقاط في المجهر إذا كان متاحاً.

ركز على المنطقة الفاصلة بين PDMS وشريحة الغطاء الزجاجية واختر نقاطاً لتصويرها حول هذه المنطقة الفاصلة. بمتوسط 40 نقطة لكل صورة في حجرة Durex، وبتصوير الخلايا كل 10 دقائق لمدة تصل إلى 16 ساعة، ستظهر المنطقة ذات الاهتمام كخطين، حيث يمثل الخط الخارجي حافة شريحة الغطاء، بينما يمثل الخط الداخلي المنطقة الفاصلة الفعلية بين PDMS وشريحة الغطاء. ولتحليل البيانات، قم بإنشاء جدول بيانات مماثل للجدول الموضح في البروتوكول النصي.

قم بحساب عدد أحداث العبور من سطح PDMS إلى السطح الزجاجي وبالعكس من كل مقطع فيديو تم إنشاؤه. ويُعرف حدث العبور بأنه مرور نواة الخلية فوق الحدود الفاصلة بين PDMS والزجاج في أي من الاتجاهين. سجل عدد أحداث العبور في العمود المناسب في جدول بيانات Excel لتقدير عدد مرات العبور المتعددة.

قم بعدّ عدد المرات التي عبرت فيها الخلية الواجهة. يجب تسجيل هذا العدد في عمود Excel المقابل للمادة الأساسية التي كانت الخلية متواجدة عليها في نهاية المقطع المرئي. كرر هذا التحليل لكل خلية تعبر الواجهة في المقطع المرئي.

استبعد الخلايا التي تهاجر خارج مجال الرؤية أثناء التصوير. احسب النسبة المئوية للخلايا التي هاجرت من PDMS إلى السطح الزجاجي وبالتالي خضعت لـ Duro Texas. وللقيام بذلك.

قم بجمع عدد أحداث العبور من السطح اللين إلى السطح الصلب وأحداث العبور المتعددة التي انتهت على السطح الصلب، ثم اقسم الناتج على العدد الإجمالي لأحداث العبور. احسب النسبة المئوية للعبورات المتعددة بقسمة إجمالي العبورات المتعددة على العدد الإجمالي للعبورات، وذلك للبدء في فهم الآلية الجزيئية التي تستجيب بها الخلايا للإشارات الميكانيكية في بيئتها. يمكن تثبيط بروتينات محددة باستخدام IRNA كما هو موضح هنا.

أظهرت حوالي 70% من الخلايا الضابطة المعالجة بـ irna سلوك axxis. وفي تباين صارخ، عندما تم تثبيط CD gap باستخدام RNAi، لم تظهر الخلايا أي تفضيل فيما يتعلق بهجرتها نحو الركيزة الصلبة أو الركيزة الرخوة. علاوة على ذلك، عبرت الخلايا التي تم تثبيط CD gap فيها الحدود عدة مرات.

بينما تعبر الخلايا المعالجة بـ irna الضابطة الحدود عموماً مرة واحدة فقط، تُظهر المسارات التمثيلية لخلايا control. Irna أن الخلايا تهاجر عموماً عبر الحدود مرة واحدة وتبقى تفضيلياً على السطح الأكثر صلابة مقارنة بالخلايا المعالجة بـ CD gap. أما الخلايا المعالجة بـ Irna التي لم تظهر تفضيلاً لأي من درجتي الصلابة فقد عبرت الحدود عدة مرات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير ركائز PDMS، وتجميع غرف duris، وقياس ضرائب DUR كمياً.