عزل العملاق فرجونية الكروموسومات من المعيشة البويضات من الضفادع والسلمندر

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل النواة العملاقة ، أو الحويصلة الجرثومية ، من بويضة البرمائيات ، ونشر كروموسومات فرشاة المصباح ، والعضيات النووية الأخرى ، على شريحة مجهرية للتلوين المناعي ، والتهجين في الموقع ، والتقنيات الجزيئية الأخرى. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول التركيب الأساسي للكروموسومات والنواة والعضيات النووية الأخرى بالإضافة إلى التفاصيل الجزيئية للنسخ والتضفير وتصدير الحمض النووي الريبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي السهولة التي يمكن بها فحص بنية الكروموسوم ونسخها بواسطة الفحص المجهري الضوئي التقليدي ، باستخدام التألق المناعي ، والتهجين في الموقع ، والتقنيات الجزيئية الأخرى.

ستظهر الإجراء الدكتورة زهرة نظامي ، باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري. بعد تحضير جميع الحلول المطلوبة ، قم بتجميع شرائح الآبار ، المكونة من شرائح زجاجية فرعية ، تم ربط الآبار البلاستيكية بها بالبارافين ، كما تمت مناقشته في بروتوكول النص. ثم اجمع أنسجة المبيض التي تم جمعها مسبقا من ضفدع بالغ أو أنثى أو سمندل ، واملأ طبق بتري صغير بوسط زراعة البويضات.

استمر في وضع جزء من الأنسجة المعزولة ، أحدها يحتوي على ما يقرب من 10 إلى 20 بويضة ، في هذه اللوحة. بعد ذلك ، حدد بويضة واحدة واستخدم زوجين من ملقط المجوهرات لقطع الساق التي تربطها بجدار المبيض. بمجرد تحريرها ، انقل البويضة إلى طبق بتري جديد يحتوي على وسط عزل حوصلة جرثومية أو GV.

تحت التكبير المنخفض ، حدد موقع القطب الحيواني للبويضة ، والذي يمكن التعرف عليه من خلال لونه الداكن. ثم استخدم الملقط لعمل ثقب كبير بالقرب من عمود والمضي قدما في الضغط برفق على نواة البويضة الشفافة ، والتي يشار إليها أيضا باسم GV. بعد ذلك ، قم بلف GV بعيدا عن أي صفار تم بثقه أيضا. لإزالة صفار البيض الذي يظل ملتصقا بإحكام ، اسحب النواة داخل وخارج الماصة بطرف يبلغ قطره أكبر قليلا من قطر GV. بعد جمع ضفدع GV ، قم بنقله على الفور إلى وسط التشتت من أجل منع التصلب النووي الذي من شأنه أن يتداخل مع الخطوات اللاحقة.

بعد ذلك ، باستخدام زوجين من الملقط ، أمسك الغلاف النووي بالقرب من الجزء العلوي من GV ، مع الحرص على عدم الضغط لأسفل. بينما لا تزال تمسك بالظرف ، استمر في فصل الملقطين عن بعضهما البعض وتوقع خروج محتويات النواة. لجمع هذه المحتويات، قم أولا بإعداد ماصة قابلة للتعديل سعة 20 ميكرولترا بطرف مقطوع كما هو موضح في بروتوكول النص.

ثم ، من الطبق ، انتقل إلى سحب خمسة ميكرولترات من سائل التشتت متبوعا بخمسة ميكرولترات من المحلول مع محتويات GV. بمجرد جمع هذه المحتويات ، انقلها إلى شريحة جيدة مليئة بمحلول التشتت. تأكد من أن السائل الموجود في الشريحة له سطح محدب لتجنب محاصرة الفقاعات في الخطوات اللاحقة.

بعد ذلك ، ضع غطاء 18 ملم فوق البئر وضع الشريحة المجمعة في غرفة رطبة لمدة 10 إلى 60 دقيقة. خلال هذا الوقت ، توقع أن يتشتت الهلام النووي ببطء ، بحيث تستلقي الكروموسومات والعضيات النووية على سطح الزجاج. بعد إزالة نواة من بويضة السمندل ، اتركها في وسط العزل.

لاحظ أن السمندل GVs ، على عكس تلك الموجودة في أنواع الضفادع المستخدمة هنا ، لن تتصلب بشكل غير ملائم في هذا المحلول. قم بإزالة الغلاف النووي من السمندل GV باستخدام نفس التقنية القائمة على الملقط كما هو موضح للضفادع. بعد ذلك ، التقط المحتويات النووية المتبلور قليلا باستخدام ماصة ذات طرف مقطوع ، وانقل الجل إلى طبق بتري يحتوي على محلول تشتت.

اشطف الماصة بسرعة في محلول التشتت ، واستخدمها لجمع الجل النووي. ثم أدخل الجل في شريحة بئر ، وأضف زلة غطاء ، واترك الجل يتشتت كما هو موضح سابقا. ثم استخدم تباين الطور لعرض المحتويات النووية ، وتحديد كروموسومات فرشاة المصباح ، التي يتم اختصارها باسم LBCs ، من خلال حجمها الكبير والحلقات الجانبية المقترنة.

بعد التأكد من أن كرات الدم البيضاء غير مكسورة ، قم بإعداد الشريحة للطرد المركزي عن طريق وضع قطعة من ورق الترشيح على زلة الغطاء. ثم اضغط لأسفل لإزالة السائل الزائد من الغرفة. بعد ذلك ، أضف الفازلين إلى كل حافة من زلة الغطاء.

قم بتسخين قضيب معدني إلى حوالي 70 إلى 80 درجة مئوية واستخدمه لإذابة الهلام وإغلاق زلة الغطاء على البلاستيك الأساسي. كرر هذا الإجراء مع الشرائح الأخرى التي تحتوي على LBCs ذات نوعية جيدة. بمجرد لصق جميع زلات الغطاء ، ضع الشرائح في الناقلات للطرد المركزي وتأكد من توازن الناقلات المعاكسة.

باستخدام وظيفة البدء البطيء، قم بالطرد المركزي للشرائح كما هو موضح في النص باستخدام ناقلات مصممة خصيصا. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام جهاز طرد مركزي قياسي على سطح الطاولة حيث يتم لصق الشرائح على لوحة وتدويرها. لتحضير المحتويات النووية للتلوين المناعي أو التهجين الموضعي ، امسح أولا ختم الفازلين المؤقت بشفرة حلاقة ، ثم ضع الشريحة في رف طبق تلطيخ منزلق قياسي.

بعد ذلك ، أضف ما يكفي من بارافورمالدهيد لتغطية الشرائح. عند الغمر ، استخدم ملقطا غير حاد لإزالة كل زلة غطاء والتخلص منها. اترك الشرائح في المثبت لمدة 15 إلى 30 دقيقة.

بعد التثبيت ، ضع شريحة في طبق تلطيخ يحتوي على PBS المثلج. ثم أدخل شفرة حلاقة حادة على حافة المربع البلاستيكي ، وقم بفض هذا البلاستيك جيدا. بمجرد تكرار هذه العملية لجميع الشرائح ، تابع تلوين كما هو موضح في بروتوكول النص.

تظهر في صورة إضاءة المجال المظلم هذه المحتويات النووية من قنافذ البحر GV واحدة في الطور الأولي للانقسام الانتصافي الأول ، تم جمعها وإعدادها باستخدام البروتوكول الموصوف. تظهر 14 كرات الدم البيضاء الكبيرة المزدوجة ، وكذلك النوى المضخمة. يكشف التلوين الإضافي لهذا المستحضر ، بجسم مضاد ضد بوليميراز الحمض النووي الريبي الفوسبوري II ، الموضح هنا باللون الأخضر ، عن مواقع أجسام موضع الهيستون ويوفر أيضا نظرة ثاقبة لنشاط النسخ القوي لكروموسومات البويضات هذه.

يوضح التكبير العالي لجهاز قنافذ البحر LBC الفردي ، في هذه الحالة الذي تم تلطيخه باللون الأخضر لبوليميراز الحمض النووي الريبي والأزرق للحمض النووي ، الميزة المورفولوجية الأكثر تميزا لهذه الكروموسومات. المئات من الحلقات الجانبية المزدوجة ، كل منها يمثل وحدة نسخ واحدة على الأقل تقوم بتجميع الحمض النووي الريبي بنشاط. تؤكد المقارنة مع ضفدع LBC الملون بالمثل ، والذي تم تصويره بنفس التكبير ، على الاختلاف الهائل في الحجم بين كروموسومات الضفدع والسمندل ، وهو اختلاف يرتبط بمحتوى الحمض النووي الكلي لجينومات الأنواع المستخدمة.

ومع ذلك ، حتى في كروموسوم الضفدع ، يمكن رؤية وحدات النسخ الفردية على أنها حلقات من الكروماتين تسقط بشكل جانبي من محور الكروموسوم ، كما هو موضح في صورة التكبير الأعلى هذه. تحتوي بويضات الأسماك والطيور والزواحف وبعض اللافقاريات أيضا على كروموسومات فرشاة مصباح عملاقة. من اللافت للنظر أن كروموسومات فرشاة المصباح تتولد عندما يتم حقن رؤوس المنوية من الكائنات الحية الأخرى ، بما في ذلك البشر ، في الحويصلة الجرثومية البرمائية.

بمجرد إتقان التقنية ، يمكن تحضير مجموعة من هوامش AGV في ساعة واحدة ، ثم طردها مركزيا وتثبيتها في غضون ساعة إلى ساعتين أخريين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل GV ونشر كروموسومات فرشاة المصباح لمزيد من الدراسة باستخدام المجسات الجزيئية.