التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية السوادية الذروية لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

الهدف العام من هذا البروتوكول هو التعديل الوراثي لفطر التفحم ، ustilago maydis. تسمح طريقة توليد السلالة هذه بالتوصيف الوظيفي للجينات بعدة طرق. على سبيل المثال ، يمكننا حذف الجينات ، أو تبادل البروموتوس ، أو يمكننا إنشاء تركيبات اندماج.

الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكننا التحقق بدقة من التعديل ، بحيث يمكن ربط أي نمط ظاهري بشكل مباشر بالتغيير في الجين محل الاهتمام. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا ضروريا ، لأن معرفة متى إيقاف تفاعل البروتوبلاستينج أمر بالغ الأهمية للتحول الناجح. أثناء التحضير ، قم بتبريد أنبوبين مستديرين من المليلتر عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر.

بعد ذلك ، قم بتلقيح استزراع مسبق بسعة ثلاثة ملليلتر في YEPS-Light باستخدام طبق جديد. احتضنها لمدة 24 ساعة على عجلة دوارة عند 28 درجة مئوية. في اليوم التالي ، أضف 25 ميكرولترا من الزراعة المسبقة إلى 50 مل من YEPS-Light في قارورة محيرة.

بعد ذلك ، قم بتنمية الثقافة على شاكر مداري حتى تصل إلى المرحلة الأسية. تتوافق الكثافة البصرية البالغة 1.0 مع واحد إلى اثنين في 10 للخلايا السابعة في ustilago maydis. تحقق من الكثافة البصرية عند 600 نانومتر.

القيمة من 0.6 إلى 1.0 مقبولة. بعد ذلك ، تحقق من الخلايا بحثا عن تلوث تحت تكبير 40 ضعفا. يمكن تحديد الملوثات البكتيرية على أنها خلايا صغيرة وغالبا ما تتحرك.

يمكن تحديد الملوثات الفطرية بناء على شكلها أو حجمها. تخلص دائما من الثقافات الملوثة واعمل فقط من الثقافات النظيفة. بعد تكوير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 1 ، 500 جم ، تخلص من الخارف.

ثم, أعد تعليق الحبيبات في 25 مل من SCS. كرر الطرد المركزي. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد ثلاثة ملليلتر من محلول البروتوبلاستيلاست لكل بيليه خلية.

مرر هذا المحلول من خلال مرشح 22 ميكرون. الآن تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من محلول البروتوبستري. ثم اترك الخلايا ترتاح في درجة حرارة الغرفة حتى تصبح 30 إلى 40٪ منها مستديرة أو على شكل رأس دبوس.

يمكن أن يستغرق التفاعل من خمس إلى 20 دقيقة. ابدأ في مراقبته تحت المجهر بعد خمس دقائق. للحصول على أقصى قدر من كفاءة التحويل ، يجب إيقاف تفاعل البلاستيك الأولي في اللحظة المناسبة.

وبعد ذلك ، يجب التعامل مع البروتوبلاست بعناية فائقة كما لو كانت فقاعات صابون. تابع البروتوكول ، مع الحفاظ دائما على البروتوبلاست على الجليد. الخطوة التالية هي غسلها ب 10 مل من SCS البارد ، ثم جمعها بخمس دقائق تدور عند 1 ، 000 جم ، كرر خطوة الغسيل هذه ما مجموعه ثلاث مرات.

بعد الغسيل ، أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من STC البارد. ثم اجمع الخلايا مرة أخرى بخمس دقائق أخرى عند 1,000 جم ، متبوعا بإعادة تعليقها في 1 مليلتر من STC البارد. الآن اصنع 100 ميكرولتر من الحصص في الأنابيب الباردة وقم بتخزين هذه الحصص عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لتحويل ustilago maydis protoplasts ، قم بإعداد اختيارين لكل تحويل. أولا ، قم بإذابة أجار RegLight وتبريده إلى 60 درجة مئوية. ثم ، إلى بعض الأجار المذاب ، أضف المضاد الحيوي الانتقائي بضعف تركيز العمل ، وأضف 12 مل إلى كل طبق لتشكيل الطبقة السفلية.

يجب خلط العينة بعناية. تجنب صنع الفقاعات. احتفظ ب RegLight المتبقي بدون مضادات حيوية عند 60 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بإذابة أنبوب واحد من البروتوبلاست على الجليد لكل تحويل. بمجرد الذوبان ، أضف ميكرولتر واحد من محلول الهيبارين وميكروغرام واحد من الحمض النووي الخطي. ثم احتفظ بها على الجليد لمدة 10 دقائق.

أثناء الانتظار ، انشر 12 مل من RegLight بدون مضادات حيوية على RegLight مع المضادات الحيوية. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من STC / PEG إلى كل أنبوب تحويل واخلطها بعناية مع الانقلابات. ثم استمر في الحضانة على الجليد لمدة 15 دقيقة أخرى.

الآن قم بتوزيع كل تفاعل تحويل على لوحين منفصلين انتقائيين RegLight. تأكد من نقع كل السائل في الأطباق قبل المتابعة. بعد ذلك ، احتضن الصفائح في وضع مستقيم عند 28 درجة مئوية لمدة خمسة إلى سبعة أيام للحصول على 100 إلى 200 مستعمرة.

إذا نمت عدد قليل من المستعمرات ، فقد تحتوي البروتوبلاستات على الكثير من جدار الخلية ، ويمكن اختبار ذلك عن طريق تحويلها ببلازما مصنعة للخلايا أو قد لا تكون قادرة على التجدد ويمكن اختبار ذلك عن طريق زرعها على أطباق بدون مضادات حيوية. في وقت لاحق ، حدد 24 محولا للاختبار. أعد تنقيتها على YEPS-Light الانتقائي للحصول على مستعمرات مفردة.

في كل لوحة ، قم أيضا بإخراج بعض السلالات الأصلية للتأكد من أن المضادات الحيوية تختار ضد غير المحولات. من الأهمية بمكان التحقق من الطفرات باستخدام عملية من ثلاث خطوات تتضمن اثنين من تفاعل البوليميراز المتسلسل وتحليل اللطخة الجنوبية. هذه مفصلة في بروتوكول النص.

يشرح هذا القسم كيفية تحضير الحمض النووي الجيني اللازم لهذه التحليلات. أولا ، قم بتلقيح خمسة ملليلتر من YEPS-Light بالمحول المرشح ، واحتضانه على عجلة دوارة لمدة 24 ساعة عند 28 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بإسقاط ميكرولترين من المزرعة على لوحة CM.

حافظ على الثقافة معقمة. ثم قم بإعداد أنبوب ملليلتر يحتوي على حوالي 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي المغسول بحمض الهيدروكلوريك ومليلترين من الثقافة على مدار 24 ساعة. بعد تدوير الأنبوب عند 12،000 جم لمدة خمس دقائق ، قم بالشفط والتخلص من المادة الطافية.

إلى الحبيبات ، التي يمكن تجميدها للتخزين ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل usti. ثم هز الأنبوب بسرعة 1,000 دورة في الدقيقة على Vibrax لمدة خمس إلى 15 دقيقة. تأكد من إعادة تعليق الخلايا تماما ، ثم احتضان الأنبوب عند 65 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة.

بعد ذلك ، ضع الأنبوب على الجليد لمدة خمس دقائق. بمجرد أن يبرد ، أضف 100 ميكرولتر من 8 أسيتات البوتاسيوم المولار ، وقم بتطبيق دوامة قصيرة ، أو عشرة انعكاسات. بعد ذلك ، قم بتدوير الأنبوب عند 12 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بنقل 500 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر ، وأضف 400 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى الاقتباس. بعد الخلط ، قم بتدوير الأنبوب لمدة خمس دقائق عند 12 ، 000 جم ، وتخلص من المادة الطافية واغسل الحمض النووي المحبب ب 500 ميكرولتر من 70٪ إيثانول. الآن ضع خمس دقائق وتدور وقم بإزالة المادة الطافية تماما.

بعد دورة قصيرة أخرى ، اترك حبيبات الحمض النووي تجف في الهواء لبضع دقائق ، ثم أضف 50 ميكرولترا من RNase NTE. بعد إضافة RNase ، احتضن مع الاهتزاز ، ثم تابع استخدام الحمض النووي للتحليلات. تم إنشاء طفرات مفردة ومزدوجة من chintinases cts3 delta وطفرات متعددة مع ما يصل إلى جينات الكيتيناز الثلاثة الأخرى بالتتابع مع نفس التركيبات في خلفيتين وراثيتين مختلفتين.

تم تأكيد المحولات عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل ثم عن طريق تحليل اللطخة الجنوبية. بالنسبة لجين cts3 ، كان معدل إعادة التركيب المتماثل 70٪ في سلالة SG200 ، مما يشير إلى أن cts3 له وظيفة غير أساسية. تؤدي بعض الطفرات إلى عيوب واضحة في النمو.

على سبيل المثال ، كان لدى الطفرة المزدوجة cts1/2 عيب واضح في فصل الخلية. أظهر تلطيخ الحاجز أن الحركية الخلوية ستكتمل ، لكن الخلايا ستظل متصلة. لاختبار مساهمة الكيتيناز في الفوعة ، تم إجراء فحوصات عدوى الشتلات باستخدام طفرات سلالة SG200.

في حين أن طفرة الجين الخاضع للرقابة ، khd4 ، قللت من الفوعة ، فإن حذف جميع الكيتيناز لم يؤثر على عدوى شتلات الذرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تعديل فطريات التفحم وراثيا مثل ustilago maydis. بمجرد إتقانها ، يمكن بسهولة توليد السلالات في حوالي أربعة أسابيع.

عند استخدام هذا الإجراء ، من المهم حقا تخطيط تفاصيل التحقق من الإجهاد باستخدام برامج الاستنساخ المستقبلية. افعل ذلك قبل البدء في العمل مع الثقافات الفطرية. مع تعديلات طفيفة على هذا الإجراء ، يمكن تعديل فطريات التفحم الأخرى مثل sporsorium reilianum أو ustilago esculenta أو حتى الفطريات الخيطية ، مثل piriformospora indica ، وراثيا.

لا تنس أن العمل مع الكائنات المعدلة وراثيا يجب أن يتم وفقا للوائح في بلدك.