جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مكتبات تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين الأصلية لتحليل كثافة النيوكليوسوم. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة في علم التخلق مثل الكشف عن السمات اللاجينية في مجموعة الخلايا على مستوى نيوكليوسوم واحد وحل توقيعات الكروماتين غير المتجانسة في عناصرها المستمرة. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام خاصية MNase للوصول التفضيلي إلى منطقة الكروماتين المفتوحة لإنشاء قياس يجمع بين إمكانية الوصول إلى MNase وتعديل الهيستون.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنهم غير قادرين على الحصول على الهضم الأمثل ل MNase. ابدأ هذا البروتوكول بإعداد الخلية كما هو موضح في بروتوكول النص. في اليوم الأول, قم بإذابة كل حبيبات خلية في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 ثوان.

ثم انقل الخلايا إلى الجليد. إلى كل حبيبات خلية ، أضف على الفور عازلة تحلل مثلجة واحدة بالإضافة إلى واحد X الموافقة المسبقة عن علم إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ، 000 خلية لكل 20 ميكرولتر. امزج 10 مرات عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل دون تكوين فقاعات.

العمل على الجليد ، aliquot 20 ميكرولتر لكل بئر من المحللات الناتجة في صفيحة 96 بئر. قم بتغطية الطبق بالختم البلاستيكي قبل احتضانه على الثلج لمدة 20 دقيقة. قم بتسمية اللوحة باسم MNase وسجل الآبار في مفتاح القالب.

قبل اكتمال التحلل لمدة 20 دقيقة مباشرة ، قم بتخفيف إنزيم MNase واحد باستخدام مخزن مؤقت للتخفيف MNase إلى تركيز نهائي قدره 20 وحدة لكل ميكرولتر واحتفظ به على الجليد. العمل على الثلج ، قم بإعداد MNase مزيج هضم رئيسي كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بتجميع 20 ميكرولترا من المزيج الرئيسي لكل صف من العينات ، بالإضافة إلى خمسة ميكرولترات من الحجم الإضافي في لوحة خزان سعة 96 بئرا.

بعد أن تنتهي المحللات من الحضانة ، قم بإزالة صفيحة هضم MNase من الثلج. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 20 ميكرولترا من MNnase مزيجا رئيسيا للهضم في كل صف من العينات واخلطها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات. تغيير التلميحات بين الصفوف.

ثم احتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق بالضبط. لإيقاف التفاعل بعد خمس دقائق، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة ستة ميكرولترات من EDTA سعة 250 ميكرومولار في كل صف من العينات وخلطها لأعلى ولأسفل عدة مرات. تأكد من تغيير النصائح بين الصفوف.

بعد إضافة EDTA، قم بتبديل إعداد الماصة إلى 20 ميكرولترا، واخلطه 10 مرات كما كان من قبل لضمان التوقف الكامل لتفاعل الهضم. أخيرا ، أضف ستة ميكرولترات من المخزن المؤقت للتحلل 10X إلى كل صف من العينات المهضومة MNase واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات. غطي الطبق بختم بلاستيكي واحتضنه على الثلج لمدة 15 دقيقة.

قم بإعداد لوحة مركب حبة الجسم المضاد ولوحة التنظيف المسبق كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتدوير كلتا اللوحين بسرعة عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 ثوان عند 200 مرة G.ثم ضع لوحة مركب حبة الجسم المضاد على مغناطيس لوحة وانتظر 15 ثانية حتى يصبح المحلول واضحا. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية باستخدام ماصة دون إزعاج الخرز.

ثم قم بإزالة اللوحة من مغناطيس اللوحة واحتفظ بها على الجليد. ضع لوحة تفاعل ما قبل المقاصة على لوحة مغناطيس وانتظر 15 ثانية حتى تنفصل الخرزات ويصبح المحلول واضحا. دون إزعاج الخرزات ، استخدم ماصة لنقل المادة الطافية بعناية إلى الآبار المقابلة للوحة معقدة حبة الجسم المضاد المحفوظة على الجليد.

امزج كل بئر برفق عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 15 مرة. أغلق اللوحة جيدا بغطاء من الألومنيوم واحتضنه طوال الليل عند أربع درجات مئوية على منصة دوارة. بعد الحضانة ، أعد تسمية تفاعل IP للوحة.

في اليوم الثاني ، اضبط خلاط التسخين على 65 درجة مئوية ، ثم قم بإعداد مخزن غسيل منخفض الملح ومخزن غسيل عالي الملح على الثلج. قم بتدوير لوحة تفاعل IP بسرعة لمدة 10 ثوان بمعدل 200 مرة G.ضع لوحة تفاعل IP على مغناطيس لوحة وانتظر 15 ثانية حتى يصبح الحل واضحا. باستخدام ماصة متعددة القنوات، دون إزعاج الخرز، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها بعناية.

انزع اللوحة عن مغناطيس اللوحة وضعها على الثلج. إلى كل صف من العينات في لوحة تفاعل IP ، أضف 150 ميكرولترا من محلول الغسيل المثلج البارد منخفض الملح واخلطه ببطء لأعلى ولأسفل لمدة 10 مرات لإعادة تعليق الخرز بالكامل. ضع لوحة تفاعل IP مرة أخرى على مغناطيس اللوحة وقم بإزالة المادة الطافية كما كان من قبل.

بعد ذلك ، ضع الطبق مرة أخرى على الثلج وكرر خطوات الغسيل لمدة غسلتين. من خلال العمل على الجليد ، أضف 150 ميكرولترا من مخزن الغسيل عالي الملح إلى كل صف من العينات في لوحة تفاعل IP. امزج العينات ببطء عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 10 مرات لإعادة تعليق الخرزات بالكامل.

بعد إزالة المادة الطافية كما كان من قبل ، ضع لوحة تفاعل IP على الجليد وقم بتبريد صفيحة جديدة مكونة من 96 بئرا بجانبها. إلى كل صف من العينات في لوحة تفاعل IP، أضف 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت للغسيل عالي الملح واخلطه ببطء 10 مرات عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الخرزات بالكامل. بعد إعادة التعليق ، انقل كل صف من العينات إلى الصف المقابل من اللوحة الجديدة المبردة مسبقا المكونة من 96 بئرا.

تجاهل اللوحة القديمة. ضع لوحة تفاعل IP الجديدة على مغناطيس اللوحة وتخلص من المادة الطافية كما كان من قبل. احتفظ بالطبق في درجة حرارة الغرفة.

إلى كل صف من العينات في لوحة تفاعل IP، أضف 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت لشطف ChIP واخلطه ببطء عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات. احرص على منع تكوين الفقاعات. أغلق اللوحة بغطاء PCR واحتضانها في خلاط تسخين عند 65 درجة مئوية لمدة 1 1/2 ساعة بسرعة خلط 1 ، 350 دورة في الدقيقة.

بعد حضانة لمدة 1 1/2 ساعة ، قم بتدوير لوحة تفاعل IP عند 200 مرة G لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، ضع لوحة تفاعل IP على مغناطيس لوحة وانتظر حتى يتم مسح المحلول. باستخدام ماصة متعددة القنوات، دون إزعاج الخرز، انقل بعناية 20 ميكرولترا من المادة الطافية إلى صفيحة جديدة سعة 96 بئرا باستخدام أطراف جديدة لكل صف.

قم بتسمية اللوحة تفاعل IP واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة. انتقل إلى هضم البروتين متبوعا ببناء المكتبة كما هو موضح في بروتوكول النص. تظهر هنا النتائج التمثيلية للكروماتين المهضوم الأمثل وغير المهضوم وغير المهضوم قبل إنشاء المكتبة.

يهيمن على المظهر الجانبي المهضوم الأمثل أحجام شظايا النيوكليوسوم المفردة بينما لا يتم هضمها بشكل مفرط للسماح باستعادة شظايا النيوكليوسوم ذات الترتيب الأعلى. سيكون الهضم دون المستوى الأمثل للكروماتين واضحا أيضا في ملف تعريف مكتبة التسلسل التي تم إنشاؤها من مادة IP. للتحقق من صحة المكتبات بواسطة qPCR، تم تقييم إثراء مكتبات IP فيما يتعلق بمكتبة المدخلات للأهداف الإيجابية والسلبية.

بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكشف فحص القراءات المحاذاة للمكتبات ذات الإثراء الطي الذي تم تقييمه العالي qPCR على متصفح الجينوم عن إثراءات يمكن اكتشافها بصريا مقارنة بمكتبة الإدخال. ستحتوي مكتبات تسلسل ChIP الناجحة لكثافة النيوكليوسوم على تكرارات عالية الارتباط مع جزء كبير من القراءات المحاذاة داخل القمم المخصبة المحددة بواسطة MACS2. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مكتبات تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين الأصلية لتحليل كثافة النيوكليوسوم. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التأكد من هضم الكروماتين على النحو الأمثل واستخدام الأجسام المضادة فقط التي تظهر تقاربا عاليا مع الحاتمة ذات الأهمية وتظهر تفاعلا متصالبا ضئيلا أو معدوما مع الحلقات الأخرى. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء النمذجة الحسابية لإمكانية الوصول إلى MNase للإجابة على أسئلة مثل التوقيعات اللاجينية بسبب عدم التجانس داخل مجموعة الخلايا.

توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للتأثير التوافقي لموضع النيوكليوسوم والكثافة المحلية بالإضافة إلى التعديل اللاحق للترجمة لوحداتها الفرعية الهيستون ويمكن تطبيقها على أي أنظمة مثل الإنسان أو الفأر والخلايا الأولية والأنسجة المجمدة.