جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء مكتبات تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين الأصلي لتحليل كثافة النيوكليوسومات. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على تساؤلات في علم فوق الجينات، مثل الكشف عن السمات فوق الجينومية في مجموعة خلوية على مستوى نيوكليوسوم واحد، وتفكيك بصمات الكروماتين غير المتجانسة إلى عناصرها المستمرة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في الاستفادة من خاصية إنزيم MNase في الوصول التفضيلي إلى مناطق الكروماتين المفتوحة لإنتاج قياس يجمع بين إمكانية الوصول بواسطة MNase وتعديل الهستونات.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة بسبب عدم قدرتهم على تحقيق الهضم الأمثل باستخدام إنزيم MNase. ابدأ هذا البروتوكول بتحضير الخلايا كما هو موضح في البروتوكول النصي. في اليوم الأول، قم بإذابة كل كتلة خلوية في حمام مائي بدرجة 37°C لمدة 10 ثوانٍ.

بعد ذلك، انقل الخلايا إلى الثلج. أضف فوراً إلى كل كريّة خلوية محلول ليزيس (lysis buffer) بتركيز 1X مبرد بالثلج مضافاً إليه PIC بتركيز 1X، بحيث يكون التركيز النهائي 10,000 خلية لكل 20 µL. اخلط المزيج 10 مرات عن طريق السحب والدفع بالماصة دون تكوين فقاعات.

أثناء العمل على الثلج، قم بتوزيع 20 µL من نواتج التحلل الناتجة في كل بئر من أطباق 96 بئراً. غطِّ الطبق بالختم البلاستيكي قبل التحضين على الثلج لمدة 20 دقيقة. ضع ملصق MNase على الطبق وسجّل الآبار في مفتاح النموذج.

قبيل اكتمال عملية التحلل التي تستغرق 20 دقيقة، قم بتخفيف إنزيم MNase one باستخدام محلول تخفيف MNase one للوصول إلى تركيز نهائي قدره 20 units per microliter واحفظه على الثلج. وأثناء العمل على الثلج، قم بتحضير المزيج الرئيسي لهضم MNase one كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد ذلك، وزع 20 microliters من المزيج الرئيسي لكل صف من العينات، بالإضافة إلى 5 microliters من الحجم الإضافي في لوحة خزان ذات 96 بئراً.

بعد انتهاء فترة تحضين النواتج المستخلصة، أخرج صفيحة هضم MNase من الثلج. وباستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 20 microliters من المزيج الرئيسي لهضم MNnase إلى كل صف من العينات، واخلط عن طريق السحب والدفع بالماصة 10 مرات. قم بتغيير الرؤوس بين الصفوف.

بعد ذلك، قم بحضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق بالضبط. لإيقاف التفاعل بعد مرور خمس دقائق، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 6 µL من EDTA بتركيز 250 µM إلى كل صف من العينات، ثم امزجها عن طريق السحب والضخ عدة مرات. تأكد من تغيير الرؤوس بين الصفوف.

بعد إضافة EDTA، قم بتغيير إعداد الماصة إلى 20 microliters، وامزج 10 مرات كما في السابق لضمان التوقف التام لتفاعل الهضم. وأخيرًا، أضف ستة microliters من 10X lysis buffer إلى كل صف من العينات المهضومة بواسطة MNase، وامزج جيداً عن طريق السحب والطرد بالماصة 10 مرات. قم بتغطية الطبق بغطاء بلاستيكي واتركه في الثلج لمدة 15 دقيقة.

قم بتجهيز صفيحة معقدات الأجسام المضادة والخرزات وصفيحة التصفية المسبقة كما هو موضح في البروتوكول النصي. قم بإجراء دوران سريع لكلتا الصفيحتين عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 ثوانٍ عند 200 ×g. بعد ذلك، ضع صفيحة معقدات الأجسام المضادة والخرزات على مغناطيس صفائح وانتظر لمدة 15 ثانية حتى يصبح المحلول صافياً. قم بإزالة السائل الطافي بعناية والتخلص منه باستخدام الماصة دون تحريك الخرزات.

بعد ذلك، قم بإزالة اللوحة من مغناطيس اللوحات واحفظها على الثلج. ضع لوحة تفاعل التصفية المسبقة (pre-clearing) على مغناطيس اللوحات وانتظر لمدة 15 ثانية حتى تنفصل الخرزات ويصبح المحلول رائقاً. وباستخدام الماصة، قم بنقل السائل الطافي بعناية إلى الآبار المقابلة في لوحة معقد الخرزات والأجسام المضادة المحفوظة على الثلج، مع مراعاة عدم تحريك الخرزات.

اخلط محتويات كل بئر بلطف عن طريق السحب والضخ بالماصة 15 مرة. أحكم إغلاق اللوحة باستخدام غطاء من الألومنيوم وحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C على منصة دوارة. بعد انتهاء فترة الحضن، أعد تسمية اللوحة لتصبح "تفاعل الترسيب المناعي" (IP Reaction).

في اليوم الثاني، اضبط الخلاط الحراري على 65 درجة Celsius، ثم قم بتحضير منظم غسيل منخفض الملوحة ومنظم غسيل عالي الملوحة على الثلج. قم بإجراء عملية دوران سريع (Quick-spin) لصفيحة تفاعل IP لمدة 10 ثوانٍ عند 200 ×g. ضع صفيحة تفاعل IP على مغناطيس الصفائح وانتظر 15 ثانية حتى يصبح المحلول رائقاً. وباستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بإزالة السائل الطافي والتخلص منه بعناية دون تحريك الخرزات.

انزع الطبق عن مغناطيس الأطباق وضعه على الثلج. أضف 150 microliters من محلول غسيل منخفض الأملاح المبرد إلى كل صف من العينات في طبق تفاعل IP، واخلطه ببطء من الأعلى إلى الأسفل لـ 10 مرات لإعادة تعليق الحبيبات بالكامل. ضع طبق تفاعل IP مرة أخرى على مغناطيس الأطباق وأزل الطافي كما سبق.

بعد ذلك، أعد الطبق إلى الثلج وكرر خطوات الغسيل ليصبح المجموع غسلتين. أثناء العمل على الثلج، أضف 150 microliters من محلول غسيل عالي الملوحة إلى كل صف من العينات في طبق تفاعل الـ IP. اخلط العينات ببطء عن طريق السحب والطرد بالمصّة 10 مرات لإعادة تعليق الحبيبات بشكل كامل.

بعد إزالة الطافي كما سبق، ضع لوحة تفاعل الـ IP على الثلج وقم بتبريد لوحة جديدة ذات 96 بئراً مسبقاً بجانبها. أضف 150 microliters من محلول غسيل عالي الملوحة إلى كل صف من العينات في لوحة تفاعل الـ IP، واخلط ببطء 10 مرات عن طريق السحب والضخ بالماصة لإعادة تعليق الخرزات بالكامل. بعد إعادة التعليق، انقل كل صف من العينات إلى الصف المقابل في اللوحة الجديدة ذات الـ 96 بئراً والمبردة مسبقاً.

تخلص من الطبق القديم. ضع طبق تفاعل IP الجديد على مغناطيس الأطباق وتخلص من السائل الطافي كما فعلت سابقاً. احتفظ بالطبق في درجة حرارة الغرفة.

أضف 30 µL من منظم استخلاص ChIP إلى كل صف من العينات في لوحة تفاعل IP، واخلط ببطء عن طريق السحب والضخ بالماصة 10 مرات. احرص على منع تكون الفقاعات. أغلق اللوحة بغطاء PCR واحضنها في جهاز خلط حراري عند 65 °C لمدة ساعة ونصف وبسرعة خلط تبلغ 1,350 RPM.

بعد فترة حضانة مدتها ساعة ونصف، قم بتدوير صفيحة تفاعل الـ IP بسرعة 200 ×g لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة 4 °C. ثم ضع صفيحة تفاعل الـ IP على مغناطيس صفائح وانتظر حتى يصفو المحلول. وباستخدام ماصة متعددة القنوات، وبدون تحريك الخرزات، انقل بعناية 20 µL من السائل الطافي إلى صفيحة جديدة مكونة من 96 بئراً باستخدام رؤوس ماصة جديدة لكل صف.

قم بتسمية الطبق باسم "IP Reaction" وحافظ عليه في درجة حرارة الغرفة. انتقل إلى مرحلة هضم البروتين متبوعة ببناء المكتبة كما هو موضح في البروتوكول النصي. تظهر هنا نتائج تمثيلية للكروماتين المهضوم بواسطة MNase في حالات الهضم المثالي، والهضم الناقص، والهضم الزائد قبل إنشاء المكتبة.

يتميز نمط الهضم الأمثل بسيادة أحجام شظايا النوكليوسوم المفردة، مع تجنب الهضم المفرط للسماح باستعادة شظايا النوكليوسوم من رتب أعلى. كما سيظهر الهضم غير الأمثل للكروماتين في نمط مكتبة التسلسل الناتجة عن مادة الترسيب المناعي (IP). وللتحقق من صحة المكتبات باستخدام qPCR، تم تقييم معامل إثراء مكتبات الترسيب المناعي بالنسبة لمكتبة المدخلات (input library) للأهداف الإيجابية والسلبية.

بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكشف فحص القراءات المحاذية للمكتبات ذات الإثراء المضاعف العالي المقيم بواسطة qPCR على متصفح الجينوم عن إثراءات يمكن اكتشافها بصرياً مقارنة بمكتبة الإدخال. ستتضمن مكتبات تسلسل ChIP لكثافة النيوكليوسومات ناجحة مكررات عالية الارتباط مع وجود جزء كبير من القراءات المحاذية ضمن القمم المثرية التي حددها MACS2. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في يومين إذا تم القيام بها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية إنشاء مكتبات تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين الأصلي لتحليل كثافة النيوكليوسومات. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التأكد من هضم الكروماتين بشكل مثالي، واستخدام الأجسام المضادة التي تظهر ألفة عالية مع الحاتمة المستهدفة وتظهر تفاعلية متصالبة قليلة أو معدومة مع الحاتمات الأخرى. وباتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء نمذجة حاسوبية لإمكانية وصول MNase للإجابة على أسئلة مثل البصمات فوق الجينية الناتجة عن التباين داخل مجموعة من الخلايا.

توفر هذه الطريقة رؤية حول التأثير التآزري لموقع النيوكليوسوم والكثافة المحلية، بالإضافة إلى التعديلات ما بعد الترجمة لوحدات الهيستون الفرعية، ويمكن تطبيقها على أي أنظمة مثل البشر أو الفئران، والخلايا الأولية والأنسجة المجمدة.