إنتاج ميكرووبوبي من الليسوبيد اتووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووو
March 3rd, 2020
يقدم البروتوكول المعلمات المحسنة لإعداد الليبوزومات الحساسة للحرارة باستخدام جهاز ميكروميكس ميكروميكس الرنجة المتداخل. وهذا يسمح أيضا شارك في تغليف دوكسوروبيسين وindocyanine الخضراء في الليبوزومات والإفراج عن الإفراج عن الدوكسوروبيسين للرقابة / أثار المخدرات.
Microfluidics هي تقنية ناشئة لإعداد الليبوسومات من حجم الجسيمات النانوية القابلة للتواؤم ومع قابلية استنساخ كبيرة وقابلة للتطوير. هذا البروتوكول يتيح عالية مستمرة من خلال إنتاج إنتاج الدهون الحساسة درجة الحرارة المنخفضة لتحميل المشترك مع دواء العلاج الكيميائي مثل دوكسوروبايسين وصبغة الفلورسنت مثل الأخضر indocyanine. إعداد الخلية تستخدم أساسا نهج من أعلى إلى أسفل مثل ترطيب فيلم الدهون والبثق.
لا يزال من الصعب إعداد دفعات كبيرة وقابلة للاستنساخ للتطبيقات السريرية. وتتمثل إحدى المزايا الرئيسية للميكروفوليديس في القدرة على التعامل مع حجم السائل الصغير مع قابلية عالية للتحكم في المكان والزمان أثناء العمل بطريقة مستمرة وآلية. إظهار الإجراء مع كالفين تشيونغ سيكون غوان لونغ ما أماليا رويز، الباحثين ما بعد الدكتوراه من مختبري.
لتجميع مضخات الحقنة، استخدم كابل شبكة المضخة إلى المضخات لتوصيل منفذ الكمبيوتر لمضخة الحقن الثانوية بمنفذ شبكة مضخة الحقن الرئيسية. استخدم الكمبيوتر لضخ كبل الشبكة لتوصيل منفذ الكمبيوتر الخاص بالمضخة الرئيسية بالمنفذ التسلسلي RS-232 للكمبيوتر. لتجميع جهاز microfluidic الرنجة staggard، استخدام الجوز وشرارة لتوصيل أنابيب إلى كل من مداخل ومنافذ الجهاز.
ثم استخدام الجوز الثاني وشرارة وجمعية جمعية لتحويل محطة أنابيب لكلا المداخل إلى luer الإناث. لإعداد برنامج التحكم في المضخة ، استخدم زر الإعداد لمضخة الحقنة لتعيين عنوان مضخة الحقن الرئيسية ومضخة الحقن الثانوية إلى Ad:01 و Ad:02 على التوالي ، ثم افتح برنامج التحكم في المضخة على الكمبيوتر. يجب الكشف عن مضختين حقنة تلقائياً تليها صوت تنبيه.
حدد HSW Norm-Ject قطر 5cc يساوي 12.45 لتعيين القطر إلى 12.45 ملليمتر. تعيين معدل إلى 0.25 ملليلتر في الدقيقة الواحدة لضخ واحد و 0.75 ملليلتر في الدقيقة الواحدة لضخ اثنين. تعيين وحدة التخزين إلى أي قيمة أعلى من خمسة ملليلتر وحدد وضع التسريب لكلا المضخات.
ثم انقر فوق مجموعة لتأكيد الإعدادات. لإعداد LTSL10 أو LTSL10 ICG خليط الدهون، استخدم واحد خمسة ملليلتر لور قفل حقنة لسحب ملليلتر واحد من خليط الدهون وآخر خمسة ملليلتر luer قفل حقنة لسحب ما لا يقل عن ثلاثة ملليلترات من محلول كبريتات الأمونيوم. حرك شفة المحاقن إلى مُنَطِّب المُحقن في المضخة لتثبيت المحاقن المحملة على مضخات الحقنة في الوضع المستقيم وإرفاق شفة المكبس للمحاقن إلى كتلة المدفع للمضخة ولف الطرف الآخر من شريط التدفئة ومسبار درجة الحرارة مع الحرارة حول المحاقن التي تحتوي على محلول الدهون.
التفاف نهاية شريط التدفئة إلى حقنة تحتوي على محلول مائي، وربط حقنة تحتوي على خليط الدهون إلى مدخل الإيثانول، وربط حقنة تحتوي على محلول كبريتات الأمونيوم إلى مدخل مائي. ضبط موقف المكبس لإزالة أي فقاعات الهواء من المحاقن حسب الضرورة وسد وفصل شريط التدفئة في 10 فترات ثانية حتى تصل درجة حرارة الحقن حوالي 51 درجة. عندما يظهر الحرارة درجة حرارة مناسبة، انقر فوق تشغيل كل في برنامج التحكم في مضخة لتشغيل مضخات الحقن والتحقق من أن تدفق السوائل خالية من فقاعات الهواء وأي تسرب.
جمع عينات liposome في قارورة ووقفة أو وقف التسريب عندما يكون إما حقنة فارغة تقريبا. Anneal حلول الليبوزوم التي تم جمعها في 60 درجة مئوية حمام الماء لمدة 1-1/2 ساعات قبل نقل الحلول إلى أنابيب غسيل الكلى لغسيل الكلى مقابل لتر واحد من 240 ميليمولار كبريتات الهيمونيوم لمدة أربع ساعات على الأقل في 37 درجة مئوية. ثم تخزين liposomes تنقية في أربع درجات مئوية.
لتحميل عن بعد من liposomes بواسطة التدرج الأسكندرية عبر مثقب، تحميل 25 ملليلتر من HBS على الجزء العلوي من عمود الكروماتوغرافيا استبعاد حجم والسماح لجميع من مليس لتدفق من خلال العمود. تحميل ملليلتر واحد من liposomes dialyzed إلى العمود. عندما مرت كل من حل الدهون من خلال العمود، إضافة 1.5 ملليلتر من HBS الطازجة إلى العمود.
عندما يكون كل من المخزن المؤقت قد مرت خلال العمود، إضافة ثلاثة ملليلتر من HBS الطازجة إلى العمود وجمع eluent. بعد ذلك، إضافة حل DOX في 1:20 DOX: phospholipid نسبة المولار إلى ملليلتر واحد من محلول liposome تبادل العازلة في قارورة بيجو ووضع القارورة في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 1-1/2 ساعة. بعد التحميل، تنقية liposomes بواسطة الكروماتوغرافيا استبعاد حجم كما أظهرت للتو.
بالليزر التدفئة الناجمة عن إطلاق الزناد من محتويات liposome، تعيين حمام الماء إلى 37 درجة مئوية. عندما استقرت درجة الحرارة، إضافة 200 ميكرولترات من الدهون المحملة DOX إلى كل بئر من لوحة 96-well واضحة ووضع لوحة في حمام الماء مع قاع غارقة في الماء. ثم تعيين نظام الليزر الحالي إلى 2.27 أمبير ووضع نظام الليزر collimator خمسة سنتيمترات عموديا فوق سطح لوحة 96-جيدا.
قم بتشغيل الليزر واستخدم مسبار درجة حرارة الألياف البصرية لمراقبة درجة الحرارة مرة واحدة في الدقيقة. في خمس و 10 دقائق، pirate 10 ميكرولترات من الدهون DOX محملة من كل بئر من لوحة واضحة 96 جيدا وإضافة 190 ميكرولترات من HBS إلى ثلاثة آبار فردية من لوحة سوداء 96 جيدا. لتقييم الإطلاق الكامل للمخدرات، اخلط 10 ميكرولترات من الليبوزومات مع 170 ميكرولترات من HBS و 20 ميكرولترات من محلول 1٪ Triton X-100 للمنظفات في ثلاثة آبار فردية من لوحة 96-well السوداء.
ثم قياس كثافة الفلوريسنس DOX على قارئ لوحة. إنتاج Microfluidic من النتائج LTSL4 في حل اللزوجة مثل هلام يتضح من عدد كبير من فقاعات الهواء المحاصرين في حين أن إعداد LTSL10 النتائج في تشكيل سائل غير لزج واضح. إن قياس تشتت الضوء الديناميكي لـ LTSL10 الذي تم إعداده عند 51 درجة مئوية يوضح القطر المتوسط المتوقع Z والتشتت الذي يشير إلى نجاح التجربة.
عندما يتم إعداد LTSL10 عند 20 درجة مئوية، ومع ذلك، يتم الحصول على ليبوسومات أكبر وأكثر تشتتا مما أدى إلى منتج دون المستوى الأمثل. LTSLs التي أعدتها الطريقة التقليدية لترطيب فيلم الدهون مع البثق تبين كفاءة تغليف DOX من 50-80٪ مع الصلب، LTSL10 التي أعدتها microfluidics النتائج في زيادة كبيرة في كفاءة تغليف DOX إلى متوسط 85٪ مما يدل على نجاح التحميل عن بعد من DOX ووجود التدرج pH عبر المسكرات. تم تحديد ملف تعريف إصدار DOX من LTSL10 أن تكون حساسة لدرجة الحرارة.
وLTSL10 لديه مرحلة انتقالية واسعة نسبيا مع بداية في 41.6 درجة مئوية التي تبلغ ذروتها في 42.6 درجة مئوية. وتعتمد كفاءة تحميل ICG على تركيز ICG الأولي وحجم العينات وتشتتها. وعلاوة على ذلك، فإن التشعيع ICG LTSL10 مع أشعة الليزر الأشعة تحت الحمراء القريبة يحفز التدفئة الحرارية الضوئية مما يؤدي إلى إطلاق DOX.
عند محاولة هذا الإجراء، من المهم ضمان تدفق السوائل مستقرة بحيث خلط السوائل، وبالتالي تشكيل ليبوسومات تظل قابلة للتكاثر. إن حُدَد الليبوسومات وغسيل الكلى خطوتان مهمتان لضمان تركيبة ليبوسومات مستقرة مع قدرة تحميل عالية. في اختبار في الجسم الحي يمكن أيضا أن تنفذ لتقييم LTSL10 توزيع الحيوي, إطلاق المخدرات, والنشاط المضادة للسرطان.
يمكن استخدام بروتوكولنا لإنتاج ميكرولويديك ناجح من ليبوسومات ليبوسومات حرارية الحساسية خالية من الكوليسترول في تطبيقات توصيل الأدوية.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول إعداد الليبوزومات الحساسة للحرارة باستخدام جهاز ميكروفلويديكات ممزق متعرج متسلسل. إنه يسهل الالتفاف المشترك لدوسوروبيسين و إندوسيانين أخضر، مما يمكن الإطلاق المحفز بالحرارة الضوئية لتوصيل الدواء المتحكم فيه.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الميكروفلويديكات
- أنظمة توصيل الدواء
- النانوتكنولوجيا
الخلفية
- تسمح الميكروفلويديكات بالتحكم الدقيق في إعداد الليبوزومات.
- توجد تحديات في إنتاج دفعات كبيرة قابلة للتكاثر للاستخدام السريري.
- يمكن للليبوزومات الحساسة للحرارة تحسين كفاءة توصيل الدواء.
- يعد التحميل المشترك مع العلاج الكيميائي والأصباغ الفلورية مفيدًا للمراقبة.
غرض الدراسة
- تحسين معلمات إعداد الليبوزومات الحساسة للحرارة.
- تمكين الالتفاف المشترك للعوامل العلاجية.
- تبيان الإطلاق المتحكم فيه للدواء باستخدام طرق حرارية ضوئية.
الطرق المستخدمة
- جهاز ميكروفلويديكات ممزق متعرج متسلسل.
- الإنتاج المستمر للليبوزومات.
- التحميل المشترك لدوسوروبيسين و إندوسيانين أخضر.
- آلية الإطلاق المحفز بالحرارة الضوئية.
النتائج الرئيسية
- الإعداد الناجح للليبوزومات الحساسة للحرارة.
- تبيين الالتفاف المشترك لدوسوروبيسين و إندوسيانين أخضر.
- تحقيق إطلاق متحكم فيه لدوسوروبيسين عند التحفيز الحراري الضوئي.
- تثبيط قابلية المقايسة وإعادة الإنتاج للطريقة.
الاستنتاجات
- يعزز البروتوكول من كفاءة إعداد الليبوزومات.
- تقدم الميكروفلويديكات نهجًا واعدًا لأنظمة توصيل الدواء.
- يمكن للإطلاق المحفز بالحرارة الضوئية تحسين النتائج العلاجية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput, reproducible production of temperature-sensitive liposomes for co-loading chemotherapeutics and imaging agents, addressing scalability challenges in nanomedicine manufacturing. The microfluidic approach supports predictive formulation control and rapid iteration in early-stage drug delivery development, reducing batch-to-batch variability that impacts preclinical consistency. It positions microfluidics as a scalable platform for generating lysolipid-containing liposomes with defined size and release properties, facilitating translational progression from discovery to IND-enabling studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables rapid screening of lipid compositions for temperature-triggered release profiles to interrogate drug delivery hypotheses.
- Operational Value: Provides standardized liposome batches with consistent Z-average diameter (~100 nm) for reliable structure-activity relationship studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports co-loading of doxorubicin and indocyanine green to develop dual-readout assays for drug release and photothermal response.
- Operational Value: Ensures high encapsulation efficiency (>80%) and reproducible size distribution, critical for assay robustness in compound screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates liposomes with defined phase transition onset (41.6°C) and peak release (42.6°C) to enable hyperthermia-triggered efficacy studies in tumor models.
- Operational Value: Facilitates remote loading via ammonium sulfate pH gradient, improving drug payload consistency for pharmacokinetic and biodistribution evaluations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery through lead optimization by providing tunable, scalable liposome formulations that support iterative design of thermosensitive nanocarriers.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of lipid composition effects on membrane permeability and drug release kinetics under mild hyperthermia.
- Screening: Delivers reproducible, monodisperse liposomes suitable for high-content screening of drug release under thermal or laser-triggered conditions.
- Analytics: Provides quantifiable outputs including Z-average diameter, encapsulation efficiency, and temperature-dependent release profiles for formulation comparison.
- Translational Research: Supports continuity into preclinical studies by producing liposomes capable of NIR laser-triggered release via ICG co-loading, enabling photodynamic therapy modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a continuous microfluidic platform adaptable to other lipid systems and therapeutic payloads, reducing revalidation burden across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in liposome performance by eliminating variability from bulk methods like lipid film hydration and extrusion.
- Operational Value: Delivers high-throughput, continuous production with precise flow control, improving manufacturing throughput and reducing operator-dependent variability.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in formulation development by providing rapid, scalable access to liposomes with defined thermal release thresholds.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating consistent nanocarrier batches that improve reproducibility in efficacy and safety studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic system setup, including syringe pump synchronization and temperature control for lipid and aqueous phases.
- Depends on access to staggered herringbone micromixer devices and compatible tubing, fittings, and heating elements for stable lipid solution handling.
- Necessitates standardized operating procedures for annealing, dialysis, and buffer exchange steps to ensure pH-gradient formation and remote loading efficiency.
- Involves adaptation considerations when shifting lysolipid ratios or cholesterol content, which may affect phase transition behavior and liposome stability.
- Includes practical limitations such as the need to avoid air bubble formation during syringe loading and maintain precise flow ratios (0.25 mL/min and 0.75 mL/min) for reproducible mixing in the SHM device.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:06
Equipment Setup
2:46
Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposome (LTSL) Preparation
4:48
Remote Doxorubicin (DOX) Loading
5:48
Laser Heating and Triggered Release
7:13
Results: Representative LTSL10 Characterization, Loading, and Photothermal Heat Triggering
8:59
Conclusion
