جيم ايليجانس تشريح الغدد التناسلية وتجميد الكراك للتألق المناعي وتلطيخ DAPI

يتم استخدام هذه الطريقة للتشريح والتألق المناعي من قبل العديد من مختبرات C.elegans. يمكن اعتماده للكشف عن أي بروتين يتوفر له جسم مضاد أو بروتين اندماج موسوم. على الرغم من أنه يتطلب بعض الممارسة للحصول على هذا التشريح بشكل صحيح ، إلا أن هذا البروتوكول مرن ومباشر لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.

بالنسبة لنا ، يعمل تلطيخ DAPI دائما ويمكننا عادة العثور على حالة تعمل مع كل جسم مضاد. التحدي الأكبر لهذه التقنية هو خطوة التشريح. عليك أن تعمل بسرعة ولكن بثقة للحصول على سحب جيد للخط الجرثومي.

الممارسة هي المفتاح. للبدء ، ضع شريحة تثبيت على مرحلة مجهر التشريح وضع الغطاء أعلى شريحة التثبيت. بعد ذلك ، ماصة أربعة ميكرولتر من محلول التشريح في وسط الغطاء وحرك شريحة التثبيت إلى جانب واحد من المسرح لتحرير المنظر.

اختر 10 إلى 20 خنثى من صفيحة NGM في قطرة محلول التشريح. من الأفضل اختيار ما يقرب من 10 لكل شريحة ولكن ليس الكثير بحيث لا يمكن تشريحها في غضون خمس دقائق. لتشريح الحيوانات ، اعبر نقاط الإبر لعمل شكل X واستخدم الجزء السفلي من X لتثبيت شخص بالغ على سطح غطاء الغطاء.

بعد ذلك ، ضع شكل X خلف البلعوم مباشرة ، أي حوالي خمس طول جسم الشاب البالغ أو أسفل الجزء الشفاف من الرأس مباشرة. ثم ، قطع رأس الحيوان بحركة مقصية واحدة ، وإطلاق سراحه بالكامل من تجويف الجسم ، جنبا إلى جنب مع نصفي القناة الهضمية أو كليهما. لإصلاح العينة باستخدام الفورمالديهايد ، ماصة أربعة ميكرولتر من محلول التثبيت على غطاء الغطاء ، قريبة جدا من القطرة مع الحيوانات ، مع تجنب الماصة مباشرة في قطرة التشريح وتشريح الذبائح.

ثبت الغطاء على شريحة التثبيت باستخدام إصبع واحد. من ناحية أخرى ، حرك الغطاء برفق عدة مرات لخلط القطرات. أمسك الجانب الأمامي للشريحة المشحونة إيجابيا لأسفل ، واستخدمه لالتقاط غطاء الغطاء في وسط الشريحة عن طريق لمس قطرة العينة برفق ، وسوف يلتقط التوتر السطحي للقطرة قسيمة الغطاء.

اضبط الشريحة على المقعد وثبتها لمدة خمس دقائق بالضبط في درجة حرارة الغرفة. خلال هذا الوقت ، قم بتسمية الشريحة بقلم رصاص. لتجميد تكسير العينة باستخدام النيتروجين السائل أثناء الإمساك بالحافة الموسومة للشريحة بملاقط ، قم بخفضها برفق إلى نيتروجين سائل.

حرر الشريحة ، بحيث تميل على جانب الدورق مع جانب الغطاء لأعلى ، ويتم تجميد الشرائح في غضون 10 ثوان. في حالة استخدام الثلج الجاف للتجميد ، بعد كشط الصقيع من سطح كتلة الألومنيوم باستخدام ماكينة حلاقة ، أمسك الحافة الموسومة للشريحة بإحكام وضعها على السطح الذي تم تطهيره ، مع تطبيق بعض الضغط لأسفل لضمان الاتصال الكامل بالكتلة. يحدث التجميد في غضون 10 ثوان حيث تتحول العينة الموجودة أسفل الغطاء إلى جليد.

قم بإزالة الشريحة المجمدة عن طريق الإمساك بإحكام بالحافة القصيرة للشريحة ، وقم بتثبيت حافة طويلة واحدة على المقعد. من ناحية أخرى ، أمسك ماكينة الحلاقة بإحكام وحرك حافة ماكينة الحلاقة لأسفل الشريحة لنفض الغبار عن الغطاء بعيدا عن العينة. ضع الشريحة على الفور في جرة كوبلين تحتوي على 95٪ إيثانول ، واترك الشرائح في الإيثانول لمدة خمس دقائق على الأقل.

بعد ذلك ، اغسل الشرائح في PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة ، أثناء استخدام PBST الطازج لكل غسلة. أظهرت نتائج التصوير الفلوري لنوى الخط الجرثومي أن DAPI يرتبط بقوة بالحمض النووي. كان تلطيخ التألق المناعي فعالا عندما كان الجسم المضاد الذي يستهدف RAD-51 ، وهو علامة على فواصل الشريط المزدوج ، موجودا كبؤر منفصلة داخل النوى القاتلة ، موضعية بشكل مشترك على الكروموسومات المميزة بواسطة DAPI.

تحتوي طفرات kle-2 heterozygotes على عيوب طفيفة في بنية الكروموسوم ، كما يتضح من تلطيخ DAPI المضطرب قليلا وزيادة في عدد كسر الشريط المزدوج ، مما ينعكس في العدد الأعلى من بؤر RAD-51. يمكن أن تكون كل من خطوات التشريح وتجميد الكراك صعبة ، لذا من المهم العمل بسرعة وسلاسة. نوصي بممارسة هذه الخطوات قبل محاولة البروتوكول بأكمله.

على سبيل المثال ، يمكنك التدرب على التشريح في حجم أكبر من السائل ، مثل 200 ميكرولتر ، والعمل تدريجيا وصولا إلى الحجم الموصى به وهو أربعة ميكرولتر في زلة الغطاء. يمكن استخدام هذه التقنية للتصوير عالي الدقة على مجهر إضاءة متحد البؤر أو منظم ، أو يمكن استخدامها مع DNA أو RNA-FISH ، التهجين الفلوري في الموقع ، لتصور كيفية توطين البروتينات فيما يتعلق بتسلسلات محددة.