رسم خرائط كثافة الحمض النووي المطلقة في نوى الخلية باستخدام الفحص المجهري للتوطين أحادي الجزيء

تسمح الطريقة الحالية بقياسات كثافة الحمض النووي المطلقة في نوى الخلية للتحقيق في القيود المكانية في هياكل الكروماتين التي تتميز بخلاف ذلك فقط بتعديلات هيستون بعد الترجمة. تسمح فسيفساء Voronoi جنبا إلى جنب مع SMLM بتقديرات الكثافة المطلقة للحمض النووي من حيث الزوج الأساسي لكل ميكرومتر مربع. المعرفة الداهية الوحيدة المطلوبة هي محتوى الحمض النووي الكلي لنواة الخلية المقاسة.

في التجارب المستقبلية ، سيكون من المثير للاهتمام التحقيق فيما إذا كانت اختلافات الكثافة المطلقة مرتبطة بالمعلومات البيولوجية من طرق أخرى ، مثل التألق المناعي للتعديلات اللاجينية أو بيانات Hi-C. ابدأ بإعادة بناء المنطقة الممسوحة ضوئيا عن طريق تجانب الصور الفردية المسجلة مسبقا معا. افتح CellProfiler ثم قم بتحميل خط الأنابيب cellcycleanalysis.cpproj.

في صور الخطوة الأولى لخط الأنابيب، قم بسحب الصور وإفلاتها ، بما في ذلك الصورة المرجعية. بعد ذلك ، حدد موقعا سيتم تخزين الصور المرجعية فيه. ثم انقر فوق أيقونة بدء وضع الاختبار متبوعا بتشغيل.

بمجرد عرض الرسم البياني للنوى في الصورة المراد تحليلها، حدد فترات الشدة لمراحل G1 وS وG2، وتأكد من إدخالها في خطوات كائن المرشح اللاحقة لخط الأنابيب وأن هذه الخطوات نشطة. ثم انقر فوق تشغيل زر مرة أخرى لمتابعة النصف الثاني من خط الأنابيب. انظر إلى الصور الثلاث مع التراكبات التي تمثل مراحل دورة الخلية المختلفة ، G1 أو S أو G2 ، وحدد النوى في G1 أو G2 لمزيد من التصوير بحيث تكون كمية الحمض النووي في أزواج القواعد من نوى الصورة معروفة.

نقل الخلايا على مجهر توطين الجزيء الفردي ، وتأكد من الوميض المناسب لعملية FPALM. أولا ، قم بتسجيل مكدس ثلاثي الأبعاد للنواة المختارة فقط باستخدام 500 إطار لكل شريحة. يسمح ذلك بتحديد الكمية النسبية للحمض النووي في القسم الأوسط ، والذي يتم تصويره لاحقا بالعديد من الإطارات للكشف عن بنيته الفوقية.

ابدأ الحصول على سلسلة الصور باستخدام وقت تعريض ضوئي يبلغ 50 مللي ثانية، مما ينتج عنه معدل إطارات يبلغ حوالي 20 إطارا في الثانية. خذ مكدسة Z عبر النواة بفواصل خطوات 200 نانومتر و 500 إطار فقط لكل قسم بصري ضوئي. بعد الحصول على المكدس ، ارجع إلى موضع z الأولي واحصل على مجموعة البيانات الرئيسية المكونة من 50،000 إطار بنفس وقت التعرض البالغ 50 مللي ثانية.

افتح مجموعة بيانات FPALM في ImageJ. لتحسين إعدادات اكتشاف الإشارات الوامضة ، انقر فوق ThunderSTORM ، ثم تشغيل التحليل. الآن ، اختر إعداد الكاميرا.

أدخل حجم البكسل الصحيح لبيانات الصورة، وعدد A/D، والكفاءة الكمومية للكاميرا المستخدمة، والمستوى الأساسي، وكسب EM، ثم انقر فوق OK. اختر الخوارزمية لتحديد إحداثيات الترجمة عن طريق تركيب الإشارات الوامضة. في قسم تصفية الصور ، استخدم مرشح Wavelet B-Spline مع ترتيب B-Spline 3 ومقياس B-Spline 2. بعد ذلك ، اضبط طريقة التوطين التقريبي للجزيئات على الحد الأقصى المحلي ، واضبط عتبة شدة الذروة والاتصال على 8 جوار.

في قسم توطين البكسل الفرعي للجزيئات ، كطريقة ، اختر PSF Gaussian المتكامل ، واضبط نصف قطر التركيب px على 3 ، وحدد طريقة التركيب كأقصى احتمالية ، واضبط سيجما الأولية على 1.6. ثم انقر فوق موافق لبدء اكتشاف الإشارات وإعادة بناء الصورة. إذا تم تقسيم الاستحواذ إلى مكدسات صور مختلفة، فقم بتسلسل جداول الترجمة في ThunderSTORM.

للقيام بذلك ، انقر فوق استيراد في النافذة المنبثقة. تأكد من تنشيط خيار إلحاق بالجدول الحالي واستخدام رقم البداية الصحيح لتجنب تجاوز الترجمة في الجدول. ثم حدد مسار الملف وانقر فوق "موافق" لاستيراد ملف تلو الآخر.

لمنع الإفراط في عد الإشارات عبر الإطارات المتتالية، ادمج بيانات الترجمة باستخدام مسافة قصوى تبلغ 20 نانومتر، و1 كحد أقصى لإطارات الإيقاف، و0 إطار كحد أقصى لكل جزيء، ثم انقر على دمج. لقياس الانحراف وتصحيحه عن طريق المقاطع الفرعية للبيانات المترابطة، افتح قائمة تصحيح الانحراف، وانقر على الأسهم. أضف 3 صناديق واضبط التكبير على 5.

ثم انقر فوق تطبيق ، وستظهر النافذة التي تعرض الانجراف x و y. لتحديد مقدار الإشارة التي تتناسب مع محتوى الحمض النووي في كل شريحة من المكدس ثلاثي الأبعاد المسجل مسبقا مع 500 إطار لكل شريحة ، اختر المكونات الإضافية ، ثم ThunderSTORM ، متبوعا بالاستيراد / التصدير ، واستيراد جدول النتائج للشريحة الأولى من المكدس. لتجنب الإفراط في عد الإشارات من مستويات الصور الأخرى للمكدس ثلاثي الأبعاد ، يجب إزالة الإشارات من خارج الفاصل الزمني للخطوة البالغ 200 نانومتر في z بين الشرائح.

اضغط على رسم الرسم البياني وفي مربع حوار التوزيع المفتوح، اختر z واضغط على موافق. حدد موضع الذروة واستخدم حقل المرشح لتحديد الإشارات بحجم الخطوة البصرية 200 نانومتر. انقر فوق التصور واختر خيار الرسوم البيانية ، ثم انقر فوق موافق. احفظ الصورة الناتجة في مجلد بتنسيق TIFF. افتح جميع الشرائح وادمجها باستخدام Image متبوعا ب Stacks ثم Images to Stack.

بعد تحديد منطقة الصورة بأكملها ، انتقل إلى تحليل ، وانقر فوق أدوات وحدد مدير عائد الاستثمار. انقر فوق إضافة ، ثم انقر فوق تحليل ، متبوعا بتعيين القياسات وحدد الكثافة المتكاملة. الآن ، اختر خيار المزيد ، حدد مقاييس متعددة ، حدد قياس جميع المداخن بالإضافة إلى صف واحد لكل شريحة.

انقر فوق موافق ، وستظهر النتائج. يتناسب مجموع شدة جميع الشرائح مع محتوى الحمض النووي للنواة بأكملها بنفس الطريقة التي تتناسب بها شدة الشرائح الفردية مع جزئها من الجينوم بأكمله. بعد فتح جدول النتائج للمستوى المركزي الذي يحتوي على إشارات 50،000 إطار ، قم بتصفيته إلى سمك 100 نانومتر.

قم بإنشاء الرسم البياني للإشارات الناتجة كما هو موضح سابقا ، وقم بقياس الكثافة المتكاملة للقسم المركزي. قم بتحويل جدول توطين ThunderSTORM الكبير الذي يحتوي على معلومات البنية التحتية من القسم المركزي من تنسيق csv إلى تنسيق ORTE عن طريق تشغيل البرنامج النصي MATLAB TS2orte. m ، الذي يحول جدول الترجمة إلى مصفوفة MATLAB ويحفظه بتنسيق MAT.

انتقل إلى المجلد LAND-voronoi ، وفي المجلد الفرعي coreAlgorithm ، افتح ملف voronoicluster. م وضبط محتوى الحمض النووي ، وجزء من القسم المركزي المرصود من الحمض النووي لجزء النواة بالكامل والتوطين ، وعامل التحويل وفقا لنوع الخلية المستخدم ومرحلة دورة الخلية لحسابات الكثافة المطلقة. قم بتحرير البرنامج النصي الذي يبدأ التحليل voronoi.m.

اضبط مسار الملف على بيانات ترجمة orte ومجلد الإخراج لملفات النتائج. حدد الإحداثيات التي تحدد المنطقة التي يجب أن يتم فيها الفسيفساء. حدد مناطق متعددة للحساب داخل نفس مجموعة بيانات الإدخال.

بعد تشغيل البرنامج النصي ، ابحث عن الصورة التي توضح كثافات الحمض النووي المطلقة جنبا إلى جنب مع ملفات أخرى تحتوي على رسوم بيانية توضح الرسم البياني لتوزيع المنطقة والكثافة. m يحتوي على كثافات كل خلية Voronoi محسوبة في مجلد الإخراج. نتج عن قياس FPALM الذي يتكون من 50،000 إطار 2.68 مرة 10 إلى قوة 6 توطين تم اكتشافه داخل مقطع وسط بسمك 100 نانومتر.

كانت دقة توطين الصورة المعاد بناؤها 10 نانومتر. سمح العدد الكبير من التوطين بمزيج من التصوير فائق الدقة مع إظهار كثافة الحمض النووي المطلقة. كان من الواضح أن كثافة الحمض النووي المقاسة لم يتم توزيعها بشكل موحد عبر النواة وغطت نطاقا ديناميكيا واسعا.

أشارت التكبير العالي للمناطق داخل النواة التي تظهر خلايا Voronoi الأكبر إلى انخفاض كثافة الحمض النووي ، بينما أشارت الخلايا الأصغر إلى كثافة عالية من الحمض النووي. أظهرت كثافة الحمض النووي المقاسة في نواة نصف G1C3H10T التوزيع المطلق لكثافة الحمض النووي داخل نواة نوع وأنواع مختلفة. على الرغم من أن التنظيم الأساسي بدا مثل نواة G1 HeLa المبكرة ، إلا أنه امتلك أيضا مجموعات تأسيسية من الكروماتين غير المتجانس للمركز.

لم يلاحظ أي تغييرات معمارية جذرية في نواة G2 على الرغم من زيادة الحجم النووي بشكل طفيف. أظهرت نواة HeLa المعالجة ب TSA اختلافات ملحوظة فيما يتعلق بالتضاريس النووية وكثافة الحمض النووي. باستثناء الكروماتين غير المتجانس المحيطي ، الذي أظهر جزرا ذات كثافة عالية للحمض النووي ، بدا باقي الكروماتين أكثر تجانسا وغير مكثف.