بروتوكول مجهر متعدد العلامات لتحديد موقع جزيء واحد لدراسة الكروماتين في البيئة النووية الكثيفة
يونيو 5, 2026
نقدم بروتوكول تلوين وتحليل مجهر تحديد موقع الكروماتين الجزيء الواحد (SMLM) بثلاثة ألوان يتيح إمكانية إعادة رسم الخرائط بين يوكروماتين وغير متجانس الكروماتين وRNAP II للتحليل المكاني. يتيح هذا البروتوكول وضع علامات متعددة الألوان بكفاءة في البيئات النووية الكثيفة، بما في ذلك الأهداف المرتبطة بالكروماتين، مما يسمح بالكشف المتزامن بشكل موثوق.
تفحص أبحاثنا التركيب اللاجيني لمجالات تعبئة الكروماتين، وكيف تشكل العوامل التنظيمية هيكلها ووظيفتها. يعد هذا البروتوكول مفيدا بشكل أكبر للتحقيق في العلاقات المكانية بين الأهداف والبيئات الخلوية الكثيفة، مثل النواة. للبدء، قم بوزن ألبومين مصل البقر بحيث يكون التركيز النهائي في حجم المخزن المطلوب للتجربة هو 3٪. أضف ألبومين مصل البقر إلى أنبوب طرد مركزي.
قم بإمالة أنبوب الطرد المركزي بزاوية 45 درجة لتوزيع بلورات ألبومين المصل البقري، ثم أضف PBS إلى الأنبوب. هذا يمنع تكتل البلورات. دع جميع بلورات الألبومين في مصل البقر تذوب طبيعيا في درجة حرارة الغرفة وتجنب الاهتزاز أو الدوامات.
بمجرد ذوبان البلورات بالكامل، أضف ترايتون X-100 لتحقيق تركيز نهائي 0.2٪. إذا بقيت البلورات، قم بعمل الماصة في المحلول للأعلى والأسفل عدة مرات لخلط المحلول ببطء دون تكوين فقاعات. خذ الخلايا الحية من الحاضنة. أزل وسط زراعة الخلايا من الطبق.
اغسل الخلايا بإضافة كمية كافية من PBS لتغطية الخلايا، ثم استخدم الماصة لإزالة PBS. بعد ذلك، ضع الماصة كمية كافية من المحلول المثبت لتغطية الخلايا واتركها لتثبت لمدة 10 دقائق. باستخدام توازن، وزن بوروهيدريد الصوديوم لتحضير محلول تبريد بنسبة 0.1٪.
أضف بوروهيديراد الصوديوم إلى أنبوب طرد مركزي. قم بإخراج المحلول المثبت من الطبق. ثم أضف كمية كافية من PBS إلى الطبق لتغطية سطح الخلية.
ضع الطبق على جهاز هزاز لمدة خمس دقائق لغسل الخلايا. بعد ذلك، أضف الحجم المطلوب من PBS إلى بوروهيدريد الصوديوم في أنبوب الطرد المركزي. قم بدوامة الأنبوب لخلط محلول التبريد.
أخرج الطبق من الهزاك وتخلص من PBS من الطبق. أضف كمية كافية من محلول التبريد لتغطية سطح الطبق. ثم ضع الطبق على جهاز هزاز لمدة سبع دقائق لتهدئة التألق الذاتي في الخلايا.
تخلص من محلول التبريد المتبقي في أنبوب الطرد المركزي في حاوية النفايات الكيميائية السائلة الموسومة بشكل مناسب. أزل الطبق من الهزازة ثم أزل محلول التبريد من الطبق. ثم أضف كمية كافية من PBS إلى الطبق لتغطية السطح.
ضع الطبق على جهاز هزاز لمدة خمس دقائق لغسل الخلايا. بعد الحضانة، أزل PBS وكرر الغسيل ب PBS مرتين إضافيتين. الآن، أضف كمية كافية من حاجز العزل لتغطية السطح.
حضن الطبق على هزاز لمدة ساعة على الأقل لاختراق أغشية الخلايا وحجب مواقع الربط. لتحضير محلول صبغ الأجسام المضادة الأولي، انقل الحجم المطلوب من مخزن المخزن الحاجب إلى أنبوب طرد مركزي جديد. أضف الحجم المطلوب من مخزون الأجسام المضادة الأولية إلى مخزن الحجب لتحقيق التركيز النهائي الذي حدده المصنع.
بعد ذلك، استبدل الحاجز المانع بمحلول تلوين الأجسام المضادة الأولية لتغطية سطح الطبق وحضن على شاكر لمدة ساعة إلى ساعتين أو لمدة ليلية. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية، استبدل محلول الأجسام المضادة الأولي بمحلول غسيل. ثم ضع الطبق على شاكر لمدة خمس دقائق لغسل الزنزانات.
كرر عملية غسل مخزن الغسيل مرتين إضافيتين ليصبح المجموع ثلاث غسولات. جهز محلول صبغ الأجسام المضادة الثانوي وفقا للتركيز الموصى به. احسب حجم محلول التلوين الكلي بإضافة 0.5 ملليلتر إلى الحجم المطلوب لتغطية الخلايا.
انقل الحجم المحسوب من المخزن الحاجب إلى أنبوب طرد مركزي جديد لتحضير محلول التلوين. ثم أضف الحجم المناسب من مخزون الأجسام المضادة الثانوية إلى مخزن الحظر للحصول على التركيز النهائي الصحيح. لف أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على محلول صبغ الأجسام المضادة الثانوي بورق الألمنيوم، وامزج المحلول عن طريق التوصيل بأنبوب الأنابيب للأعلى والأسفل.
أضف كمية كافية من محلول صبغ الأجسام المضادة الثانوي إلى الطبق لتغطية السطح. ضع الطبق على شاكر لمدة 40 دقيقة لتثبيت الفلوروفورات على الأهداف الخلوية الموسومة. غط الطبق بورق الألمنيوم لمنع تبييض الفلوروفور.
بعد 40 دقيقة، قم بغسلتين PBS كما هو موضح سابقا. إذا كان التخزين مفضلا، أضف كمية كافية من PBS إلى الطبق لتغطية سطح الخلية قبل التخزين. لف الطبق بطبقة بارا فيلم لمنع تبخر السائل، ثم بورق الألمنيوم لمنع تبييض الفلوروفور.
خزن الطبق الملفوف على درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى يكون جاهزا للتصوير. أنتج بروتوكول التلوين المتسلسل صور dSTORM ثلاثية الألوان ممثلة لخطوط خلايا متعددة، بما في ذلك خلايا BJ الليفية، وخلايا HeLa، وMCF 10A. تم تقييم خط أنابيب التحليل باستخدام مجموعات بيانات محاكاة تمثل توزيعات مكانية منتظمة وحلقية وعشوائية مرتبطة بمواقع تجمعات الكروماتين المختلطة.
أنتجت أنماط التنظيم المكاني المميزة ملفات مخططات المسافة المميزة عند تحليل إحداثيات تحديد الموقع بالنسبة لمراكز الترو كروماتين غير المتجانسة. المؤشرات المحاكاة المفصولة مكانيا في تكوين المشيمية العادي تنتج كثافة مفاصل قليلة، مما أدى إلى ملف توزيع مستقيم. أنماط العلامات المتداخلة المحاكاة في تكوين عشوائي عادي أدت إلى تقليل كثافة المفاصل مع زيادة المسافة عن نقاط المرجع.
مكن التعرف القائم على مسح DB لمجالات الكروماتين المختلطة التصنيف إلى مجالات صغيرة ومتوسطة وكبيرة بناء على نصف القطر الفعال. أظهر تحليل المسافات الكمي أن بوليميراز RNA II و H3K27ac تمركزا بالقرب من حدود الكروماتين المختلطة عبر مجالات صغيرة ومتوسطة وكبيرة. أظهر تحليل كثافة المفاصل ذروة التزامن مع H3K27ac وRNA بوليميراز II خارج حدود تجمع الكروماتين المختلط.
باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للباحثين استجواب التنظيم الظاهري غير المنظم للكروماتين لاستكشاف العلاقة بين بنيته وعناصره التنظيمية ونتائجه الوظيفية. وبعد هذا الإجراء، يمكن لمختلف التحليلات الحسابية القائمة على الصور أو السحابة النقطية استخراج ميزات هيكلية كمية من البيانات المكانية، اعتمادا على طريقة التصوير المستخدمة. يمكن للباحثين توسيع طريقة التصنيف هذه من خلال تحسين علامات إضافية والاستفادة من البيانات متعددة القنوات لتمكين تحليلات أكثر تقدما وشمولا.
Overview
This article presents a sequential immunolabeling protocol for robust three-color single molecule localization microscopy (SMLM) in dense nuclear environments, enabling high-fidelity imaging of chromatin components. The method includes optimized buffer formulations, fluorophore selection, and antibody validation strategies to minimize crosstalk and signal degradation. It is integrated with a computational analysis pipeline that uses localizations from one target as spatial anchors to quantify inter-target distances, local densities, and multi-label co-affinity. The protocol is demonstrated in BJ Fibroblast, HeLa, and MCF 10A cells and supports detailed nanoscale spatial analysis of chromatin architecture.
Key Study Components
Area of Science
- Cell Biology
- Microscopy
- Chromatin Biology
Background
- Chromatin exhibits multiscale organization from nucleosomes to micron-scale domains, requiring high-resolution and specific imaging approaches.
- Single molecule localization microscopy (SMLM), particularly STORM, enables nanoscale mapping of epigenetic marks.
- Multi-label imaging in the nucleus faces challenges such as reduced antibody accessibility, non-specific binding, and fluorophore instability.
- Existing protocols often lack robustness in dense subcellular environments like the nucleus.
Purpose of Study
- To develop a sequential immunolabeling protocol optimized for high-density nuclear environments.
- To enable robust three-color SMLM with minimal crosstalk and reduced signal degradation.
- To integrate the protocol with a computational pipeline for quantitative spatial analysis of chromatin components.
- To provide a reproducible framework for multi-component imaging in dense subcellular environments.
Methods Used
- Sequential immunolabeling with optimized buffer formulations and fluorophore selection.
- Blocking with 3% BSA, fixation, and quenching with 0.1% sodium borohydride to reduce autofluorescence.
- Primary and secondary antibody incubations with washing steps to minimize non-specific binding.
- dSTORM imaging under buffered conditions to stabilize fluorophores.
- Computational analysis using localizations from one target as seed points to measure inter-target distances and joint densities.
- DB scan-based clustering to categorize heterochromatin domains by effective radius.
Main Results
- The protocol produced representative three-color dSTORM images in BJ Fibroblast, HeLa, and MCF 10A cell lines.
- Simulated data showed distinct distance histogram profiles based on spatial organization of markers relative to heterochromatin centroids.
- RNA polymerase II and H3K27ac were localized near heterochromatin boundaries across small, medium, and large domains.
- Joint density analysis revealed peak colocalization of H3K27ac and RNA polymerase II just outside heterochromatin cluster boundaries.
- The analysis pipeline enabled quantification of structural features from spatial point cloud data derived from SMLM.
Conclusions
- The sequential immunolabeling protocol enables reliable, high-fidelity three-color SMLM in dense nuclear environments.
- Integration with computational analysis allows nanoscale quantification of chromatin spatial organization.
- The method provides a reproducible framework for studying spatial relationships between chromatin components and regulatory factors.
- Researchers can extend the approach by optimizing additional markers for comprehensive multi-target analysis.
- This protocol advances the investigation of chromatin structure-function relationships in native cellular contexts.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical bottleneck in chromatin research: achieving robust, multiplexed super-resolution imaging in the dense nuclear environment where antibody accessibility and signal stability are major limitations. By enabling quantitative nanoscale mapping of epigenetic marks and regulatory factors relative to heterochromatin domains, it provides a mechanistic de-risking tool for target validation in epigenetic drug discovery. The integrated computational pipeline transforms raw localization data into actionable spatial metrics, supporting predictive confidence in early-stage target hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial relationships between chromatin marks, transcription factors, and heterochromatin to clarify mechanistic hypotheses in epigenetic regulation.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible framework for multiplexed target co-localization studies in dense subcellular environments.
- Predictive Value: Quantifies nanoscale proximity and co-affinity between targets, supporting target prioritization based on spatial context and functional relevance.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated, high-fidelity three-color SMLM data suitable for assay standardization and reproducibility assessment in nuclear target engagement studies.
- Scalability: Supports extension to additional markers via sequential labeling, enabling scalable multi-parameter chromatin architecture profiling.
- Analytical Output: Produces quantifiable spatial features such as inter-target distances, local densities, and joint density profiles for downstream screening hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of chromatin organization in disease-relevant cell models, linking epigenetic target modulation to structural outcomes.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase spatial insights with preclinical validation by providing consistent, quantifiable nuclear imaging readouts.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables mechanistic de-risking of epigenetic targets through direct visualization of their nanoscale chromatin environment and regulatory neighbors.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, where spatial chromatin context informs target druggability and mechanism of action. It enables screening-ready assay development by delivering standardized, multiplexed nuclear imaging data with quantitative outputs. The computational pipeline provides analytics-ready spatial metrics that support cross-functional comparison of compound or genetic perturbations on chromatin architecture.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping epigenetic marks and regulatory factors relative to heterochromatin domains.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible three-color SMLM data with minimized crosstalk for reliable compound effect assessment in nuclear targets.
- Analytics: Generates inter-target distance measurements, local density maps, and joint density profiles from localization data to quantify spatial relationships.
- Translational Research: Connects nanoscale chromatin organization findings to preclinical continuity through standardized, quantifiable spatial readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized protocol for multi-target nuclear imaging applicable across chromatin-focused discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation through direct nanoscale spatial mapping of chromatin components and regulators.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and signal fidelity in multiplexed nuclear SMLM via optimized blocking, antibody validation, and buffer formulations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in epigenetic target programs by providing spatial context that predicts functional target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets based on validated chromatin localization and co-affinity with key regulatory elements.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, immunostaining, and point cloud analysis for accurate data interpretation.
- Dependent on SMLM-capable instrumentation and stable fluorophore selection compatible with sequential labeling and buffering conditions.
- Necessitates cross-team standardization of antibody validation, blocking efficiency, and quenching protocols to minimize batch variability.
- Involves adaptation considerations for different chromatin targets, including epitope accessibility and antibody penetration in fixed dense nuclei.
- Limited by the sequential nature of staining, which increases total protocol time and requires careful optimization to avoid target loss or signal degradation over multiple rounds.
![إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56318.jpg%3Fv%3D2026-07-04T00%253A36%253A01.000Z&w=384&q=75)
