بروتوكول مجهر متعدد العلامات لتحديد موقع جزيء واحد لدراسة الكروماتين في البيئة النووية الكثيفة

تفحص أبحاثنا التركيب اللاجيني لمجالات تعبئة الكروماتين، وكيف تشكل العوامل التنظيمية هيكلها ووظيفتها. يعد هذا البروتوكول مفيدا بشكل أكبر للتحقيق في العلاقات المكانية بين الأهداف والبيئات الخلوية الكثيفة، مثل النواة. للبدء، قم بوزن ألبومين مصل البقر بحيث يكون التركيز النهائي في حجم المخزن المطلوب للتجربة هو 3٪. أضف ألبومين مصل البقر إلى أنبوب طرد مركزي.

قم بإمالة أنبوب الطرد المركزي بزاوية 45 درجة لتوزيع بلورات ألبومين المصل البقري، ثم أضف PBS إلى الأنبوب. هذا يمنع تكتل البلورات. دع جميع بلورات الألبومين في مصل البقر تذوب طبيعيا في درجة حرارة الغرفة وتجنب الاهتزاز أو الدوامات.

بمجرد ذوبان البلورات بالكامل، أضف ترايتون X-100 لتحقيق تركيز نهائي 0.2٪. إذا بقيت البلورات، قم بعمل الماصة في المحلول للأعلى والأسفل عدة مرات لخلط المحلول ببطء دون تكوين فقاعات. خذ الخلايا الحية من الحاضنة. أزل وسط زراعة الخلايا من الطبق.

اغسل الخلايا بإضافة كمية كافية من PBS لتغطية الخلايا، ثم استخدم الماصة لإزالة PBS. بعد ذلك، ضع الماصة كمية كافية من المحلول المثبت لتغطية الخلايا واتركها لتثبت لمدة 10 دقائق. باستخدام توازن، وزن بوروهيدريد الصوديوم لتحضير محلول تبريد بنسبة 0.1٪.

أضف بوروهيديراد الصوديوم إلى أنبوب طرد مركزي. قم بإخراج المحلول المثبت من الطبق. ثم أضف كمية كافية من PBS إلى الطبق لتغطية سطح الخلية.

ضع الطبق على جهاز هزاز لمدة خمس دقائق لغسل الخلايا. بعد ذلك، أضف الحجم المطلوب من PBS إلى بوروهيدريد الصوديوم في أنبوب الطرد المركزي. قم بدوامة الأنبوب لخلط محلول التبريد.

أخرج الطبق من الهزاك وتخلص من PBS من الطبق. أضف كمية كافية من محلول التبريد لتغطية سطح الطبق. ثم ضع الطبق على جهاز هزاز لمدة سبع دقائق لتهدئة التألق الذاتي في الخلايا.

تخلص من محلول التبريد المتبقي في أنبوب الطرد المركزي في حاوية النفايات الكيميائية السائلة الموسومة بشكل مناسب. أزل الطبق من الهزازة ثم أزل محلول التبريد من الطبق. ثم أضف كمية كافية من PBS إلى الطبق لتغطية السطح.

ضع الطبق على جهاز هزاز لمدة خمس دقائق لغسل الخلايا. بعد الحضانة، أزل PBS وكرر الغسيل ب PBS مرتين إضافيتين. الآن، أضف كمية كافية من حاجز العزل لتغطية السطح.

حضن الطبق على هزاز لمدة ساعة على الأقل لاختراق أغشية الخلايا وحجب مواقع الربط. لتحضير محلول صبغ الأجسام المضادة الأولي، انقل الحجم المطلوب من مخزن المخزن الحاجب إلى أنبوب طرد مركزي جديد. أضف الحجم المطلوب من مخزون الأجسام المضادة الأولية إلى مخزن الحجب لتحقيق التركيز النهائي الذي حدده المصنع.

بعد ذلك، استبدل الحاجز المانع بمحلول تلوين الأجسام المضادة الأولية لتغطية سطح الطبق وحضن على شاكر لمدة ساعة إلى ساعتين أو لمدة ليلية. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية، استبدل محلول الأجسام المضادة الأولي بمحلول غسيل. ثم ضع الطبق على شاكر لمدة خمس دقائق لغسل الزنزانات.

كرر عملية غسل مخزن الغسيل مرتين إضافيتين ليصبح المجموع ثلاث غسولات. جهز محلول صبغ الأجسام المضادة الثانوي وفقا للتركيز الموصى به. احسب حجم محلول التلوين الكلي بإضافة 0.5 ملليلتر إلى الحجم المطلوب لتغطية الخلايا.

انقل الحجم المحسوب من المخزن الحاجب إلى أنبوب طرد مركزي جديد لتحضير محلول التلوين. ثم أضف الحجم المناسب من مخزون الأجسام المضادة الثانوية إلى مخزن الحظر للحصول على التركيز النهائي الصحيح. لف أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على محلول صبغ الأجسام المضادة الثانوي بورق الألمنيوم، وامزج المحلول عن طريق التوصيل بأنبوب الأنابيب للأعلى والأسفل.

أضف كمية كافية من محلول صبغ الأجسام المضادة الثانوي إلى الطبق لتغطية السطح. ضع الطبق على شاكر لمدة 40 دقيقة لتثبيت الفلوروفورات على الأهداف الخلوية الموسومة. غط الطبق بورق الألمنيوم لمنع تبييض الفلوروفور.

بعد 40 دقيقة، قم بغسلتين PBS كما هو موضح سابقا. إذا كان التخزين مفضلا، أضف كمية كافية من PBS إلى الطبق لتغطية سطح الخلية قبل التخزين. لف الطبق بطبقة بارا فيلم لمنع تبخر السائل، ثم بورق الألمنيوم لمنع تبييض الفلوروفور.

خزن الطبق الملفوف على درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى يكون جاهزا للتصوير. أنتج بروتوكول التلوين المتسلسل صور dSTORM ثلاثية الألوان ممثلة لخطوط خلايا متعددة، بما في ذلك خلايا BJ الليفية، وخلايا HeLa، وMCF 10A. تم تقييم خط أنابيب التحليل باستخدام مجموعات بيانات محاكاة تمثل توزيعات مكانية منتظمة وحلقية وعشوائية مرتبطة بمواقع تجمعات الكروماتين المختلطة.

أنتجت أنماط التنظيم المكاني المميزة ملفات مخططات المسافة المميزة عند تحليل إحداثيات تحديد الموقع بالنسبة لمراكز الترو كروماتين غير المتجانسة. المؤشرات المحاكاة المفصولة مكانيا في تكوين المشيمية العادي تنتج كثافة مفاصل قليلة، مما أدى إلى ملف توزيع مستقيم. أنماط العلامات المتداخلة المحاكاة في تكوين عشوائي عادي أدت إلى تقليل كثافة المفاصل مع زيادة المسافة عن نقاط المرجع.

مكن التعرف القائم على مسح DB لمجالات الكروماتين المختلطة التصنيف إلى مجالات صغيرة ومتوسطة وكبيرة بناء على نصف القطر الفعال. أظهر تحليل المسافات الكمي أن بوليميراز RNA II و H3K27ac تمركزا بالقرب من حدود الكروماتين المختلطة عبر مجالات صغيرة ومتوسطة وكبيرة. أظهر تحليل كثافة المفاصل ذروة التزامن مع H3K27ac وRNA بوليميراز II خارج حدود تجمع الكروماتين المختلط.

باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للباحثين استجواب التنظيم الظاهري غير المنظم للكروماتين لاستكشاف العلاقة بين بنيته وعناصره التنظيمية ونتائجه الوظيفية. وبعد هذا الإجراء، يمكن لمختلف التحليلات الحسابية القائمة على الصور أو السحابة النقطية استخراج ميزات هيكلية كمية من البيانات المكانية، اعتمادا على طريقة التصوير المستخدمة. يمكن للباحثين توسيع طريقة التصنيف هذه من خلال تحسين علامات إضافية والاستفادة من البيانات متعددة القنوات لتمكين تحليلات أكثر تقدما وشمولا.