طريقة بسيطة وسريعة للعزل المتزامن للجزر الأولية وخلايا البنكرياس الأولية من الفئران

طورت هذه الدراسة طريقة مبسطة لاستخراج الجزر الأولية الوظيفية وخلايا الأسينار من البنكرياس الفأر بكفاءة، مما يوفر أداة قيمة لدراسة التواصل داخل الخلايا في مسببات مرض السكري الحاد PPDMA الناتج عن التهاب البنكرياس. تعتمد الطرق الحالية لعزل الجزر الأولية من الفئران بشكل رئيسي على تنصيب القنوات الصفراوية. تتطلب هذه التقنية تحديد موقع دقيق وقناة القناة الصفراوية، تليها تروية في الجسم الحي لمحلول كولاجناز P في البنكرياس.

من الصعب جدا القيام بذلك بدون تدريب متخصص، وتحقيق تروية بنكرياس فعالة وفعالة يمثل تحديا. يمنع هذا الفيديو طريقة بسيطة وسريعة لعزل الجزر الأولية المناسبة للباحثين الذين ليس لديهم خبرة في التفريغ. كما تتيح الطريقة اكتساب خلايا البنكرياس الأولية في نفس الوقت، مما ينتج كمية كافية من الجزر والخلايا الأسينارية عالية الجودة.

يتيح ذلك للباحثين إجراء تجارب ضمن نفس السياق المرضي والفسيولوجي، مما يسهل تحليلا معمقا لآلية التفاعل بين الجزر الصغيرة وخلايا الأسينار. عزل جزر البنكرياس وخلايا البنكرياس الحارة PACs. أضف محلول الملح المتوازن لهانك ومحلول كولاجناز P إلى صفيحة 12 بئرا وأضف ثلاثة ملليتر من محلول كولاجناز P إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 ملليلتر للهضم لاحقا.

تخدير الفأر بنسبة 1.25٪ من ترايبروموإيثانول قبل الجراحة تليها القتل الرحيم. قم بعمل شق بطني على شكل حرف V لفتح تجويف بطن الفأر. العضو اللمفاوي الأحمر الداكن في منطقة الهوس الغضروفي اليسرى هو الطحال، والعضو الأبيض المتصل بالطحال هو البنكرياس.

قم بإجراء تشريح دقيق للبنكرياس على طول الحافة السفلية للمعدة ونقطة الربط البنكرياسية الاثني عشر. اغسل نسيج البنكرياس المعزول في محلول الملح المتوازن من هانك وإزالة الوصلات المساريقية المتبقية، والطحال، والأنسجة الدهنية حول البنكرياس. انقل البنكرياس المعالج مسبقا إلى طبق يحتوي على 12 بئر مضاف مسبقا مع محلول كولاجناز P بسعة ملليترين.

ثبت البنكرياس في مكانه بالملاقط باليد اليسرى واستخدم حقنة بحجم ملليلتر واحد باليد اليمنى لحقن محلول الكولاجناز P في نسيج البنكرياس حتى يبدو نسيج البنكرياس شفافا ومليئا بالوذمة. اقطع البنكرياس إلى مكعب من قطعة نسيج بمقدار ملم إلى مليمتر بسرعة باستخدام مقص جراحي. اقطع الطرف البعيد من 1 إلى 1.5 سنتيمتر من طرف ماصة بحجم ملليتر واحد لتكبير الفتحة، واستخدم هذا الطرف المعدل لنقل قطع نسيج البنكرياس مع محلول كولاجناز P بحجم ملليترين إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 ملليتر محمل مسبقا بمحلول كولاجناز P بسعة ثلاثة ملليتر.

حضن أنبوب الطرد المركزي في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة، مع هز الأنبوب بلطف كل خمس إلى ست دقائق خلال هذه الفترة. أضف 10 ملليلتر من الوسط الكامل RPMI 1640 لإنهاء التأثير الهضمي لمحلول كولاجناز. قم بعمل الحبيبات مرارا وتكرارا باستخدام ماصنة باستور بسعة خمسة ملليلتر، مع 15 إلى 20 حركة صعود وهبوط، حتى لا تبقى تكتلات كبيرة واضحة في الأنسجة.

أضف 10 ملليلتر من RPMI 1640 المتوسط الكامل. ثم يتم الطرد المركزي عند 180 في G لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. وتخلص من الفائق السوبرناتينت، أعد تعليق الحبيبة مع 20 ملليلتر من RPMI 1640 المتوسطة الكاملة.

قم بتصفية نظام التعليق عبر منخل ب 40 شبكا. ثم يتم الطرد المركزي عند 180 في G لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت بلطف.

أضف 20 ملليلتر من محلول Ficoll لإعادة تعليق الحبيبة. ثم أضف ببطء 15 ملليلتر من RPMI 1640 المتوسط الكامل. في هذه المرحلة، يمكن ملاحظة واجهة سائلة شفافة.

استخدم الطرد المركزي بلطف عند 640 ضعف G لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية. قم بإزالة أنبوب الطرد المركزي بعناية، واسحب الطبقة الحمراء المتوسطة العليا باستخدام ماصة باستور بسعة خمسة ملليلتر. ثم يتم استنشاق الجزر السائلة التي تحتوي على السائل عند واجهة طبقة السائل ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 50 ملليتر.

أضف 20 ملليلتر من RPMI 1640 متوسط كامل. استخدم الطرد المركزي عند 180 ضعف G لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية، وتخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق الحبيبة باستخدام 20 ملليلتر من RPMI 1640 المتوسط الكامل.

استخدم الطرد المركزي عند 180 ضعف G لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية، وتخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق الرصاصة بسعة 10 مليليتر من RPMI 1640 المتوسطة الكاملة. وننقلها إلى طبق زراعة الخلايا بحجم 60 ملم.

تحت المجهر البيولوجي المقلوب بتكبير 100 مرة، اختر الجزر الصغيرة يدويا باستخدام منارة بسعة 20 ميكرولتر. انقل الجزر المختارة إلى لوحة زراعة خلايا مكونة من 24 بئرا محملة مسبقا ب 500 ميكرولتر من الوسط الكامل RPMI 1640 لكل بئر. تخلص من طبقة محلول Ficoll.

أعد تعليق الرصاصة ب 10 ملليلتر من DMEM المتوسط الكامل. قم بالتصفية عبر مصفاة خلايا بحجم 100 ميكرومتر. الطرد المركزي عند 180 ضعف G لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية.

وتخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق الرصاصة ب 10 ملليلتر من DMEM المتوسط الكامل. الطرد المركزي عند 180 مضروبا في G لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت.

ثم أعد تعليق الحبيبة بخمسة ملليلتر من الوسط الكامل DMEM للتجارب اللاحقة. بعد الطرد المركزي بكثافة محلول فيكول، لوحظت جزر صغيرة بالقرب من الواجهة بين الطبقة السائلة الشفافة عديمة اللون والوسط مع وجود حزم كرواسب في قاع الأنبوب. كانت الجزر عادة دائرية الشكل البيضاوي، بنية ذهبية، مع عائد مستقر يبلغ 120 فوق أو ناقص خمسة لكل فأر، كما هو موضح في الشكل A وB. كانت الجزر المعزولة حديثا كروية ومتجمعة.

كانت خلايا الأسينار ذات نهايات قمية أغمق مع حبيبات زيموجين مرئية، وكان العائد من 1.6 إلى 1.95 مرة 10 إلى سابع خلايا طاقة لكل فأرة، أظهر الشكل C والشكل D. تلوين كلاسين PI لخلايا الجزيرة والخلية الأسينية أن معظم الخلايا صبغت كالسين الأخضر، حي، وعدد قليل من PI الأحمر، ميتة، الشكل A. الصورة J التحليل الكمي يكشف أن الجزر المعزولة والخلايا الأسينية لديها معدلات بقاء 97.52 زائد أو ناقص 0.16٪ و96.55 زائد أو ناقص ناقص 0.95٪ على التوالي، الشكل B. خلايا البنكرياس المعزولة، نشاط الأميلاز الأساسي 0.79 زائد أو ناقص 0.01 وحدة لكل ملليلتر. بعد التحفيز ب 10 ضرس نانو، 20 ضرس نانو و50 نانو مولر كايرولين، بلغت نشاطاتهم في الأميلاز 1.45 زائد أو ناقص 0.03 وحدة لكل ملليلتر، 1.65 زائد أو ناقص 0.05 وحدة لكل ملليلتر، و1.39 زائد أو ناقص 0.02 وحدة لكل ملليلتر على التوالي. أظهر تحليل أنويفا أحادي الاتجاه أن جميع مجموعات الكيرولين لديها نشاط أميلاز مختلف بشكل ملحوظ عن مجموعة الضابطة، حيث كانت قيمة P أقل من 0.001.

بالإضافة إلى ذلك، اختلفت مجموعة 20 نانو مولر بشكل كبير عن مجموعة 10 نانو مول، حيث كانت قيمة P أقل من 0.001، الشكل A. الجزر المعزولة عند إفراز الأنسولين بمقدار 0.27 زائد أو ناقص 0.04 نانوجرام لكل ملليلتر لكل جزيرة في الساعة عند تحفيزها بجلوكوز 5.6 ملليمولر و0.94 زائد أو ناقص 0.04 نانوغرام لكل مليليتر لكل جزيرة في الساعة مع جلوكوز 22 ملليمولر، مؤشر GSI يساوي 3.44، الشكل ب. هذه الدراسة أسست طريقة لعزل الجزر الأولية للفئران وخلايا البنكرياس الأسينارية في نفس الوقت دون تروية مركبة في الجسم الحي. مع وجود حاجز تقني طويل، تكون الطريقة سهلة الاستخدام، حيث تنتج 120 جزيرة صغيرة زائد أو ناقص 5 و1.6 إلى 1.95 مضروبة من 10 إلى القوة السابعة لكل فأر، مع معدل بقاء في كلا نوعي الخلايا يزيد عن 96٪. تظهر الجزر المعزولة إفراز طبيعي للإنسولين المحفز بالجلوكوز، وخلايا الأسينار حساسة لتحفيز الكايرولين. وهذا يؤكد أن الخلايا التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة لها وظائف سليمة، مما يجعلها مناسبة للدراسات حول تفاعلات البنكرياس الخارجية والغدد الصماء.

على الرغم من أن الطريقة محدودة بالحاجة إلى معرفة أساسية بتشريح الفأر، والحاجة إلى تعديل جرعة الكاشف، والقيود على عدد الفئران المعالجة في نفس الوقت، ومخاطر التطبيق غير المصحوبة. لا يزال يوفر بروتوكول عزل الخلايا موثوقا للباحثين الذين يفتقرون إلى خبرة في التروية.