Summary
Medaka et le poisson-zèbre sont complémentaires pour la dissection génétique du génome des vertébrés fonctions. Ce protocole met en évidence les points clés pour réussir la microinjection dans des embryons de medaka, une technique importante pour l'analyse embryologique et génétique à l'aide medaka et le poisson zèbre dans un laboratoire.
Abstract
Dans cette vidéo, nous démontrons la technique de micro-injection dans une cellule embryons médaka scène. Medaka est un poisson d'eau douce petite ponte qui permet des analyses génétiques et embryologiques et est l'un des organismes modèles vertébrés dans lequel l'ensemble du génome phénotype mutant axée écrans ont été effectuées 1, comme dans le poisson zèbre et la souris. Divergence de chevauchement fonctionnelle des gènes liés entre medaka et le poisson-zèbre permet l'identification de phénotypes nouveaux qui ne sont pas identifiables dans une seule espèce 2, ainsi medaka et le poisson-zèbre sont complémentaires pour la dissection génétique du génome des vertébrés fonctions.
Pour profiter de poissons médaka dont les embryons sont transparents et développer à l'extérieur, la microinjection est une technique essentielle pour injecter des cellules-traceurs pour les cellules de l'étiquetage, les ARNm ou oligonucléotides anti-sens pour les sur-exprimant et frapper vers le bas des gènes d'intérêt, et d'ADN pour faire lignées transgéniques.
Protocol
1. L'accouplement et la collecte des œufs
- Médaka féminine et masculine se distinguent facilement par la taille et la forme des nageoires dorsale et anale. Les nageoires anales des mâles sont plus grands et en forme de parallélogramme comparé à celui des femelles. La nageoire anale des femmes est plus petite et en forme de triangle. La nageoire dorsale mâle a une encoche visible profonde entre les deux derniers rayons.
- Medaka pondre jusqu'à 40 oeufs tous les jours et les femelles portent des oeufs médaka regroupées à leur ventre par des filaments d'attache pendant plusieurs heures avant ils sont supprimés dans les usines dans le réservoir.
- Les femelles peuvent être pris dans un filet et maintenu à l'intérieur délicatement des deux côtés d'une seule main. Les oeufs peuvent alors être légèrement taquiné par le ventre avec l'index de l'autre main. La femelle peut alors être renvoyé dans le réservoir. Les œufs doivent être transférés dans une boîte de Pétri de 6 cm remplis avec les médias embryon par une pince émoussée ou un doigt.
- Paires Medaka se battent rarement quand ils sont conservés dans une boîte d'accouplement de petite taille. Par conséquent, ils peuvent être gardés dans un petit réservoir avec un débit d'eau afin qu'ils puissent être nourris et les oeufs peuvent être recueillies auprès de la même paire chaque jour pendant une couple de mois.
- Il est important que les poissons femelles ne devraient pas être conservés sans les hommes, puisque l'ovulation se produit tous les jours chez les femelles, médaka. Sinon, les femelles ne peuvent pas offrir des oeufs et de devenir malade.
2. Nettoyage des embryons
- Transfert unclustered oeufs avec une pipette de verre pour poncer (grain P2000, imperméable) placé dans le couvercle d'une boîte de Pétri de 9 cm. Retirer l'excès, mais d'assurer moyenne un volume suffisant demeure pour éviter le dessèchement des embryons.
- Roulez doucement sur le papier de verre en utilisant des embryons de l'index, appliquer une pression minimale et garder doigt parallèlement à la surface du papier de sable pour environ 45-60 secondes pour enlever une partie des poils surface externe du chorion. Ne pas rouler plus de 5-7 embryons à la fois cette précaution permettra de minimiser le risque d'écrasement des embryons en dessous de l'autre.
- Transfert embryons nettoyé à un plat frais de milieu embryon.
3. Faire plaques d'agarose pour la tenue de l'embryon pendant la microinjection
Les embryons sont maintenus dans des auges pendant l'injection faite avec un moule en plexiglas agarose à 1,5% (figure 1). La concentration d'agarose est important de tenir embryons correctement.
- Tout d'abord, faire un cadre d'agarose à tenir le moule en plexiglas. Verser agarose à 1,5% dans l'eau à une profondeur 0.5cm dans un plat 9cm de Petri et attendre qu'il se solidifie complètement. Découpez une zone de l'agarose simplement plus grande que la taille du moule.
- Verser 1,5% d'agarose pour remplir la zone de coupe et placez le moule de façon à ce qu'aucune bulle sont piégés et attendre d'agarose se solidifie. Cette plaque d'agarose peuvent être stockés dans le réfrigérateur pour accélérer solidifaction.
- Retirer le moule pour créer des auges pour tenir les oeufs. Ajouter suffisamment d'embryons moyenne de plonger le moule, couvrir et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
Figure 1. Schéma du sur-mesure moule utilisé pour préparer les creux dans les plaques d'agarose pour la microinjection.
4. Microinjection d'embryons médaka
Dans le médaka, ADN, ARN, oligonucléotides morpholino et colorants traceurs sont microinjectés travers le chorion dans le cytoplasme de la 1 à 64 cellules embryon au stade plutôt que le jaune que chez le poisson zèbre. Depuis le cytoplasme est plus petit et moins visible dans le médaka, la pratique en injectant des colorants tels que la rhodamine-dextran est recommandé de développer cette compétence. Ajout de rouge de phénol comme traceur est également encouragée pour permettre la confirmation des injections.
Comme le chorion entourant embryons médaka est rude, une courte aiguille d'injection solide et large est nécessaire (figure 2). Préparer cette aiguille d'injection fort et large à partir d'un verre à filament contenant capillaire.
- Préparer la solution d'injection avec le rouge de phénol comme traceur et le charger dans l'aiguille de l'arrière avec un microloader Eppendorf. Connectez à l'aiguille de l'injecteur pompe à air.
- Les œufs doivent être collectés et unclustered dès que possible après la fécondation d'injecter au stade d'une cellule. Plus embryons peuvent être injectés en les stockant sur la glace (pas plus de 30 minutes) pour arrêter la division cellulaire.
Figure 2. Comparaison des aiguilles medaka et le poisson-zèbre. Notez la pointe de l'aiguille MF (en haut) est plus courte et plus large donc plus forte pour percer le chorion difficiles entourant embryons médaka. - Transfert des œufs dans la plaque d'agarose et les aligner dans le creux avec une pince. Juste avant l'injection, cinq œufs doivent être tournés de façon la membrane cellulaire du cytoplasme d'une cellule peut être touché par ee l'aiguille perpendiculairement. Le cytoplasme de la cellule unique peut être trouvée par la recherche d'une zone dépourvue de petites gouttelettes d'huile qui est opposé au côté de l'œuf avec des gouttelettes d'huile plus dense. La zone identifiée peut être confirmé pour être le cytoplasme en regardant par le côté.
- Placer la fermeture aiguille pour les oeufs. Ouvrez la pointe de l'aiguille en touchant doucement la pointe de l'aiguille pour le chorion ou en utilisant microforceps (figure 3). Une petite quantité de substance d'injection doit être vu de s'écouler.
- Crevaison à travers le chorion de placer la pointe de l'aiguille à l'intérieur du chorion. Régler la pression de maintien de l'injecteur à être relativement élevé, afin de s'assurer qu'aucun reflux survient en raison de la forte pression sur la ponction à travers le chorion difficiles (les paramètres de 80-100hPA pour la pression holding et 500-700hPa pour la pression d'injection).
- Insérer la pointe de l'aiguille dans le cytoplasme par une forte piquer sa membrane.
Evitez d'insérer la pointe de l'aiguille dans le jaune. Contrairement poisson zèbre, matière injectée dans le jaune ne sera pas transféré dans le cytoplasme. Liquides injectés ont une frontière distincte lorsqu'il est injecté dans le jaune alors que la limite est floue lorsque dans le cytoplasme (figure 4).
Parfois, l'aiguille peut être bloquée par agarose / débris. Pince peuvent être utilisés pour toucher / sauts de la fin de l'aiguille et retirer le blocage. Si l'aiguille se casse à tout moment pendant l'injection, le bullage sera vu dans le support d'embryon et la substance vous injectez seront perdues. Les injections doivent être effectuées systématiquement de haut en bas le long des canaux d'agarose et de gauche à droite dans le moule. - Embryons injectés doivent être transférés à un plat propre milieu contenant l'embryon et développés à la température appropriée.
Figure 3. Briser la pointe de l'aiguille avant l'injection. 1: Déplacer la pointe de l'aiguille à proximité du chorion de l'embryon; 2: Touchez le chorion et déplacer l'aiguille d'avant en arrière doucement à briser la pointe; 3: Quand une petite quantité de substance par injection s'écoule de l'extrémité de l'aiguille, ce qui confirme la rupture de la pointe.
5. Les résultats représentatifs
Figure 4. Images représentant des embryons injectés médaka. Le panneau A montre une image représentative de l'injection correcte de la rhodamine-dextran dans le cytoplasme d'un embryon d'une cellule de phase de médaka. Groupe B montre une image représentative de l'injection incorrecte de la rhodamine-dextran dans le sac vitellin d'un embryon d'une cellule de phase de médaka. Panneaux C et D montrent les embryons à partir de panneaux A et B respectivement à environ 30 heures après l'injection. EM: embryon, antérieure est à la hausse dans les panneaux C et D et la vue est dorsale. Notez le corps de l'embryon dans le panneau D n'est pas rouge comme le colorant a été incorrectement injecté dans le sac vitellin. Les flèches en B et D indiquent la rhodamine-dextran injecté correctement dans le sac vitellin noter la frontière distincte circulaire. Les lignes en pointillé dans A et B indiquent aperçu du cytoplasme d'une cellule, vue latérale.
Discussion
Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour traceur cellulaire, de l'ARNm, l'ADN ou anti-sens d'injection d'oligonucléotides en une seule cellule embryons médaka scène. Cette technique nous a permis d'étudier divers processus de développement in vivo en temps réel. Ce processus et l'analyse subséquente détaillées qu'il offre a le potentiel d'améliorer considérablement notre compréhension de l'organogenèse des vertébrés et de la biologie cellulaire sous-jacent. Ces connaissances peuvent être importants pour, et le rendement des applications thérapeutiques en médecine régénérative.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de la MRC.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 4" fine net | Tools | J K Aquatics Ltd. | MD001 | Used to capture fish during egg harvesting. |
| Embryo medium | Reagent | Home made | 200ml 50X stock solution, 1ml 1%methyleneblue in H2O/10 liter RO water (50X stock solution: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl2 2H2O 2.4g, MgSO4 7H2O 4.0g/1 litre RO water. | |
| Fine waterproof sandpaper - p2000 grit size | Tools | Hermes Abrasives Ltd. | Very fine grit size for rolling/cleaning embryos with chorions. | |
| Borosilicate glass capillaries | Tool | Harvard Apparatus | GC100-10F | For making microinjection needles. |
| Micropipette puller | Equipment | Narishige International | Model PP-830 | For making microinjection needles. |
| Eppendorf microloader | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | For loading microinjection needles. |
| Microinjector apparatus | Equipment | Eppendorf | Model 5242. | |
| Micromanipulator | Equipment | Narishige International | Model MN151. | |
| Agarose injection plate | Tools | Home made | For holding embryos during injection. |
References
- Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes. Mech Dev. 121, 647-658 (2004).
- Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study. Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).
