本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于研究主动脉的免疫细胞组成。同时，本文还展示了一种额外的技术，可分别检测周围外膜和血管壁。该方法为开展主动脉白细胞的表型分析以及在动脉粥样硬化研究中应用多种免疫学检测手段提供了可能。
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本文内容
摘要
摘要
动脉粥样硬化是一种累及中等和大血管的慢性炎症过程，其特征是形成斑块，斑块由泡沫细胞、免疫细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞、血小板、细胞外基质以及富含脂质的核心组成，并伴有周围组织的广泛坏死和纤维化1。固有免疫和适应性免疫在动脉粥样硬化的起始、发展和持续过程中均发挥重要作用2,3。大量证据表明，在健康小鼠和易发动脉粥样硬化小鼠的主动脉中均存在不同亚群的免疫细胞，例如巨噬细胞、树突状细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞4。此外，在主动脉外膜周围也发现有免疫细胞存在，提示该组织在动脉粥样形成过程中具有重要作用2。
长期以来，针对不同类型免疫细胞的定量检测、其活化状态以及主动脉壁内的细胞组成的研究，在动脉粥样硬化领域主要受限于RT-PCR和免疫组织化学方法。尽管已有少数研究尝试在人主动脉样本中进行流式细胞术分析，但存在诸多问题，例如较高的自发荧光现象，已有文献对此进行了报道5,6。既往研究中，采用胶原酶1消化人动脉粥样硬化斑块，收集游离细胞后通过CD14+/CD11c+染色以识别巨噬细胞来源的泡沫细胞。在该研究中，使用了一个“虚拟”通道以避免假阳性染色6。然而，在消化过程中积累的坏死物质会产生大量碎片，导致主动脉样本中出现强烈的自发荧光。为解决这一问题，曾提出采用一系列阳性和阴性对照，但在这些样本中仅能实现双重染色。我们已开发出一种基于流式细胞术的新方法7，可用于分析健康及易发动脉粥样硬化主动脉中免疫细胞的组成，并表征免疫细胞的活化、增殖与分化状态。该方法使得对主动脉壁免疫细胞组成的深入研究成为可能，并为应用广泛的免疫学技术探讨该疾病的免疫学特征开辟了新途径。
方案
1. 小鼠主动脉的分离
使用小鼠进行实验需获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
- 通过将1000单位肝素钠加入50 ml PBS中并倒置混匀，制备含肝素的PBS。为待采集的血液准备一个空收集管，为每根待采集的主动脉准备一个含PBS的收集管。所有管子均置于冰上保存。
- 准备用于采血的肝素化注射器（0.1 ml浓度为1000 U/ml的肝素钠），并准备好手术器械（两把弯镊、一把解剖剪和一把显微剪）以及解剖用解剖板。
- 按照美国国立卫生研究院（NIH）及机构IACUC委员会关于啮齿类动物安乐死的政策，使用经批准的二氧化碳安乐死装置对小鼠实施安乐死。在将小鼠转移至解剖板前，确认安乐死效果。
- 用70%乙醇短暂浸泡小鼠，并将其固定在解剖板上。通过心脏穿刺法从小鼠体内采集血液。
- 打开腹腔和胸腔。使用装有25号针头的10 ml注射器，经心脏穿刺以含2%肝素的PBS彻底灌注血管系统，完全清除血管内的血液。确保主动脉组织内无残留血液。灌注过程应缓慢进行，压力宜低，以保证血管壁上的所有斑块保持完整。
- 解剖并移除内脏器官、泌尿生殖器官、膈肌和脾脏，保留肾脏、心脏和主动脉完整。
- 小心剥离主动脉周围的脂肪组织和主动脉旁淋巴结，保持主动脉及其外膜完整。采集整段主动脉，包括主动脉弓、升主动脉、降主动脉、胸主动脉和腹主动脉部分。将分离出的主动脉放入含PBS的收集管中。在分离....
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讨论
本文介绍了一种基于流式细胞术的方法，用于研究小鼠主动脉中的免疫细胞组成。该方法的主要优势在于能够在单细胞水平上分析主动脉免疫细胞，并表征主动脉白细胞的活化状态。此方法不仅限于小鼠主动脉，我们（未发表数据）及其他研究者10已采用该方法分析人类样本，如内乳动脉、主动脉瓣和冠状动脉。该方法的一个局限性是从小鼠单根主动脉中回收的白细胞数量相对较少。尽管从单根动脉粥样硬化主动脉中获得的白细胞数量足以进行流式细胞术实验，但在单个主动脉细胞悬液中，丰度较低的细胞可能难以检测。如有必要，可通过合并2-4根主动脉的样本进行流式细胞术染色，以克服这一问题。此外，由于酶处理可能影响表面抗原的表达，因此应对所有目标抗原的耐酶处理能力进行测定。我们此前已验证了多个不受酶消化影响的抗原标记物7。然而，在用于流式细胞术实验前，未验证的抗体克隆应由研究者自行验证其适用性7。
竞争性过继转移归巢实验是一种用于分析白细胞向炎症部位募集的动力学和机制的强有力方法。我们成功应用了对受体小鼠主动脉进行流式细胞术分析的方法，以研究白细胞向主动脉迁移的机制。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究工作由美国国立卫生研究院基金（PO1 HL55798，授予 K.L.）和美国心脏协会科学家发展基金（0525532U，授予 E.G.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胶原酶 XI | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| DNase I，II 型 | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| 胶原酶 I | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| 胶原酶 II | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| 弹性蛋白酶 | Worthington Biochemical | LS002292 |
参考文献
- Lusis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407, 233-2341 (2000).
- Galkina, E., Ley, K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).
- Hansson, G. K., Libby, P.
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