Rat mesenterium Angiogenese Assay

Summary

Normale volwassen gevasculariseerde weefsel van zoogdieren die fysiologische angiogenese en die mist nog niet is blootgesteld aan chirurgische ingreep wordt gebruikt om te bestuderen: (i) de instelling en ontwikkeling van angiogenese na intraperitoneale toediening van test-agenten, en (ii) wijziging van angiogenese na systemische toediening van geselecteerde test agenten.

Abstract

De volwassen rat mesenterium venster angiogenese assay is biologisch passend en is bij uitstek geschikt voor de studie van kiemen angiogenese in vivo [zie review papers], dat is de dominante vorm van angiogenese in de menselijke tumoren en niet-tumor weefsel, zoals besproken in uitgenodigde herziening papers ^1,2. Angiogenese geïnduceerd in het membraneuze mesenteriale onderdelen door intraperitoneale (ip) injectie van een pro-angiogene factor kan gemoduleerd worden door subcutane (sc), intraveneus (iv) of orale (po) behandeling met het wijzigen agenten van keuze. Elk membraneuze deel van het mesenterium is doorschijnend en omlijst door vetweefsel, waardoor het een window-achtige uitstraling.

De test heeft de volgende gunstige eigenschappen: (i) de test weefsel is native gevasculariseerd, zij het ​​mondjesmaat, en omdat het is extreem dun, het microvessel netwerk is zo goed als twee-dimensionale, waardoor het hele netwerk om microscopisch worden beoordeeld in situ; ( ii) bij volwassen ratten de test weefsel mist belangrijke fysiologische angiogenese, die de meeste normale volwassen weefsels zoogdieren kenmerkt, de mate van inheemse vascularisatie is echter gecorreleerd met de leeftijd, zoals besproken in ^een, (iii) het verwaarloosbaar niveau van de trauma-geïnduceerde angiogenese zorgt voor een hoge gevoeligheid, (iv) de test een replica van de klinische situatie, aangezien de angiogenese-modulerende testen drugs zijn systemisch toegediend en de responsen waargenomen weerspiegelen het netto-effect van alle metabolische, cellulaire en moleculaire veranderingen veroorzaakt door de behandeling, (v) de assay kunnen evaluaties van objectieve, kwantitatieve, onpartijdige variabelen van microvasculaire ruimtelijke uitbreiding, dichtheid, en netwerk patroonvorming, evenals van capillaire kiemen, waardoor robuuste statistische analyses van de dosis-effect en moleculaire structuur-activiteit relaties, en (vi ) de test laat zien met een hoge gevoeligheid van de toxische of schadelijke effecten van behandelingen op het gebied van verminderde mate van fysiologische lichaamsgewicht te winnen, als volwassen ratten groeien robuust.

Mast-cel-gemedieerde angiogenese werd voor het eerst aangetoond met behulp van deze test ^3,4. Het model toont een hoge mate van discriminatie ten aanzien van dosis-effect relaties en de gemeten effecten van systemisch toegediende chemisch of functioneel nauw verwante drugs en eiwitten, waaronder: (i) een lage dosering, metronomically toegediende standaard chemotherapeutica dat diverse, drug-specifieke effecten opleveren (dat wil zeggen, angiogenese-onderdrukkende, neutraal of angiogenese-stimulerende activiteiten ^5), (ii) natuurlijke ijzer-onverzadigde humaan lactoferrine, dat VEGF-A-gemedieerde angiogenese ⁶ stimuleert, en natuurlijk ijzer-onverzadigde runderen lactoferrine, dat remt VEGF-A- gemedieerde angiogenese ^7, en (iii) een laag-moleculair-gewicht heparine fracties geproduceerd door verschillende manieren ^8,9. Bovendien is de test zeer geschikt voor studies naar de gecombineerde effecten op de angiogenese van de agenten die systemisch worden toegediend in een gelijktijdige of opeenvolgende mode.

Het idee van het maken van deze video is ontstaan ​​uit de late dr. Judah Folkman toen hij een bezoek bracht ons laboratorium en was getuige van de methodiek wordt gedemonstreerd.

Overzichtsartikelen (uitgenodigd) bespreken en de beoordeling van de test

Norrby, K. In vivo modellen van angiogenese. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).

Norrby, K. Drug testen met angiogenese modellen. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Protocol

1. Dieren

1. Kleine knaagdieren, zoals ratten, muizen en cavia's, zijn gebruikt als de diermodellen. Helaas, volwassen muizen (veel muizenstammen zijn beoordeeld) hebben de neiging om geen of slechts een zeer gering aantal potentiële-ouder microvaten (waarvan angiogenese kan afkomstig zijn) binnen hun mesenteriale vensters, waardoor studies met muizen onbetrouwbaar. Daarom heeft de test is ontwikkeld in de eerste plaats voor ratten.
2. De ratten, die met een standaard omgeving geacclimatiseerd gedurende ten minste 7 dagen na levering van de fokker, worden meestal ondergebracht in paren in een standaard kooi onder een 12-uurs licht / donker cyclus met vrije toegang tot water en pellets. Elk dier is gemarkeerd. We maken gebruik van veelal jonge volwassen ratten (meestal 7-10 weken oud van verschillende stammen, maar meestal mannelijke Sprague-Dawley ratten, bij ratten jonger dan 5-6 weken oud is het aantal inheemse microvaten doorgaans laag), verkregen uit diverse fokkers. In de periode voorafgaand aan het experiment en de rest van het experiment, worden de dieren gewogen om de dag, en altijd op de dag van het offer. Wanneer de dieren worden behandeld gelijktijdig ip (voor de inductie van angiogenese, zie hieronder) en sc of iv of po, ze zijn gewogen per dag. Dit maakt het opzetten van experimentele en controlegroepen van gelijke lichaamsgewicht bij de start van het experiment, en maakt de controle van de invloed van de behandeling op lichaamsgewicht-gain in de loop van het experiment. Omdat volwassen mannelijke ratten groeien robuust fysiologisch (het verkrijgen van ongeveer 40-60 g per week afhankelijk van het type stam), gewicht-gain retardatie is een gevoelige vervanger marker van toxiciteit, systemische welzijn, anorexia, en het niet gedijen.

Wij werken in een high-standaard dier zorgcentrum en aanzienlijke inspanningen worden gedaan om de niveaus van stress ervaren door de dieren te minimaliseren. De huidige ethische richtlijnen die zijn vastgesteld door de Workman P. et al.. (Richtlijnen voor het welzijn en het gebruik van dieren in het kankeronderzoek. Br. J. Cancer 102, 1555-1577, 2010). De Animal Ethics Committee van de Universiteit van Göteborg goedgekeurde deze studies.

2. Pro-angiogene intraperitoneale behandeling

1. De kandidaat pro-angiogene factor te testen is opgelost en verdund in het endotoxine-vrije zoutoplossing gebruikt voor intraveneuze infusie van de patiënten (zelfs bij extreem lage niveaus, endotoxine is pro-angiogene). Alle oplossingen zijn opgebouwd uit vers op de dag van de injectie, steriel gefiltreerd (Millipore 0,22-um filtratie), gecontroleerd voor de neutrale pH (7.1 tot 7,3), en worden gebruikt bij kamertemperatuur.
   De test-agent wordt geïnjecteerd bij lage of zeer lage concentraties. Bijvoorbeeld, rat rVEGF ₁₆₄ (564-RV/CF, R & D Systems Europe, Ltd, Oxon, Verenigd Koninkrijk) is, dat is de belangrijkste VEGF-A isovorm bij ratten, verdund tot 96 pmol / ml in endotoxine-vrij zout, bevroren en ontdooid en een volume van 5 ml wordt geïnjecteerd ip in de rat. We maken gebruik van een 5-ml spuit met 0,8-mm naald (groene naald, 21G) voor ip injectie. Deze behandeling, tweemaal daags voor 4,5 dagen, dwz., Vanaf maandag 's ochtends (dag 0) tot en met vrijdag ochtend (dag 4), veroorzaakt een stevige kiemen angiogenese reactie in de mesenteriale-test weefsel, met een piek rond dag 21.
   Het beheer van de oplossing ip zorgt ervoor dat het volledige volume wordt geleverd in de buikholte (en niet in de darmen, blaas of een ander orgaan). De snelle injectie van 5 ml kan tactiele bevestiging door de exploitant dat het fluïdumstraal heeft doorgegeven via de buikwand in de buikholte.
   Na de, voorafgaand aan of tegelijkertijd met het ip pro-angiogene behandeling, kan elke testen agent van de keuze systemisch worden toegediend.

3. Systemische Administation van angiogenese-modulerende Agents

1. Elke andere route dan de ip route kan worden gebruikt, omdat ip behandeling kan de lopende angiogene reactie door de inductie van de ontsteking of mogelijk door het activeren van mestcellen in de test weefsel, wat kan leiden tot een sterke pro-angiogene respons beïnvloeden. Naast de orale toediening of een enkele injectie sc of iv, we vaak gebruik van subcutane toediening met behulp van osmotische minipompen (een of meer, met wisselende volumes en pompen keer) om de oplossing bij een constante snelheid te leveren voor maximaal twee of meerdere weken.
2. Continue subcutane infusie van test-agenten
   Vullen en implantatie van osmotische minipompen
   Meestal op dag 5, dat wil zeggen, een dag na het einde van het ip VEGF-behandeling, osmotische minipompjes (bijvoorbeeld Model 2ML2, met een constante pompsnelheid van 5,0 pl / h voor 14 tot 15 dagen; Alzet Osmotische Pompen, Mountain View, CA , USA) zijn gevuld onder steriele omstandigheden met de test agent of het juiste voertuig. Na opslag in steriele 0,9% (w / v) NaCl 's nachts bij 37 ° C, de pomp (s) zijn chirurgisch geïmplanteerd sc op de rug (aan de zijkant van de wervelkolom Column in de regio van de scapulae) van ratten die zijn verdoofd met behulp van isofluraan gas (Isoba dierenarts, Schering-Plough Animal Health, Merck & Co, Inc, Whitehouse Station, NJ, USA) in eerste instantie, in een luchtdichte transparante kamer en vervolgens via een masker (om de stress veroorzaakt aan de volgende dierlijke minimaliseren, is de kamer gespoeld met lucht voordat het wordt hergebruikt). De huid incisie gemaakt voor pomp implantatie wordt gehecht onmiddellijk na de implantatie met behulp van zijden draad.
   Omdat de dieren fysiologisch gewichtstoename tijdens de experimentele periode en de te testen middelen worden toegediend met een constante snelheid, de feitelijke dosering geselecteerd voor een test drug per kg lichaamsgewicht is hoger dan het gemiddelde dosering bij het begin van de infusie periode en is lager dan de gemiddelde dosering aan het eind van de infusie periode.
   Continu infuus, zoals hier beschreven, kan worden gezien als een uitgebreide vorm van metronomische behandeling.

4. Het beëindigen van de Experiment

1. Een dier op een moment wordt geplaatst in een transparante luchtdichte kamer, die wordt gespoeld met CO _2-gas, die snel doodt het dier. De kamer wordt gespoeld met lucht voordat zij opnieuw worden gebruikt.

5. Oogsten weefselmonsters

1. Zoals weergegeven in de dvd, is de buikwand geopend en de kleine-darm mesenterium is geïdentificeerd, inclusief de meest distale deel dat de ileo-cecal ventiel (de kruising van de dunne darm en de dikke darm) bereikt. Vier (of meer) van de meest distaal gelegen "windows" zijn genummerd en verspreid op objectieve standaard onbehandeld Superfrost Plus-slides (DAKO Denmark A / S, Glostrup, Denemarken). Het is belangrijk om te voorkomen dat, indien mogelijk, besmetting van de monsters met bloed, darminhoud of andere lichaamsvloeistoffen, omdat deze materialen kan worden gekleurd niet-specifiek, maar dit doet niet af aan de daarop volgende immunohistochemische visualisatie van haarvaten.
2. Elke mesenteriale venster monster met aangehechte kleine darm segment is verspreid op een dia en gedroogd bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Daarna wordt de darm stomp afgesneden, terwijl de intacte vliezige mesenterium monsters worden bewaard bij -20 ° C voor langere perioden. Dit wordt getoond in de DVD.

Hierbij moet worden opgemerkt dat de weefsel en bloedvaten octrooi kunnen worden gevisualiseerd voor de oogst met doorvallend licht intravitale microscopie.

6. Protocol voor immunohistochemische kleuring van microvaten

1. Dag 0
   De monsters mogen van -20 ° C ontdooien tot kamertemperatuur gedroogd in een kast bij 60 ° C gedurende 1 uur, en bewaard bij kamertemperatuur gedurende de nacht.
2. Dag 1
   Plaats de objectglaasjes in kleuring slide houders (in elke tweede spoor) in een kleuring pot en was twee keer met TBS (pH 7,8) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De oplossing is weggegooid en vervangen door de volgende oplossing, en zo verder voor alle volgende stappen.
3. Trypsine behandeling
   Vul de kleuring potje dat de kleuring diahouder zal de haven met trypsine-oplossing (25 ° C gedurende 20 minuten). Gooi de oplossing en incubeer tweemaal met 2,5% sucrose oplossing (kamertemperatuur gedurende 10 minuten per keer). Gooi de oplossing weg en spoel een paar keer in aqua dest (kamertemperatuur gedurende een paar minuten elk).
4. Het blokkeren van
   Vul de kleuring potje dat de kleuring diahouder zal de haven met 0,5% H ₂ O ₂ in methanol (kamertemperatuur gedurende 30 minuten). Gooi de oplossing en spoel na met gedestilleerd water (kamertemperatuur gedurende een paar minuten). Gooi de oplossing weg en spoel tweemaal met TBS (pH 7,4) (kamertemperatuur gedurende 8 minuten per keer).
5. Incubatie
   Alle incubaties zijn in een vochtige kamer bij kamertemperatuur. Ongeveer 150 pi van elk van de onderstaande oplossingen worden gebruikt per slide. De dia's worden geplaatst in een bevochtigde kamer en de oplossingen zijn gepipetteerd op de monsters (de niet-membraneuze onderdelen hoeven niet te worden gedekt door de oplossingen).
   Voor elk van de volgende stappen, schud voorzichtig korting op alle van de oplossing voor de volgende oplossing wordt toegevoegd.
   1. Incubatie met Normaal (blocking) serum (paard) (ABC kit) 3 druppels gele oplossing / 10 ml verdunning buffer gedurende 20 minuten.
   2. Incubatie met primair antilichaam ARU0181, die rat vasculaire endotheliale cellen labels. Het antilichaam wordt verdund met verdunning 1:600 ​​buffer (Biosource) (100 ul verdund 40-voudige [bevroren], plus 900 ul verdunning buffer) en incubatie vindt plaats overnacht bij 4 ° C.
6. Dag 2
   De dia's worden verwijderd uit de vochtige kamer, is het primaire antilichaam verwijderd, en de dia's worden geplaatst in een kleuring diahouder, dat is ondergedompeld in de kleuring pot en twee keer gespoeld met TBS(PH 7,8) gedurende 8 minuten.
   1. Incubatie met gebiotinyleerde antilichaam (ABC kit)
      De dia's worden horizontaal geplaatst in een bevochtigde kamer en geïncubeerd met een druppel blauwe oplossing / 10 ml verdunning buffer gedurende 30 minuten. Gooi de oplossing weg en plaats de dia's in een kleuring diahouder ondergedompeld in de kleuring pot en spoel tweemaal met TBS (pH 7,4) gedurende 8 minuten.
   2. Incubatie met de ABC-reagens
      De dia's zijn weer horizontaal geplaatst in een bevochtigde kamer en de volgende oplossingen zijn gepipetteerd op de membraneuze delen van de monsters: 2 druppels oranje oplossing plus 2 druppels van bruine oplossing / 10 ml TBS (pH 7,4) gedurende 30 minuten. Meng zorgvuldig 30 minuten voor gebruik! Gooi de oplossing weg en plaats de dia's in de diahouder in de kleuring pot en spoel tweemaal met TBS (pH 7,4) gedurende 8 minuten.
7. Kleuring met DAB (0,05%)
   Deze stap moet worden uitgevoerd in een geventileerde chemische kap!
   Plaats de dia's en voeg de 3,3-diaminobenzidine (DAB, Sigma-Aldrich)-oplossing met een pipet: 0,1% DAB-oplossing in TBS (pH 7,4) [bevroren] wordt verdund 1:1 met een mengsel van 10 pi H ₂ O ₂ en 7,5 ml TBS (pH 7,4). Deze oplossing is steriel gefiltreerd net voor gebruik (om eventuele deeltjes die de microscopische beeld kan obscure te elimineren). Vlekken op de monsters voor 8 minuten. Gooi de oplossing weg en plaats de dia's in de kleuring diahouder ondergedompeld in de kleuring pot. Spoel onder stromend water en vervolgens in aqua dest voor een paar minuten.
8. Uitdroging
   De dia's worden bewaard in de vlekken diahouder. Spoelen van het weggooien en opnieuw vullen van de vlekken pot met aqua dest / ethanol: aqua dest, 70% alcohol, 95% alcohol, absolute alcohol, met 2 minuten in elke oplossing.

7. Imaging en het inschatten van de microvasculaire netwerk in elke Mesenteriale Window Specimen Na immunohistochemische kleuring van de vasculaire endotheliale cellen

Zoals te zien in de film, zijn microvaten microscopisch gevisualiseerd in situ in het intacte weefsel.

1. Ten eerste gebruiken we een tekening microscoop met vergroting variëren van 14 tot 34 (Leica Wild M 3Z) om potlood op wit papier het gehele venster gebied, evenals de gehele gevasculariseerde gebied (VA) per mesenteriale venster. VA, als percentage van het hele gebied, is gemakkelijk te meten met behulp van geautomatiseerde of niet-geautomatiseerde planimetrie (of simpelweg door te snijden uit en weging van de afbeelding van het hele venster, en de beelden van al haar gevasculariseerd delen).
2. Met behulp van een andere tekening microscoop, individuele microvessel profielen, die gemakkelijk worden geïdentificeerd, zijn getekend in zwarte inkt op wit papier bij 80 vergroting in willekeurig gekozen gebieden. Dit is het uitgangspunt voor de daaropvolgende geautomatiseerde morfometrische beoordeling van microvasculaire lengte (MVL), die in feite een meting van de microvasculaire dichtheid.
3. Optioneel, variabelen met betrekking tot microvasculaire patroonvorming, kan evenals die voor de beoordeling van het aantal microvasculaire spruiten en de lengte van de individuele microvasculaire spruiten (nr. SP en Le. SP, respectievelijk) worden bepaald. -De optimale contrast tussen de afgebeelde zwarte schip structuren en de witte achtergrond maakt gedetailleerde analyses van de beelden in de meeste commerciële morfometrische geautomatiseerde programma's.
4. In de meeste gevallen zijn de belangrijkste variabelen zijn VA en MVL, die bij elkaar vermenigvuldigd genereren van de totale lengte van microvasculaire (TMVL).

8. Statistische analyse

We meestal gebruik van de standaard niet-parametrische Mann-Whitney U-test om ongepaarde (tweezijdig) waarnemingen te analyseren. Een gemiddelde van vier mesenteriale ramen per dier wordt gebruikt als de onafhankelijke data-punt voor elke variabele van de mesenteriale venster. Het criterium voor de statistische significantie is P ≤ 0,05.

Discussion

De test werd geïntroduceerd in 1986 ³ en is achtereenvolgens verder ontwikkeld en verfijnd in ons laboratorium ^7,10-12. Zoals besproken in review papers (uitgenodigde) ^{1, 2,} de test vergelijkt goed met andere zoogdieren in vivo angiogenese assay in name gelet op belangrijke functies, zoals de volwassen-test weefsel is native gevasculariseerd en mist fysiologische angiogenese, minimaal trauma, indien van toepassing, is toegebracht aan het weefsel; echt kwantitatieve variabelen worden gemeten, wat een goede statistische analyse met betrekking tot de dosis-respons en moleculaire-activiteit studies mogelijk maakt; kiemen angiogenese voordoet, die overwegend in normale weefsels en tumoren, en toxiciteit zijn eenvoudig opgebouwd in ratten die robuust groeien fysiologisch op volwassen leeftijd. Nadelig functies kunnen zijn het feit dat de test is relatief veel tijd in beslag, in het bijzonder bij de beoordeling van het aantal en de lengte van de individuele microvessel segmenten en microvessel spruiten, dat het niet real-time/serial waarnemingen mogelijk te maken; en dat is nauwelijks geschikt voor muizen omdat veel mesenteriale ramen in muizen gebrek aan potentiële ouder haarvaten van waaruit nieuwe haarvaten kan ontstaan.

Real-time waarnemingen zijn echter mogelijk gemaakt door intravitale microscopie, waar de exteriorized maar intact mesenteriale ramen zijn uit gespreid over een microscoop podium terwijl het dier onder narcose is, zoals besproken in ^een.

Aanzienlijke vooruitgang in angiogenese onderzoek zijn bereikt in de afgelopen decennia met behulp van modellen zoals de hoornvlies micropocket, chick chorion-membraan, en sc Matrigel plug assays, die nuttig zijn, maar uiteindelijk beperkt tools. Toekomstige klinische toepassingen van anti-angiogene en pro-angiogene therapieën noodzakelijk de vestiging en de validatie van meer gevoelige en biologisch relevante, echt kwantitatieve pre-klinische modellen, zoals die wordt beschreven in het huidige rapport.

Materials

Buffers and reagents

0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.

Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

TBS (pH 7.4) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2) Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).

Sucrose solution 2.5% Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).

Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4) Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).

Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide (Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).

ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer. Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer. ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).

Mix these solutions 20 minutes before use!

Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)

This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.

Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.

Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503). DAB= 3,3’-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015). Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665). Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)