Assay Rat angiogenèse Mésentère

Summary

Adulte normale vascularisé tissus de mammifères qui manque de l'angiogenèse physiologique et qui n'a pas été exposé à une intervention chirurgicale est utilisée pour étudier: (i) l'initiation et le développement de l'angiogenèse après administration intrapéritonéale d'agents de test, et (ii) la modification de l'angiogenèse après l'administration systémique de certains agents de test.

Abstract

Le mésentère de rat adulte angiogenèse fenêtre de dosage est biologiquement appropriée et est exceptionnellement bien adapté à l'étude de l'angiogenèse in vivo [voir les articles de synthèse], qui est la forme dominante de l'angiogenèse dans les tumeurs humaines et non-tumorale des tissus, comme nous le verrons dans l'examen des invités les documents ^1,2. L'angiogenèse induite dans les parties membraneuses mésentérique par voie intrapéritonéale (IP) d'injection d'un facteur pro-angiogénique peut être modulée par voie sous-cutanée (sc), par voie intraveineuse (IV) ou orale (po) le traitement avec des agents modificateurs de choix. Chaque partie membraneuse du mésentère est translucide et encadrées par du tissu adipeux, ce qui lui donne une apparence de la fenêtre ressemblant.

Le test a les caractéristiques avantageuses suivantes: (i) le tissu test est nativement vascularisé, quoique faiblement, et depuis il est extrêmement mince, le réseau de microvaisseaux est pratiquement en deux dimensions, ce qui permet à l'ensemble du réseau pour être évalué au microscope in situ; ( ii) chez des rats adultes le tissu test manque significative l'angiogenèse physiologique, qui caractérise la plupart des adultes normaux des tissus de mammifères, le degré de vascularisation native est, cependant, en corrélation avec l'âge, tel que discuté dans ^1; (iii) le niveau négligeable de l'angiogenèse induite par un traumatisme assure une sensibilité élevée, (iv) le dosage reproduit la situation clinique, selon le test de médicaments modulant l'angiogenèse sont administrés par voie systémique et les réponses observées reflètent l'effet net de toutes les voies métaboliques, cellulaires et moléculaires des altérations induites par le traitement, (v) le dosage permet d'évaluations objectives, quantitatives, les variables sans biais de l'extension spatiale microvasculaire, la densité et la formation de structures de réseau, ainsi que des capillaires germination, permettant ainsi des analyses statistiques robustes de la dose-effet et moléculaires relations structure-activité, et (vi ) le dosage révèle avec une grande sensibilité aux effets toxiques ou nocifs des traitements en termes de diminution du taux de physiologiques gain de poids corporel, comme des rats adultes une croissance vigoureuse.

Mât-à médiation cellulaire angiogenèse a été démontrée en utilisant ce dosage ^3,4. Le modèle démontre un haut niveau de discrimination quant à la posologie à effet et les effets mesurés de la systémique administré chimiquement ou fonctionnellement médicaments étroitement liés et les protéines, y compris: (i) à faible dose, administré metronomically chimiothérapeutiques standard de rendement diversifié, la drogue les effets spécifiques (ie, les activités de l'angiogenèse suppressif, neutre ou angiogenèse stimulation ^5), (ii) les risques naturels en fer-insaturés de la lactoferrine humaine, ce qui stimule le VEGF-A-médiée angiogenèse ^6, et naturel de fer-insaturés lactoferrine bovine, qui inhibe le VEGF-A- angiogenèse médiation ^7, et (iii) les fractions d'héparine de faible poids moléculaire produite par des moyens divers ^8,9. Par ailleurs, le dosage est très adapté à des études sur les effets combinés sur l'angiogenèse d'agents qui sont administrés par voie systémique de façon simultanée ou séquentielle.

L'idée de faire cette vidéo provient de la fin du Dr Judah Folkman quand il a visité notre laboratoire et témoin de la méthodologie d'être démontrée.

Examen des documents (invité) discuter et évaluer le dosage

Norrby, K. Dans des modèles in vivo de l'angiogenèse. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).

Norrby, K. Le dépistage des drogues avec des modèles de l'angiogenèse. Expert Opin. Drogues. Découvert. 3, 533-549 (2008).

Protocol

1. Animaux

1. Les petits rongeurs comme les rats, souris et porcs Guinée, ont été utilisés comme des modèles animaux. Malheureusement, les souris adultes (de nombreuses souches de souris ont été évalués) ont tendance à manquer ou qui n'ont qu'un très faible nombre de potentiels-parent microvaisseaux (à partir de laquelle l'angiogenèse peuvent provenir) au sein de leurs fenêtres mésentériques, ce qui rend les études utilisant des souris non fiables. Par conséquent, le dosage a été développé principalement pour les rats.
2. Les rats, qui sont acclimatés à un environnement standard d'au moins 7 jours suivant la livraison de l'éleveur, sont généralement logés par paires dans une cage standard sous un 12-hr cycle lumière / obscurité avec libre accès à l'eau et de granulés. Chaque animal est marqué. Nous utilisons principalement des rats adultes jeunes (70-10 typiquement semaines d'âge des différentes souches, mais en général des rats Sprague-Dawley; chez les rats jeunes que 5-6 semaines d'âge, le nombre des microvaisseaux autochtones ont tendance à être faible) obtenu auprès d'éleveurs diversifiés. Dans la période antérieure à l'expérience et à travers l'expérience, les animaux sont pesés tous les deux jours, et toujours sur le jour du sacrifice. Lorsque les animaux sont traités simultanément IP (pour l'induction de l'angiogenèse, voir ci-dessous) et SC ou IV ou PO, ils sont pesés chaque jour. Cela permet la création de groupes expérimentaux et de contrôle du poids du corps égale au début de l'expérience, et permet la surveillance de l'influence du traitement sur le poids corporel de gain au cours de l'expérience. Depuis des rats mâles adultes croissance robuste physiologiquement (gagne environ 40-60 g par semaine selon le type de souche), le gain de poids de retard est un marqueur de substitution sensible de la toxicité, systémique bien-être, l'anorexie, et un retard de croissance.

Nous travaillons dans un établissement de haute qualité des soins aux animaux et des efforts considérables sont faits pour minimiser les niveaux de stress subi par les animaux. Les directives actuelles éthiques sont ceux établis par Workman P. et al. (Lignes directrices pour la protection et l'utilisation des animaux dans la recherche contre le cancer. Br. J. Cancer 102, 1555-1577, 2010). Le Comité d'éthique animale de l'Université de Göteborg a approuvé ces études.

2. Pro-angiogéniques traitement par voie intrapéritonéale

1. Le candidat pro-angiogéniques facteur à tester est dissoute et diluée dans l'endotoxine saline utilisée pour la perfusion des patients (même à des niveaux extrêmement bas, l'endotoxine est pro-angiogénique). Toutes les solutions sont constitués fraîchement sur le jour de l'injection, une filtration stérile (Millipore 0,22 um-filtration), contrôlé pour un pH neutre (07/01 au 07/03), et utilisé à température ambiante.
   L'agent de test est injecté à des concentrations faibles ou très faibles. Par exemple, le rat rVEGF ₁₆₄ (564-RV/CF; R & D Systems Europe, Ltd, Oxon, UK), qui est le VEGF-A prédominante isoforme chez le rat, est dilué à 96 pmol / ml dans une solution saline sans endotoxines, congelés et décongelés et un volume de 5 ml est injecté ip dans le rat. Nous utilisons une seringue de 5 ml avec 0,8 mm d'aiguille (aiguille verte, 21G) pour injection ip. Ce traitement, administré deux fois par jour pendant 4,5 jours, soit., À partir de lundi matin (jour 0) au vendredi matin (jour 4), induit une réponse robuste angiogenèse germination dans les tissus de test mésentériques, avec un pic aux alentours de la Journée 21.
   Administrer l'ip solution garantit que la totalité du volume est livré dans la cavité péritonéale (et non dans les intestins, la vessie ou de tout autre organe). L'injection rapide de 5 ml permet de confirmer tactiles par l'opérateur que le jet de fluide est passé à travers la paroi abdominale dans la cavité abdominale.
   Après, avant ou simultanément avec l'ip pro-angiogéniques de traitement, tout agent de test de choix peuvent être administrés par voie systémique.

3. Administation systémique de l'angiogenèse modulant agents

1. Toute autre voie que la voie IP peut être utilisée, puisque le traitement IP peut affecter la réaction en cours angiogéniques par l'induction de l'inflammation ou éventuellement en activant les mastocytes dans les tissus d'essai, qui peut conduire à une forte pro-angiogéniques de réponse. Outre l'administration orale ou injection SC ou IV, nous utilisons souvent l'administration SC en utilisant mini-pompes osmotiques (un ou plusieurs, avec des volumes variables et de pompage fois) pour fournir la solution à un taux constant jusqu'à deux ou plusieurs semaines.
2. La perfusion continue sous-cutanée d'agents de test
   Remplissage et l'implantation de mini-pompes osmotiques
   Habituellement le jour 5, c'est à dire, un jour après la fin du traitement VEGF IP, mini-pompes osmotiques (par exemple, le modèle 2ML2, avec un taux de pompage constant de 5,0 l / h pour les 14-15 jours; Alzet pompes osmotiques, Mountain View, CA , USA) sont remplies dans des conditions stériles avec l'agent d'essai ou le véhicule approprié. Après stockage dans stérile à 0,9% (p / v) de NaCl nuit à 37 ° C, la pompe (s) sont implantés chirurgicalement sc sur le dos (sur le côté de la moelle épinière Column dans la région des omoplates) de rats qui ont été anesthésiés à l'aide de gaz isoflurane (EFP Isoba; Schering-Plough Santé Animale, Merck & Co., Inc, Whitehouse Station, NJ, USA), d'abord dans une chambre étanche transparent et puis par un masque (pour minimiser le stress causé à l'animal suivant, la chambre est rincée avec de l'air avant qu'il soit réutilisé). L'incision cutanée faite pour l'implantation de la pompe est suturée immédiatement après l'implantation à l'aide du fil de soie.
   Depuis la prise de poids des animaux physiologiquement pendant la période expérimentale et les agents de test sont administrés à un taux constant, la dose réelle sélectionné pour un médicament à l'essai par kg de poids corporel est plus élevé que la dose moyenne au début de la période de perfusion et est plus faible que la dose moyenne à la fin de la période de perfusion.
   La perfusion continue, tel que décrit ici, peut être considérée comme une forme étendue du traitement métronomique.

4. Fin à l'expérience

1. Un animal à la fois est placé dans une chambre hermétique transparente, ce qui est rincée avec gaz CO _2, qui tue rapidement les animaux. La chambre est rincée avec de l'air avant d'être réutilisés.

5. La récolte d'échantillons tissulaires

1. Comme indiqué dans le DVD, la paroi abdominale est ouverte et le mésentère petits-intestinale est identifiée, y compris la partie la plus distale qui atteint la valvule iléo-caecale (jonction de l'intestin grêle et le gros intestin). Quatre (ou plus) de la plus distale située «fenêtres» sont numérotées et réparties sur une norme objective non traitée Superfrost Plus-lames (DAKO Denmark A / S, Glostrup, Danemark). Il est important d'éviter, si possible, contaminant les échantillons de sang avec le contenu intestinal, ou d'autres fluides corporels, comme ces matériaux peuvent être colorées de manière non spécifique, mais cela n'invalide pas la visualisation ultérieure immunohistochimique des microvaisseaux.
2. Chaque spécimen fenêtre mésentérique avec le segment intestinal attachés petite est étalé sur une lame et séchées à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, la souche intestinale est coupée, alors que les spécimens intacts mésentère membraneuses sont stockés à -20 ° C pendant des périodes prolongées. Ceci est illustré dans le DVD.

Il convient de mentionner que la vascularisation des tissus et des brevets peuvent être visualisées avant la récolte avec transmise microscopie intravitale lumière.

6. Protocole pour la coloration immunohistochimique des microvaisseaux

1. Jour 0
   Les spécimens sont autorisés à dégeler de -20 ° C à la température ambiante, séché dans une armoire à 60 ° C pendant 1 heure, et conservés à température ambiante jusqu'au lendemain.
2. Jour 1
   Placer les lames dans la coloration détenteurs diapositive (dans chaque piste seconde) dans une cuvette et la laver deux fois avec du TBS (pH 7,8) pendant 10 minutes à température ambiante. La solution est jeté et remplacé par la solution suivante, et ainsi de suite pour toutes les étapes suivantes.
3. Traitement à la trypsine
   Remplir le bocal coloration qui va du port le support de diapositives coloration avec une solution de trypsine (25 ° C pendant 20 minutes). Jeter la solution et incuber à deux reprises avec une solution de saccharose à 2,5% (à température ambiante pendant 10 minutes chaque fois). Jeter la solution et rincer une couple de fois dans l'eau distillée (à température ambiante pendant quelques minutes chacune).
4. Bloquant
   Remplir le bocal coloration qui va du port le support de diapositives coloration avec 0,5% de H ₂ O ₂ dans le méthanol (température ambiante pendant 30 minutes). Jeter la solution et rincer à l'eau distillée (à température ambiante pendant quelques minutes). Jeter la solution et rincer deux fois avec du TBS (pH 7,4) (température ambiante pendant 8 minutes à chaque fois).
5. D'incubation
   Toutes les incubations sont dans une chambre humidifiée à température ambiante. Environ 150 ul de chacune des solutions ci-dessous sont utilisées par diapositive. Les lames sont placées dans une chambre humidifiée et les solutions sont à la pipette sur les spécimens (les parties non-membraneuse n'avez pas besoin d'être couvert par les solutions).
   Pour chacune des étapes suivantes, soigneusement secouer toute la solution avant que la solution suivante est ajoutée.
   1. Incubation avec Normal (blocage) de sérum (de cheval) (kit ABC) 3 gouttes d'une solution jaune / 10 ml de tampon de dilution pendant 20 minutes.
   2. L'incubation avec l'anticorps primaire ARU0181, dont les étiquettes rat cellules endothéliales vasculaires. L'anticorps est dilué 1:600 ​​avec un tampon de dilution (Biosource) (100 ul diluée 40 fois [congelés] ainsi que 900 ul de tampon de dilution) et l'incubation a lieu durant la nuit à 4 ° C.
6. Jour 2
   Les lames sont retirés de la chambre humide, l'anticorps primaire est jetée, et les lames sont placées dans un support de diapositives coloration, qui est immergée dans la cuvette et la rincer deux fois avec du TBS(PH 7,8) pendant 8 minutes.
   1. L'incubation avec l'anticorps biotinylé (ABC kit)
      Les lames sont placées horizontalement dans une chambre humidifiée et incubées avec 1 goutte de solution de bleu / 10 ml de tampon de dilution pendant 30 minutes. Jeter la solution et le lieu de la glisse dans un support de diapositives coloration immergé dans la cuvette et la rincer deux fois avec du TBS (pH 7,4) pendant 8 minutes.
   2. L'incubation avec le réactif ABC
      Les lames sont à nouveau placés horizontalement dans une chambre humidifiée et les solutions suivantes sont à la pipette sur la partie membraneuse des spécimens: 2 gouttes de solution d'orange et 2 gouttes de solution brune SCT / 10 ml (pH 7,4) pendant 30 minutes. Mélanger soigneusement 30 minutes avant utilisation! Jeter la solution et le lieu de la glisse dans le support de diapositives dans la cuvette et la rincer deux fois avec du TBS (pH 7,4) pendant 8 minutes.
7. Coloration avec DAB (0,05%)
   Cette étape doit être réalisée dans une hotte chimique aéré!
   Placer les lames et ajouter le 3,3-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich) solution à l'aide d'une pipette: solution de DAB 0,1% dans du TBS (pH 7,4) [congelés] est dilué 1:1 avec un mélange de 10 ul H ₂ O ₂ et 7,5 ml du SCT (pH 7,4). Cette solution est stérilisée par filtration juste avant utilisation (pour éliminer toutes les particules qui peuvent occulter l'image microscopique). Colorer les spécimens pendant 8 minutes. Jeter la solution et le lieu de la glisse dans le support de diapositives coloration immergé dans la cuvette. Rincer sous l'eau courante puis à l'eau distillée pendant quelques minutes.
8. Déshydratation
   Les lames sont conservées dans le support de diapositives coloration. Rincez en défaussant et le remplissage du bocal contenant l'eau distillée coloration / éthanol: eau distillée, alcool à 70%, 95% d'alcool, l'alcool absolu, avec 2 minutes de chaque solution.

7. Imagerie et l'évaluation du réseau microvasculaire dans chaque échantillon de fenêtre mésentérique Après coloration immunohistochimique des cellules endothéliales vasculaires

Comme le montre le film, les microvaisseaux sont visualisés au microscope in situ dans le tissu intact.

1. Tout d'abord, nous utilisons un microscope dessin avec plage de grossissement de 14 à 34 (Leica M Sauvage 3Z) au crayon sur du papier blanc de la zone de la fenêtre entière, ainsi que toute la zone vascularisée (VA) par la fenêtre mésentérique. VA, comme un pourcentage de toute la région, est facilement mesurée à l'aide planimétrie informatisée ou non informatisé (ou tout simplement en découpant et la pondération de l'image de toute la fenêtre, et les images de toutes ses parties vascularisé).
2. En utilisant une autre microscope à dessin, les profils individuels des microvaisseaux, qui sont facilement identifiables, sont dessinés à l'encre noire sur papier blanc à 80 de grossissement dans les champs choisis au hasard. C'est le point de départ pour l'évaluation ultérieure morphométrique informatisée de la longueur de complications microvasculaires (MVL), qui est essentiellement une mesure de la densité microvasculaire.
3. En option, les variables liées à la formation de structures microvasculaires, ainsi que ceux pour l'évaluation du nombre de germes microvasculaires et la longueur des pousses individuelles microvasculaires (n ° SP et Le. SP, respectivement) peuvent être déterminées. -Le contraste optimal entre les structures représentées bateau noir et le fond blanc facilite les analyses détaillées des images dans la plupart des commerciaux morphométriques des programmes informatisés.
4. Dans la plupart des cas, les principales variables sont VA et MVL, qui, lorsqu'il est multiplié génèrent ensemble de la longueur totale microvasculaires (TMVL).

8. Analyse statistique

Nous utilisons habituellement la norme non-paramétrique de Mann-Whitney U-test pour analyser non apparié (bilatéral) observations. Une moyenne de quatre fenêtres mésentérique par animal est utilisé comme point de données indépendantes pour chaque variable de la fenêtre mésentérique. Le critère de signification statistique est p ≤ 0,05.

Discussion

Le test a été introduit en 1986 ³ et a successivement été développé et affiné dans notre laboratoire ^7,10-12. Comme indiqué dans les articles de synthèse (invité) ^{1, 2,} le test se compare bien à d'autres mammifères dans le dosage angiogenèse in vivo à l'égard en particulier aux fonctions importantes telles que le tissu de test adulte est nativement vascularisé et manque de l'angiogenèse physiologique; un traumatisme minime, le cas échéant, est infligés au tissu; variables réellement quantitatifs sont mesurés, ce qui permet une analyse statistique sur la dose-réponse et moléculaire-activité des études; angiogenèse germination se produit, ce qui est prédominant dans les tissus normaux et de tumeurs, et les données de toxicité sont facilement accumulés chez les rats qui se développent vigoureusement physiologiquement à l'âge adulte. Caractéristiques défavorables peuvent comprendre le fait que le test est relativement fastidieux, surtout lorsque l'évaluation du nombre et la longueur des segments individuels et les choux de microvaisseaux microvaisseaux, qu'il ne permet pas d'observations real-time/serial, et qu'il n'est guère adaptée pour les souris Depuis de nombreuses fenêtres mésentérique chez la souris manque microvaisseaux parent potentiel à partir duquel de nouveaux capillaires peuvent provenir.

Observations en temps réel sont, cependant, permis par microscopie intravitale où les fenêtres extériorisé mais intact mésentériques sont écrasés sur une platine de microscope tandis que l'animal est anesthésié, tel que discuté dans ^1.

Des avancées significatives dans la recherche sur l'angiogenèse ont été réalisés dans les dernières décennies en utilisant des modèles tels que la cornée micropocket, poussin chorioallantoïque membrane, et des dosages sc prise Matrigel, qui sont des outils utiles mais finalement limité. Les futures applications cliniques des thérapies anti-angiogéniques et pro-angiogéniques nécessiter l'établissement et la validation des plus sensibles et biologiquement pertinent, réellement quantitatifs modèles pré-cliniques, telles que celle décrite dans le rapport actuel.

Materials

Buffers and reagents

0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.

Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

TBS (pH 7.4) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2) Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).

Sucrose solution 2.5% Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).

Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4) Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).

Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide (Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).

ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer. Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer. ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).

Mix these solutions 20 minutes before use!

Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)

This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.

Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.

Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503). DAB= 3,3’-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015). Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665). Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)