Biology

चूहा अन्त्रपेशी Angiogenesis परख

Published: June 18, 2011 doi: 10.3791/3078

¹Department of Pathology, Institute of Biomedicine, University of Gothenburg

Summary

सामान्य वयस्क vascularized स्तनधारी ऊतक कि शारीरिक angiogenesis और उस का अभाव शल्य चिकित्सा का अध्ययन किया है हस्तक्षेप करने के लिए उजागर नहीं किया गया: (i) दीक्षा और परीक्षण एजेंटों के intraperitoneal प्रशासन निम्नलिखित angiogenesis के विकास, और (ii) angiogenesis के प्रणालीगत प्रशासन के बाद संशोधन परीक्षण एजेंट चुना गया.

Protocol

1. पशु

चूहों, चूहों और गिनी सूअरों के रूप में छोटे कृन्तकों, पशु मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है. दुर्भाग्य से, वयस्क चूहों (कई माउस उपभेदों का मूल्यांकन किया गया है) की कमी या उनके mesenteric खिड़कियों के भीतर ही संभावित माता पिता microvessels का एक बहुत कम संख्या (जिसमें से angiogenesis पैदा कर सकते हैं), जो अविश्वसनीय चूहों का उपयोग अध्ययन करता है करते हैं. इसलिए, परख चूहों के लिए मुख्य रूप से विकसित किया गया है.
चूहों, जो ब्रीडर से प्रसव के बाद कम से कम 7 दिनों के लिए एक मानक पर्यावरण के लिए acclimatized हैं आमतौर पर एक मानक पिंजरे में जोड़े में एक 12 घंटा पानी और छर्रों के लिए मुफ्त का उपयोग के साथ / प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत रखे. प्रत्येक जानवर के रूप में चिह्नित है. विविध प्रजनकों से प्राप्त; हम ज्यादातर युवा वयस्क (उम्र के 5-6 सप्ताह की तुलना में युवा चूहों में देशी microvessels की संख्या कम हो जाते हैं आम तौर पर विभिन्न उपभेदों के उम्र के 7-10 सप्ताह लेकिन आम तौर पर पुरुष Sprague-Dawley चूहों) चूहों का उपयोग करें. और प्रयोग भर में प्रयोग करने से पहले की अवधि में हर दूसरे दिन, पशुओं तौल रहे हैं, और हमेशा बलिदान के दिन पर. जब पशुओं समवर्ती आईपी (angiogenesis के शामिल होने के लिए इलाज कर रहे हैं, नीचे देखें) और सुप्रीम कोर्ट या चार या पुलिस प्रत्येक दिन, वे तौल रहे हैं. यह बराबर शरीर के वजन के प्रयोग के शुरू में प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों की स्थापना के लिए सक्षम बनाता है, और प्रयोग के दौरान शरीर के वजन - लाभ पर उपचार के प्रभाव की निगरानी की अनुमति देता है. चूंकि वयस्क नर चूहों robustly physiologically बढ़ने (लगभग 40-60 ग्राम प्रति सप्ताह पाने के तनाव के प्रकार पर निर्भर करता है), वजन - लाभ मंदता विषाक्तता का एक संवेदनशील स्थानापन्न मार्कर, प्रणालीगत अच्छी तरह से किया जा रहा है, आहार, और विफलता को कामयाब है.

हम एक उच्च मानक पशु देखभाल की सुविधा में काम करते हैं और काफी प्रयास करने के लिए जानवरों द्वारा अनुभव तनाव के स्तर को कम करने के लिए बना रहे हैं. वर्तमान नैतिक दिशा निर्देशों पी. कर्मकार एट अल द्वारा स्थापित उन रहे हैं (कल्याण और कैंसर अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए दिशानिर्देश Br जे. कैंसर. 102, 1555-77, 2010) .. गोटेबोर्ग विश्वविद्यालय के पशु आचार समिति इन अध्ययनों मंजूरी दे दी.

2. समर्थक angiogenic Intraperitoneal उपचार

समर्थक angiogenic उम्मीदवार के लिए परीक्षण किया जा कारक भंग है और endotoxin मुक्त रोगियों के अर्क के लिए इस्तेमाल किया खारा में पतला (भी बेहद कम स्तर पर, endotoxin समर्थक angiogenic है). सभी समाधान बना रहे हैं हौसले इंजेक्शन, बाँझ फ़िल्टर के दिन (Millipore 0.22-सुक्ष्ममापी निस्पंदन) पर, तटस्थ पीएच (7.1-7.3) के लिए जाँच, और कमरे के तापमान पर इस्तेमाल किया.
परीक्षण एजेंट कम या बहुत कम सांद्रता में अंतःक्षिप्त है. उदाहरण के लिए, चूहा rVEGF ₁₆₄ (564-RV/CF, अनुसंधान एवं विकास सिस्टम यूरोप, लिमिटेड Oxon, ब्रिटेन), जो प्रमुख - VEGF एक चूहों में isoform endotoxin मुक्त खारा में 96 pmole / मिलीलीटर पतला है, स्थिर और thawed और 5 मिलीलीटर की मात्रा में चूहे आईपी इंजेक्शन है. हम आईपी इंजेक्शन के लिए सुई 0.8 मिमी (हरी सुई, 21G) के साथ एक 5 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें. इस उपचार, 4.5 दिनों, अर्थात् के लिए दो बार दैनिक दिया, सोमवार की सुबह (0 दिन) से शुक्रवार सुबह (4 दिन) के लिए, एक मजबूत अंकुरण mesenteric परीक्षण ऊतक में angiogenesis प्रतिक्रिया लाती है, लगभग 21 दिवस पर peaking.
समाधान आईपी प्रबंध सुनिश्चित करता है कि पूरी मात्रा peritoneal गुहा (और आंतों, मूत्राशय, या किसी अन्य अंग में नहीं) में कर दिया है. 5 मिलीलीटर की तेजी से इंजेक्शन ऑपरेटर है कि तरल पदार्थ जेट उदर गुहा में पेट की दीवार के माध्यम से पारित कर दिया गया है द्वारा स्पर्श पुष्टि की अनुमति देता है.
के बाद से पहले या आईपी समर्थक angiogenic उपचार के साथ समवर्ती, पसंद के किसी भी परीक्षण एजेंट प्रणालीबद्ध प्रशासित किया जा सकता है.

3. Angiogenesis का नियमन करने एजेंटों के प्रणालीगत Administation

Ip route के अलावा अन्य कोई मार्ग, इस्तेमाल किया जा सकता है क्योंकि आईपी उपचार या परीक्षण ऊतक है, जो एक मजबूत समर्थक angiogenic प्रतिक्रिया करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं में मस्तूल कोशिकाओं को सक्रिय द्वारा संभवतः सूजन की प्रेरण के माध्यम से चल रहे angiogenic प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है. मौखिक प्रशासन या एकल इंजेक्शन सुप्रीम कोर्ट या चार के अलावा, हम अक्सर आसमाटिक minipumps का उपयोग (एक या अधिक मात्रा अलग और बार पंप के साथ) के लिए दो या कई हफ्तों के लिए एक स्थिर दर पर समाधान देने के सुप्रीम कोर्ट प्रशासन का उपयोग.
परीक्षण एजेंटों के सतत चमड़े के नीचे जलसेक
भरना और आसमाटिक minipumps के आरोपण
Alzet आसमाटिक पंप्स, माउंटेन व्यू, सीए, आमतौर पर 5 दिन, यानी, आईपी VEGF उपचार, आसमाटिक minipumps (उदाहरण के लिए, 2ML2 मॉडल, 14-15 दिनों के लिए लगातार 5.0 μl / घंटे की पम्पिंग दर के साथ के अंत के बाद एक दिन पर , संयुक्त राज्य अमरीका) परीक्षण एजेंट या उपयुक्त वाहन के साथ बाँझ शर्तों के तहत भरा जाता है. बाँझ 0.9% (w / v) NaCl 37 पर रात भर में भंडारण के बाद डिग्री सेल्सियस, पंप (ओं) शल्य चिकित्सा पीठ पर सुप्रीम कोर्ट प्रत्यारोपित (रीढ़ की हड्डी colu के पक्ष मेंscapulae के क्षेत्र में करोड़) और चूहों कि anesthetized isoflurane गैस (Isoba पशु चिकित्सक का उपयोग किया गया है, Schering-सप्तऋषि पशु स्वास्थ्य, मर्क एंड कं, इंक, व्हाइटहाउस स्टेशन, न्यू जर्सी, संयुक्त राज्य अमेरिका), एक airtight पारदर्शी चैम्बर में शुरू बाद में एक मुखौटा के माध्यम से (निम्नलिखित जानवर करने के लिए कारण तनाव को कम करने के लिए, कक्ष हवा के साथ प्लावित है पहले यह reused किया है). त्वचा पंप आरोपण के लिए बनाया चीरा तुरंत बाद आरोपण रेशम धागे का उपयोग करने के लिए sutured है.
चूंकि जानवरों वजन physiologically प्रयोगात्मक अवधि के दौरान और लाभ परीक्षण एजेंट एक निरंतर दर पर प्रशासित रहे हैं, वास्तविक शरीर के वजन के प्रति किलोग्राम एक परीक्षण दवा के लिए चयनित खुराक जलसेक अवधि की शुरुआत में औसत खुराक से अधिक है और कम है जलसेक अवधि के अंत में औसत खुराक से.
निरंतर प्रेरणा के रूप में यहाँ वर्णित है, metronomic उपचार की एक विस्तारित रूप के रूप में देखा जा सकता है.

4. प्रयोग समाप्त

एक समय में एक जानवर एक पारदर्शी airtight कक्ष, जो सीओ ₂ गैस है जो तेजी से पशु मारता है के साथ प्लावित है में रखा गया है . कक्ष हवा के साथ फिर से इस्तेमाल किया जा रहा से पहले प्लावित है.

5. फसल काटने वाले ऊतकों के नमूनों

के रूप में डीवीडी में दिखाया गया है, पेट की दीवार खोला और अन्त्रपेशी छोटे पेट, सबसे बाहर का हिस्सा है कि ileo - cecal वाल्व (छोटी आंत और बड़ी आंत के जंक्शन) तक पहुँचता है सहित पहचान की है. गिने सबसे distally स्थित "खिड़कियों के चार (या अधिक) और उद्देश्य मानक इलाज Superfrost प्लस स्लाइड्स (DAKO एक डेनमार्क / एस, Glostrup, डेनमार्क) पर फैल. से बचने के लिए, यदि संभव हो तो, रक्त, आंत सामग्री या अन्य शारीरिक तरल पदार्थों के साथ नमूने contaminating यह महत्वपूर्ण है, के रूप में इन सामग्रियों दाग गैर - विशेष रूप से हो सकता है, हालांकि इस microvessels के बाद immunohistochemical दृश्य अमान्य नहीं है.
संलग्न छोटे पेट खंड के साथ प्रत्येक mesenteric खिड़की नमूना स्लाइड पर फैला हुआ है और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूख. फिर, आंतों स्टंप से कट जाता है, जबकि बरकरार झिल्लीदार अन्त्रपेशी नमूनों -20 डिग्री सेल्सियस पर विस्तारित अवधि के लिए जमा हो जाती है. इस डीवीडी में दिखाया गया है.

यह उल्लेख किया जाना है कि ऊतक और पेटेंट vasculature पहले कल्पना करने के लिए प्रेषित प्रकाश intravital माइक्रोस्कोपी के साथ फसल किया जा सकता है चाहिए.

6. Microvessels के immunohistochemical धुंधला के लिए प्रोटोकॉल

0 दिन
नमूनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस से कमरे के तापमान 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेंटीग्रेड पर एक कैबिनेट में सूखे के लिए अनुमति दी गल कर रहे हैं, और कमरे रात के तापमान पर रखा.
दिवस 1
एक धुंधला जार में स्लाइड धारकों (हर दूसरे ट्रैक में) धुंधला में स्लाइड्स प्लेस और टीबीएस (7.8 पीएच) के साथ दो बार धोने के कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए. समाधान खारिज कर दिया है और अगले समाधान के साथ बदल दिया, और इतने पर निम्नलिखित सभी चरणों के लिए.
Trypsin उपचार
धुंधला जार है कि trypsin समाधान (25 ° C 20 मिनट के लिए) के साथ धुंधला स्लाइड धारक बंदरगाह भरें. समाधान त्यागें और 2.5% sucrose के समाधान (10 मिनट प्रत्येक समय के लिए कमरे के तापमान) के साथ दो बार सेते हैं. समाधान त्यागें और एक्वा dest में कई बार (कुछ मिनट प्रत्येक के लिए कमरे के तापमान) की एक जोड़ी कुल्ला .
अवरुद्ध
धुंधला जार है कि 0.5% मेथनॉल में _{एच 2 2} हे (30 मिनट के लिए कमरे के तापमान) के साथ धुंधला स्लाइड धारक बंदरगाह भरें. समाधान त्यागें और एक्वा dest (एक कुछ मिनट के लिए कमरे के तापमान) के साथ कुल्ला. समाधान त्यागें और टीबीएस (पीएच 7.4) (8 मिनट प्रत्येक समय के लिए कमरे के तापमान) के साथ दो बार कुल्ला.
अण्डा सेना
सभी incubations कमरे के तापमान पर एक humidified कक्ष में हैं. नीचे सूचीबद्ध समाधानों में से प्रत्येक के लगभग 150 μl स्लाइड प्रति किया जाता है. स्लाइड एक humidified चैम्बर में रखा जाता है और समाधान नमूनों (गैर झिल्लीदार भागों के समाधान के द्वारा कवर की जरूरत नहीं है) पर pipetted हैं.
निम्नलिखित कदम के प्रत्येक के लिए, ध्यान से समाधान के सभी हिला बाद समाधान से पहले जोड़ा जाता है.
1. ऊष्मायन साथ सामान्य (अवरुद्ध) (घोड़े) सीरम (एबीसी किट) 3 पीला समाधान / 20 मिनट के लिए 10 मिलीलीटर कमजोर पड़ने बफर बूँदें.
2. प्राथमिक एंटीबॉडी ARU0181, जो चूहे संवहनी endothelial कोशिकाओं लेबल के साथ ऊष्मायन . एंटीबॉडी कमजोर पड़ने (BioSource) बफर (100 μl पतला 40 गुना [जमी] प्लस 900 μl कमजोर पड़ने बफर) और ऊष्मायन साथ 1:600 पतला है जगह 4 में रात भर लेता डिग्री सेल्सियस
2 दिन
स्लाइड्स humidified चैम्बर से हटा रहे हैं, प्राथमिक एंटीबॉडी त्याग है, और स्लाइड एक धुंधला स्लाइड धारक, जो धुंधला जार में डूबे हुए है और टीबीएस के साथ दो बार rinsed में रखा जाता है8 मिनट के लिए (7.8 पीएच).
1. Biotinylated एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन (एबीसी किट )
  स्लाइड्स क्षैतिज एक humidified चैम्बर में रखा जाता है और नीले समाधान / 30 मिनट के लिए 10 मिलीलीटर कमजोर पड़ने बफर के 1 ड्रॉप के साथ incubated . समाधान त्यागें और एक स्लाइड धुंधला धुंधला जार में जलमग्न धारक में स्लाइड्स जगह और 8 मिनट के लिए टीबीएस (7.4 पीएच) के साथ दो बार कुल्ला.
2. एबीसी अभिकर्मक के साथ ऊष्मायन
  स्लाइड्स फिर एक humidified कक्ष में क्षैतिज रखा और निम्न समाधानों के नमूनों की झिल्लीदार भागों पर pipetted हैं: नारंगी समाधान से अधिक 30 मिनट के लिए 2 भूरे रंग के समाधान / 10 मिलीलीटर टीबीएस (7.4 पीएच) की बूंदों के 2 बूँदें. उपयोग करने से पहले 30 मिनट के ध्यान मिक्स! समाधान त्यागें और स्लाइड धारक में स्लाइड्स और धुंधला जार में जगह टीबीएस (7.4 पीएच) के साथ 8 मिनट के लिए दो बार कुल्ला.
थपका के साथ धुंधला (0.05%)
यह कदम एक हवादार रासायनिक हुड में निष्पादित किया जाना चाहिए!
स्लाइड्स प्लेस और (थपका, सिग्मा Aldrich) 3,3 - diaminobenzidine जोड़ने समाधान एक विंदुक का उपयोग: 0.1% टीबीएस में थपका समाधान (7.4 पीएच) [जमी] 10 μl _{एच 2} हे का एक मिश्रण के साथ 1:1 पतला है ₂ और 7.5 मिलीलीटर टीबीएस (7.4 पीएच). यह समाधान (कि सूक्ष्म तस्वीर अस्पष्ट हो सकता है किसी भी कणों को खत्म करने के लिए) का उपयोग करने से पहले बाँझ फ़िल्टर्ड है. 8 मिनट के लिए नमूनों का दाग. समाधान त्यागें और धुंधला स्लाइड धुंधला जार में जलमग्न धारक में स्लाइड जगह. नल का पानी चल रहा है और फिर कुछ मिनट के लिए पानी dest में के अंतर्गत कुल्ला .
निर्जलीकरण
स्लाइड्स धुंधला स्लाइड धारक में रखा जाता है. Discarding द्वारा कुल्ला और धुंधला एक्वा dest / इथेनॉल युक्त जार refilling: एक्वा dest, 70% शराब, 95% शराब, निरपेक्ष शराब प्रत्येक समाधान में 2 मिनट के साथ.

7. और संवहनी endothelial कोशिकाओं की immunohistochemical धुंधला के बाद इमेजिंग प्रत्येक mesenteric विंडो नमूना Microvascular नेटवर्क में मूल्यांकन

जैसा कि फिल्म में दिखाया गया है, microvessels microscopically बरकरार ऊतकों में स्वस्थानी में visualized हैं.

सबसे पहले, हम बढ़ाई रेंज के साथ एक ड्राइंग माइक्रोस्कोप का उपयोग 14 से 34 (Leica जंगली एम 3Z) सफेद कागज पर पेंसिल पूरे खिड़की क्षेत्र, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से mesenteric खिड़की के प्रति पूरे vascularized क्षेत्र (VA ). VA, पूरे क्षेत्र के एक प्रतिशत के रूप में, आसानी से कम्प्यूटरीकृत या गैर कम्प्यूटरीकृत planimetry (या बस बाहर काटने और भार पूरी विंडो की छवि, और अपने सभी भागों vascularized की छवियों द्वारा) का उपयोग मापा जाता है.
का प्रयोग एक और ड्राइंग माइक्रोस्कोप, व्यक्तिगत microvessel प्रोफाइल, जो आसानी से पहचान कर रहे हैं सफेद कागज पर काली स्याही में बेतरतीब ढंग से चुने हुए क्षेत्रों के भीतर 80 बढ़ाई पर तैयार कर रहे हैं. यह बाद कम्प्यूटरीकृत morphometric microvascular लंबाई के मूल्यांकन (MVL), जो मूल रूप से microvascular घनत्व की एक माप है के लिए प्रारंभ बिंदु है.
वैकल्पिक रूप से, microvascular पैटर्न गठन के लिए संबंधित चर, के रूप में व्यक्तिगत microvascular अंकुरित (सं सपा और Le सपा, क्रमशः) के microvascular अंकुरित और लंबाई की संख्या के आकलन के लिए उन के रूप में अच्छी तरह से निर्धारित किया जा सकता है. चित्रित काले पोत संरचनाओं और सबसे वाणिज्यिक morphometric कम्प्यूटरीकृत कार्यक्रमों में सफेद पृष्ठभूमि छवियों का विस्तृत विश्लेषण की सुविधा के बीच इष्टतम विपरीत.
ज्यादातर मामलों में, प्रमुख चर वीए और MVL, जो जब एक साथ गुणा कुल microvascular लंबाई (TMVL) उत्पन्न कर रहे हैं.

8. सांख्यिकी विश्लेषण

हम आम तौर पर मानक गैर पैरामीट्रिक मान - व्हिटनी यू परीक्षण का उपयोग करने के लिए unpaired (दो पूंछ) टिप्पणियों का विश्लेषण . जानवर प्रति चार mesenteric खिड़कियों के एक मतलब स्वतंत्र mesenteric विंडो के प्रत्येक चर के लिए डेटा बिंदु के रूप में प्रयोग किया जाता है. सांख्यिकीय महत्व के लिए कसौटी पी ≤ 0.05 है.

Discussion

परख ^तीन +१९८६ में पेश किया गया था और क्रमिक आगे और विकसित किया गया है हमारे ^7,10-12 प्रयोगशाला में परिष्कृत. समीक्षा कागजात (आमंत्रित) ^{1, 2} में चर्चा की, अन्य स्तनधारी परख के साथ अच्छी तरह से vivo angiogenesis परख में संबंध में तुलना natively विशेष रूप से वयस्क परीक्षण के ऊतकों जैसे महत्वपूर्ण सुविधाओं है vascularized और शारीरिक angiogenesis का अभाव है , कम से कम आघात है, यदि कोई हो, ऊतक पर दिए गए, वास्तव में मात्रात्मक चर मापा जो ध्वनि सांख्यिकीय खुराक - प्रतिक्रिया और आणविक गतिविधि अध्ययन के बारे में विश्लेषण की अनुमति देता है, अंकुरण angiogenesis होता है, जो सामान्य ऊतकों और ट्यूमर में predominating है, और विषाक्तता डेटा चूहों कि robustly बढ़ने में आसानी से जमा कर रहे हैं physiologically वयस्कता में. हानिकर सुविधाओं के तथ्य यह है कि परख अपेक्षाकृत समय लेने वाली है, खासकर जब और व्यक्तिगत microvessel क्षेत्रों और microvessel अंकुरित की संख्या की लंबाई का आकलन शामिल हो सकते हैं, कि यह real-time/serial टिप्पणियों की अनुमति नहीं है, और है कि यह शायद ही चूहों के लिए उपयुक्त है के बाद चूहों में कई mesenteric खिड़कियों संभावित माता पिता microvessels कमी से नया capillaries पैदा कर सकते हैं.

वास्तविक समय टिप्पणियों, लेकिन कर रहे हैं, जहां exteriorized लेकिन बरकरार mesenteric खिड़कियां एक खुर्दबीन मंच पर बाहर splayed हैं, जबकि पशु anesthetized है, के ^रूप में 1 में चर्चा intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा सक्षम है.

Corneal micropocket, लड़की chorioallantoic झिल्ली, और सुप्रीम कोर्ट Matrigel प्लग assays है, जो उपयोगी है, लेकिन अंततः सीमित उपकरण हैं जैसे मॉडल का उपयोग कर पिछले दशकों में angiogenesis अनुसंधान के क्षेत्र में उल्लेखनीय प्रगति हासिल किया गया है. विरोधी angiogenic और समर्थक angiogenic चिकित्सा के भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों स्थापना और अधिक संवेदनशील और biologically प्रासंगिक है, वास्तव में मात्रात्मक वर्तमान रिपोर्ट में वर्णित के रूप में पूर्व नैदानिक मॉडल, के सत्यापन की जरूरत है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

पढ़ाई के अधिकांश के लिए वित्तीय सहायता स्वीडिश चिकित्सा अनुसंधान परिषद (5942 अनुदान) द्वारा प्रदान किया गया.

Materials

Buffers and reagents
0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.
Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
TBS (pH 7.4) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl₂) Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl₂ in 200 ml TBS (pH 7.8).
Sucrose solution 2.5% Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).
Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4) Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).
Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide (Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).
ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer. Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer. ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).
Mix these solutions 20 minutes before use!
Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)
This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.
Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.
Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503). DAB= 3,3’-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015). Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665). Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)