Rat mesentere angiogenesi Assay

Summary

Normale adulto tessuto vascolarizzato mammiferi che manca l'angiogenesi fisiologica e che non è stata esposta a un intervento chirurgico viene utilizzato per studiare: (i) l'avvio e lo sviluppo di angiogenesi in seguito alla somministrazione intraperitoneale di agenti di test, e (ii) la modifica di angiogenesi dopo somministrazione sistemica di selezionati agenti di test.

Abstract

L'adulto mesentere ratto saggio finestra angiogenesi è biologicamente appropriato ed è particolarmente adatta allo studio della germinazione angiogenesi in vivo [vedi documenti di revisione], che è la forma dominante di angiogenesi nei tumori umani e non-tessuti tumorali, come discusso in rassegna invitato carte ^1,2. L'angiogenesi indotta nella parte membranosa mesenterica da intraperitoneale (ip) l'iniezione di un fattore pro-angiogenico può essere modulata per via sottocutanea (SC), per via endovenosa (ev) o orale (po) il trattamento con agenti modificatori di scelta. Ogni parte membranosa del mesentere è traslucido e incorniciato da tessuto adiposo, dandogli una finestra-come l'apparenza.

Il test ha le seguenti caratteristiche vantaggiose: (i) il tessuto di prova è nativamente vascolarizzato, anche se scarsamente, e poiché è estremamente sottile, la rete dei microvasi è praticamente a due dimensioni, che permette l'intera rete da valutare microscopicamente in situ; ( ii) in ratti adulti il tessuto di prova significativo manca l'angiogenesi fisiologica, che caratterizza la maggior parte dei tessuti adulti normali dei mammiferi, il grado di vascolarizzazione nativa, tuttavia, è correlata con l'età, come discusso in ^1, (iii) il livello trascurabile di traumi indotti angiogenesi garantisce elevata sensibilità, (iv) il saggio riproduce la situazione clinica, in quanto l'angiogenesi, modulando la droga test sono somministrati per via sistemica e le risposte osservate riflette l'effetto netto di tutte le metabolici, cellulari, molecolari e le alterazioni indotte dal trattamento, (v) il test permette di valutazioni obiettive, quantitativi, le variabili imparziali di microvascolare estensione spaziale, la densità e la formazione di modello di rete, così come della capillare germinazione, consentendo così robuste analisi statistiche della dose-effetto e molecolare la struttura-attività, e (vi ) il test rivela con alta sensibilità agli effetti tossici o nocivi di trattamenti in termini di tasso di diminuzione fisiologica del peso corporeo, come ratti adulti crescere fortemente.

Mast-cellulo-mediata angiogenesi è stato dimostrato da questo test ^3,4. Il modello dimostra un elevato livello di discriminazione in materia di dose-effetto e gli effetti misurati di via sistemica chimicamente o funzionalmente farmaci strettamente correlati e proteine, tra cui: (i) a basso dosaggio, metronomically somministrati chemioterapici standard di rendimento diversi, farmaco-specifici effetti (cioè, le attività di angiogenesi-soppressiva, neutro o angiogenesi-stimolante ^5), (ii) naturale ferro-insaturi umano lattoferrina, che stimola VEGF-A-angiogenesi mediata ⁶ e naturale ferro-insaturi lattoferrina bovina, che inibisce VEGF-A- dell'angiogenesi mediata ^7; e (iii) a basso peso molecolare frazioni eparina prodotta in vari modi ^8,9. Inoltre, l'analisi è molto adatto a studi sugli effetti combinati di angiogenesi di agenti che sono somministrati per via sistemica in modo simultaneo o sequenziale.

L'idea di realizzare questo video origine dal compianto Dr. Judah Folkman quando ha visitato il nostro laboratorio e testimoniato la metodologia essere dimostrata.

Recensione carte (invitato) discutere e valutare il dosaggio

Norrby, K. Nei modelli in vivo di angiogenesi. J. cella. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).

Norrby, Drug test K. con modelli angiogenesi. Expert Opin. Droga. Sco. 3, 533-549 (2008).

Protocol

1. Animali

1. Piccoli roditori, come i ratti, topi e porcellini d'India, sono stati utilizzati come modelli animali. Purtroppo, topi adulti (molti ceppi di topi sono stati valutati) tendono a mancare o che hanno solo un numero molto basso di potenziale genitore microvasi (da cui possono provenire angiogenesi) all'interno delle loro finestre mesenterica, che rende gli studi con i topi inaffidabili. Pertanto, il test è stato sviluppato principalmente per i ratti.
2. I topi, che sono acclimatate ad un ambiente standard per almeno 7 giorni dopo la consegna dal selezionatore, di solito sono alloggiati a coppie in una gabbia standard in un 12-ore ciclo luce / buio con libero accesso all'acqua e pellet. Ogni animale è segnato. Noi usiamo per lo più giovani ratti adulti (di solito 7-10 settimane di età di ceppi diversi, ma di solito maschi Sprague-Dawley, nei ratti più giovani di 5-6 settimane di età il numero dei microvasi nativi tendono ad essere bassi) ottenuti da allevatori diversi. Nel periodo precedente l'esperimento e per tutta l'esperimento, gli animali sono pesati ogni due giorni, e sempre il giorno del sacrificio. Quando gli animali sono trattati contemporaneamente ip (per l'induzione di angiogenesi, vedi sotto) e SC o EV o PO, si sono pesati ogni giorno. Ciò consente la creazione di gruppi sperimentali e di controllo del peso corpo uguale all'inizio dell'esperimento, e permette di controllare l'influenza del trattamento sul corpo-peso-guadagno durante il corso dell'esperimento. Dal ratti maschi adulti crescere fortemente fisiologicamente (guadagnando circa 40-60 g per settimana a seconda del tipo di ceppo), il peso-guadagno ritardo è un marker surrogato della tossicità, sistemica benessere, anoressia, e difetto di crescita.

Lavoriamo in una struttura di alto livello animale cura e notevoli sforzi sono fatti per ridurre al minimo i livelli di stress sperimentato dagli animali. Le attuali linee guida etiche sono quelli stabiliti dalla Workman P. et al. (Linee guida per il benessere e l'uso di animali nella ricerca sul cancro. Fr. J. Cancer 102, 1555-77, 2010). Il Comitato Animal Ethics dell'Università di Göteborg ha approvato questi studi.

2. Pro-angiogenici trattamento intraperitoneale

1. Il fattore pro-angiogenico candidato da testare è sciolto e diluito nel endotossina senza soluzione salina utilizzata per l'infusione di pazienti (anche a livelli estremamente bassi, endotossine è pro-angiogenici). Tutte le soluzioni sono composte da appena il giorno di iniezione, sterile, filtrata (Millipore 0,22-micron di filtrazione), controllata per il pH neutro (7,1-7,3), e utilizzate a temperatura ambiente.
   L'agente di test viene iniettato a concentrazioni basse o molto basse. Per esempio, ratto rVEGF ₁₆₄ (564-RV/CF, R & D Systems Europe, Ltd., Oxon, UK), che è la predominante isoforma VEGF-A nei ratti, è diluito a 96 pmole / ml in endotossine senza soluzione salina, congelati e scongelati e un volume di 5 ml viene iniettata ip nel ratto. Noi usiamo una siringa da 5 ml con 0,8 mm ago (ago verde, 21G) per l'iniezione ip. Questo trattamento, due volte al giorno per 4,5 giorni, cioè., Dal Lunedi mattina (giorno 0) a Venerdì mattina (giorno 4), induce una risposta robusta angiogenesi spuntano nel tessuto prova mesenterica un picco intorno al giorno 21.
   Amministrazione del ip soluzione garantisce che l'intero volume viene consegnato nella cavità peritoneale (e non in, vescica, intestino o qualsiasi altro organo). L'iniezione rapida di 5 ml permette conferma tattile da parte dell'operatore che il getto del liquido sia passato attraverso la parete addominale nella cavità addominale.
   In seguito, prima o in concomitanza con l'ip pro-angiogenici trattamento, ogni agente di test di scelta può essere somministrata per via sistemica.

3. Administation sistemica di angiogenesi-modulante agenti

1. Ogni itinerario diverso da ip route può essere utilizzato, in quanto il trattamento ip possono influenzare la reazione in corso angiogenico attraverso l'induzione di infiammazione o, eventualmente, attivando mastociti nel tessuto di prova, che può portare a una forte pro-angiogenici risposta. Oltre a somministrazione orale o una singola iniezione sottocutanea o endovenosa, si usano spesso somministrazione sottocutanea utilizzando minipompe osmotica (uno o più, con vari volumi e di pompaggio volte) per offrire la soluzione ad una velocità costante per un massimo di due o più settimane.
2. Infusione continua sottocutanea di agenti di test
   Riempimento e l'impianto di minipompe osmotica
   Di solito il giorno 5, vale a dire, un giorno dopo la fine del trattamento VEGF ip, minipompe osmotici (ad esempio, Modello 2ML2, con costante di velocità di pompaggio su 5,0 microlitri / h per 14-15 giorni; Alzet Pompe osmotica, Mountain View, CA , USA) sono riempiti in condizioni di sterilità con l'agente di prova o il veicolo appropriato. Dopo stoccaggio in sterile 0,9% (w / v) di NaCl durante la notte a 37 ° C, la pompa (s) sono chirurgicamente impiantati sc sulle spalle (a lato della colonna vertebrale column nella regione delle scapole) di ratti che sono stati anestetizzati con isoflurano gas (veterinario Isoba, Schering-Plough Animal Health, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA), inizialmente in una camera stagna trasparente e successivamente attraverso una maschera (per minimizzare lo stress causato alle animale a seguito, la camera viene lavata con l'aria prima di essere riutilizzato). L'incisione cutanea fatto per l'impianto della pompa viene suturata immediatamente post-impianto con filo di seta.
   Dal momento che gli animali di peso fisiologicamente durante il periodo di sperimentazione e gli agenti di test vengono somministrati ad un tasso costante, il dosaggio attuale selezionati per un farmaco di prova per kg di peso corporeo è superiore alla dose media all'inizio del periodo di infusione ed è più bassa rispetto alla dose media alla fine del periodo di infusione.
   Infusione continua, come descritto qui, può essere visto come una forma estesa di trattamento metronomico.

4. Terminare la Experiment

1. Un animale alla volta è posto in una camera trasparente a tenuta d'aria, che viene lavata con gas CO _2, che uccide rapidamente gli animali. La camera viene lavata con l'aria, prima di essere riutilizzati.

5. La raccolta di campioni di tessuto

1. Come mostrato nel DVD, la parete addominale è aperta e il piccolo intestino mesentere è identificato, compresa la parte più distale che raggiunge la valvola ileo-cecale (la giunzione del piccolo intestino e l'intestino crasso). Quattro (o più) dei più distalmente trova "finestre" sono numerati e diffondere sul oggettivi standard di Superfrost non trattati Plus-slide (DAKO Danimarca A / S, Glostrup, Danimarca). E 'importante evitare, se possibile, contaminando i campioni di sangue, contenuto intestinale o altri fluidi corporei, in quanto questi materiali possono essere colorati in modo non specifico, anche se questo non invalida la successiva visualizzazione immunoistochimica dei microvasi.
2. Ogni esemplare finestra mesenterica con annesso segmento dell'intestino piccolo si sviluppa su un vetrino ed essiccata a temperatura ambiente per 20 minuti. Poi, il moncone intestinale è tagliato fuori, mentre i campioni intatti mesentere membranose sono conservati a -20 ° C per lunghi periodi. Questo è mostrato nel DVD.

Va ricordato che la vascolarizzazione dei tessuti e brevetti possono essere visualizzati prima del raccolto con trasmessa microscopia ottica intravitale.

6. Protocollo per la colorazione immunoistochimica dei microvasi

1. Giorno 0
   I campioni sono autorizzati a disgelo da -20 ° C a temperatura ambiente, essiccate in un armadio a 60 ° C per 1 ora, e tenuto a temperatura ambiente per una notte.
2. Giorno 1
   Porre i vetrini nella colorazione titolari di scorrimento (in ogni seconda traccia) in una vaschetta di colorazione e lavare due volte con TBS (pH 7.8) per 10 minuti a temperatura ambiente. La soluzione viene scartata e sostituita con la soluzione successiva, e così via per tutte le seguenti operazioni.
3. Tripsina trattamento
   Riempire la vaschetta di colorazione che porto il supporto diapositive colorazione con soluzione di tripsina (25 ° C per 20 minuti). Scartare la soluzione e incubare per due volte con soluzione di saccarosio al 2,5% (temperatura ambiente per 10 minuti ogni volta). Scartare la soluzione e lavare un paio di volte in acqua distillata (temperatura ambiente per alcuni minuti ciascuno).
4. Blocco
   Riempire la vaschetta di colorazione che porto il supporto diapositive colorazione con lo 0,5% H ₂ O ₂ in metanolo (temperatura ambiente per 30 minuti). Scartare la soluzione e risciacquare con acqua distillata (temperatura ambiente per qualche minuto). Gettare la soluzione e lavare due volte con TBS (pH 7.4) (temperatura ambiente per 8 minuti ogni volta).
5. Incubazione
   Ogni incubazione in una camera umidificata a temperatura ambiente. Circa 150 ml di ciascuna delle soluzioni elencate di seguito sono utilizzati per vetrino. I vetrini sono posti in una camera umidificata e le soluzioni vengono aggiunti sul esemplari (il non-membranosa parti non hanno bisogno di essere coperte dalle soluzioni).
   Per ciascuna delle seguenti fasi, con attenzione scrollarsi di dosso tutta la soluzione prima che la soluzione successiva viene aggiunta.
   1. Incubazione con normale (blocco) nel siero (cavallo) (ABC kit) 3 gocce di soluzione di colore giallo / 10 ml di tampone di diluizione per 20 minuti.
   2. L'incubazione con l'anticorpo primario ARU0181, che le etichette topo le cellule endoteliali vascolari. L'anticorpo è diluito 1:600 ​​con il tampone di diluizione (Biosource) (100 microlitri diluito 40 volte [congelati] più 900 microlitri di tampone di diluizione) e l'incubazione si svolge la notte a 4 ° C.
6. 2 ° giorno
   Le diapositive vengono rimossi dalla camera umidificata, l'anticorpo primario viene scartato, e le diapositive sono posti in un supporto per diapositive colorazione, che è immersa nella vaschetta di colorazione e risciacquati due volte con TBS(PH 7,8) per 8 minuti.
   1. Incubazione con anticorpo biotinilato (ABC kit)
      I vetrini sono posti orizzontalmente in una camera umidificata e incubate con 1 goccia di soluzione di blu / 10 ml di tampone di diluizione per 30 minuti. Scartare la soluzione e posto le diapositive in un portavetrini colorazione sommerso nel vaso colorazione e lavare due volte con TBS (pH 7,4) per 8 minuti.
   2. Incubazione con il reagente ABC
      I vetrini sono ancora posti orizzontalmente in una camera umidificata e le soluzioni che seguono sono pipettati sulle parti membranosa dei campioni: 2 gocce di soluzione di arancio e 2 gocce di soluzione di colore marrone / 10 ml di TBS (pH 7,4) per 30 minuti. Mescolare con cura 30 minuti prima dell'uso! Scartare la soluzione e posto le diapositive nel supporto diapositive nella vaschetta di colorazione e lavare due volte con TBS (pH 7,4) per 8 minuti.
7. Colorazione con DAB (0,05%)
   Questa operazione deve essere eseguita in una cappa chimica ventilato!
   Porre i vetrini e aggiungere il 3,3-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich) soluzione con una pipetta: soluzione DAB 0,1% in TBS (pH 7,4) [congelati] è diluito 1:1 con una miscela di 10 microlitri H ₂ O ₂ e 7,5 ml TBS (pH 7,4). Questa soluzione è sterile filtrata prima dell'uso (per eliminare eventuali particelle che possono oscurare l'immagine microscopica). Macchiare i campioni per 8 minuti. Scartare la soluzione e posto le diapositive nel supporto diapositive colorazione immerso nella vaschetta di colorazione. Sciacquare con acqua di rubinetto e poi in acqua distillata per pochi minuti.
8. Disidratazione
   I vetrini sono conservati nel supporto diapositive colorazione. Risciacquare scartando e riempire la vaschetta di colorazione contenente acqua distillata / etanolo: acqua distillata, alcool al 70%, 95% di alcol, alcool assoluto, con 2 minuti in ogni soluzione.

7. Imaging e valutazione della rete microvascolare in ogni campione finestra mesenterica Dopo la colorazione immunoistochimica di cellule endoteliali vascolari

Come mostrato nel film, microvasi sono microscopicamente visualizzati in situ nel tessuto intatto.

1. Per prima cosa, noi usiamo un microscopio disegno con la gamma di ingrandimento 14-34 (M Leica Selvaggio 3Z) a matita su carta bianca tutta l'area finestra, così come tutta l'area vascolarizzata (VA) per finestra mesenterica. VA, in percentuale di tutta l'area, può essere facilmente misurata con planimetria computerizzato o non computerizzato (o semplicemente tagliando fuori e ponderazione l'immagine di tutta la finestra, e le immagini di tutte le sue parti vascolarizzato).
2. Usando un altro microscopio disegno, profili microvasi individuali, che sono facilmente identificabili, sono disegnati con inchiostro nero su carta bianca a 80 ingrandimenti all'interno dei campi scelti a caso. Questo è il punto di partenza per la successiva valutazione morfometrica computerizzata della lunghezza microvascolari (MVL), che è sostanzialmente una misura della densità microvascolare.
3. Opzionalmente, le variabili relative alla formazione di pattern microvascolare, così come quelli per la valutazione del numero di germogli microvascolare e la lunghezza dei singoli germogli microvascolare (SP n ° e Le. SP, rispettivamente) può essere determinato. -Il contrasto ottimale tra le strutture raffigurato nave nero e lo sfondo bianco facilita l'analisi dettagliata delle immagini, nella maggior parte dei programmi commerciali morfometriche computerizzate.
4. Nella maggior parte dei casi, le variabili principali sono VA e MVL, che se moltiplicati insieme generano la lunghezza totale microvascolari (TMVL).

8. Analisi statistica

Noi di solito utilizzare lo standard non parametrico di Mann-Whitney U-test per analizzare spaiato (due code) osservazioni. Una media di quattro finestre mesenterica per animale viene utilizzato come indipendente dati-punto per ogni variabile della finestra mesenterica. Il criterio di significatività statistica è P ≤ 0,05.

Discussion

Il dosaggio è stato introdotto nel 1986 ³ e ha successivamente stato ulteriormente sviluppato e raffinato nel nostro laboratorio ^7,10-12. Come discusso in documenti di revisione (invitato) ^{1, 2,} il saggio mette a confronto anche con altri mammiferi test in vivo l'angiogenesi in particolare riguardo a caratteristiche importanti come il tessuto di prova degli adulti è nativamente vascolarizzato e privo di angiogenesi fisiologica; traumi minimi, se presente, viene inflitta il tessuto; variabili quantitative sono misurate veramente, che consente una valida analisi statistica per quanto riguarda dose-risposta e molecolare-attività degli studi; angiogenesi germinazione si verifica, che è predominante in tessuti normali e tumori, e dati sulla tossicità sono facilmente accumulato nei ratti che crescere fortemente fisiologicamente in età adulta. Caratteristiche svantaggiose possono includere il fatto che il saggio è relativamente molto tempo, soprattutto nel valutare il numero e la lunghezza dei singoli segmenti microvasi e germogli di microvasi, che non permette osservazioni real-time/serial, e che è poco adatto per i topi poiché molte finestre mesenterica nei topi mancanza microvasi potenziale genitore da cui può nascere nuovi capillari.

In tempo reale le osservazioni sono, tuttavia, ha permesso al microscopio intravitale dove sono aperte le finestre, ma esteriorizzato intatto mesenterica nell'arco di un microscopio a fase, mentre l'animale è anestetizzato, come discusso in ^1.

Progressi significativi nella ricerca angiogenesi sono stati raggiunti negli ultimi decenni con modelli come la micropocket corneale, membrana corioallantoidea pulcino, e sc saggi spina Matrigel, che sono strumenti utili ma alla fine limitata. Future applicazioni cliniche di terapie anti-angiogenico e pro-angiogenici richiedono l'istituzione e la convalida dei più sensibili e biologicamente rilevanti, veramente quantitativa modelli pre-clinici, come quello descritto nel report corrente.

Materials

Buffers and reagents

0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.

Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

TBS (pH 7.4) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.

Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2) Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).

Sucrose solution 2.5% Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).

Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4) Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).

Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide (Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).

ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer. Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer. ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).

Mix these solutions 20 minutes before use!

Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)

This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.

Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.

Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503). DAB= 3,3’-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015). Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665). Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)