Summary
Нормальный взрослый васкуляризированной ткани млекопитающих, что не хватает физиологических ангиогенеза и который не подвергался хирургическому вмешательству используется для изучения: (я) возникновение и развитие ангиогенеза после внутрибрюшинного введения тестовых агентов, и (II) изменение ангиогенеза следующие системные администрации выбранного теста агентов.
Protocol
1. Животные
- Мелкие грызуны, такие, как крыс, мышей и морских свинок, были использованы в качестве модельных животных. К сожалению, у взрослых мышей (многие линий мышей были оценены), как правило, отсутствие или лишь очень небольшое число потенциальных родителя микрососудов (из которого может исходить ангиогенез) в рамках своих брыжеечной окна, что делает исследования на мышах ненадежны. Таким образом, анализ был разработан в первую очередь для крыс.
- Крыс, которые акклиматизировались в стандартной среде, по крайней мере 7 дней после доставки от заводчика, как правило, размещается в пар в стандартной клетке под 12-ч свет / темно цикла со свободным доступом к воде и окатыши. Каждое животное будет отмечена. Мы используем в основном молодых взрослых крыс (как правило, 7-10 недель от различных штаммов, но обычно мужчины Sprague-Dawley крыс, у крыс в возрасте до 5-6 недельного возраста число родных микрососудов, как правило, низкий), полученные из разных заводчиков. В период до эксперимента и в течение всего эксперимента, животных взвешивают каждый второй день, и всегда в день жертвоприношения. Когда животные лечатся одновременно IP (для индукции ангиогенеза, см. ниже) и подкожно или внутривенно или бо, они весили каждый день. Это дает возможность создания экспериментальной и контрольной групп одинакового веса тела в начале эксперимента, и позволяет осуществлять мониторинг влияния терапии на вес тела, получить в ходе эксперимента. Так как взрослых самцов крыс растут энергично физиологически (получение приблизительно 40-60 г в неделю в зависимости от типа деформации), вес коэффициентом усиления отсталости является чувствительным маркером заменитель токсичности, системные благополучия, снижение аппетита и отказ процветать.
Мы работаем в высокий стандарт медицинского учреждения животных и значительные усилия, чтобы минимизировать стресс испытывают животные. Текущие этические принципы являются те, которые установлены рабочего П. и соавт. (Руководящие принципы для обеспечения и использования животных в исследовании рака. Br. J. Cancer 102, 1555-77, 2010). Комитет животных этики Университета Гетеборга одобрил эти исследования.
2. Pro-ангиогенных Внутрибрюшинное Лечение
- Кандидат проангиогенных фактором для тестирования растворяется и разводят в эндотоксина без солевых использоваться для инфузий больных (даже при очень низких уровнях, эндотоксин является проангиогенных). Все решения составлены только что в день проведения инъекций, стерильной фильтрацией (Millipore 0,22 мкм фильтрация), проверка на нейтральную рН (7.1-7.3), и использоваться при комнатной температуре.
Агент тестирования вводится при низких или очень низких концентрациях. Например, крыса rVEGF 164 (564-RV/CF, R & D Systems Europe, Ltd, Oxon, Великобритания), который является преобладающим VEGF-изоформы у крыс, разбавляют до 96 пмоль / мл в эндотоксина без раствора, замороженные и талых и объемом 5 мл вводится IP в крысу. Мы используем 5-мл шприц с 0,8-мм иглой (зеленые иглы, 21G) для IP-инъекции. Эта обработка, два раза в день в течение 4,5 дней, то есть., С утра понедельника (день 0) до утра пятницы (день 4), индуцирует надежный прорастания кровеносных сосудов в ответ брыжеечной ткани теста, достигая максимума на отметке 21-й день.
Администрирование решение ф гарантирует, что весь объем поставляется в брюшную полость (а не в кишечнике, мочевом пузыре или любой другой орган). Быстрое введение 5 мл позволяет тактильные подтверждения оператором, что жидкость струей прошла через брюшную стенку в брюшную полость.
После, до или одновременно с ф проангиогенных лечения, любой тест препаратом выбора могут быть введены системно.
3. Системное администрирование ангиогенеза модулирующего Агенты
- Любой маршрут, кроме IP-маршрут может быть использован, так как ф лечение может повлиять на текущую ангиогенных реакции через индукции воспаления или, возможно, путем активации тучных клеток в тесте ткань, которая может привести к сильным проангиогенных ответ. Помимо приема внутрь или однократное введение подкожно или внутривенно, мы часто используем подкожно администрирование с помощью осмотического minipumps (один или несколько, с разными объемами и насосных раза) для доставки решение с постоянной скоростью в течение двух или нескольких недель.
- Непрерывная подкожной инфузии тестовых агентов
Заполнение и имплантации осмотического minipumps
Обычно на 5 день, т.е. на следующий день после окончания лечения ф VEGF, осмотическое minipumps (например, модель 2ML2, с постоянной скорости перекачивания 5,0 мкл / ч в течение 14-15 дней; Alzet Осмотические Насосы, Маунтин-Вью, Калифорния , США) заполняются в стерильных условиях с агентом тестирования или соответствующего транспортного средства. После хранения в стерильном 0,9% (м / о) NaCl в течение ночи при 37 ° C, насос (ы) имплантируется подкожно на спине (в сторону спинного coluмлн. в область лопатки) крыс, которые были под наркозом использованием изофлуран газа (Isoba ветеринару, Schering-Plough Animal Health, Merck & Co, Inc, Whitehouse Station, штат Нью-Джерси, США), первоначально в герметичной камере и прозрачной Впоследствии с помощью маски (чтобы свести к минимуму стресс, причиненные следующих животных, камера промывается воздух, прежде чем заново). Коже разрез, сделанный для насоса имплантации зашивается сразу после имплантации использованием шелковой нити.
Так как животные набирают вес во время физиологически экспериментального периода и тест средства вводят с постоянной скоростью, фактические дозы, отобранных для испытаний препарата на кг массы тела выше, чем средняя доза в начале периода инфузии и ниже чем средняя доза в конце инфузии период.
Непрерывная инфузия, как описано здесь, можно рассматривать как расширенную форму метрономной лечения.
4. Окончание эксперимента
- Одно животное в тот момент, помещается в герметичную камеру прозрачным, которая вспыхнула с СО 2 газ, который быстро убивает животное. Камера промывается воздух, прежде чем использовать снова.
5. Сбор образцов тканей
- Как показано на DVD, брюшная стенка открывается и малой кишке брыжейки определяется, в том числе наиболее дистальной части, которая достигает подвздошно-слепой кишки клапан (соединения тонкой кишки и толстой кишки). Четыре (или более) из наиболее дистально расположенные «окна», пронумерованы и распространения на объективный стандарт необработанной SuperFrost Плюс-слайды (DAKO Дании / S, Glostrup, Дания). Важно, чтобы избежать, по возможности, загрязнения образцов крови, кишки содержание или другими жидкостями тела, так как эти материалы могут быть окрашены неспецифически, хотя это не отменяет последующей иммуногистохимической визуализации микрососудов.
- Каждый брыжеечной образца окно с прикрепленными небольшой сегмент кишки распространяется на слайд и сушат при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем, кишечные пень отрезали, а нетронутыми мембранных образцов брыжейки хранятся при температуре -20 ° С в течение длительного периода времени. Это показано на DVD.
Следует отметить, что ткани и сосудистой патент могут быть визуализированы до сбора урожая в проходящем свете прижизненной микроскопии.
6. Протокол для иммуногистохимического окрашивания микрососудов
- День 0
Образцы могут таять от -20 ° C до комнатной температуры, высушивают в шкафу при температуре 60 ° С в течение 1 часа, и хранить при комнатной температуре в течение ночи. - День 1
Место слайдов в слайд окрашивания колонка (в каждом втором треке) в окрашивании банку и мыть дважды TBS (рН 7,8) в течение 10 минут при комнатной температуре. Решение отказаться и заменить следующее решение, и так далее для всех следующих шагов. - Трипсин лечения
Заполните окрашивания банку, что будет гавани держатель слайд с окрашиванием раствора трипсина (25 ° С в течение 20 минут). Отменить решение и инкубировать в два раза с 2,5% раствором сахарозы (при комнатной температуре в течение 10 минут каждый раз). Отменить решение и промойте пару раз в царской Dest (комнатной температуре в течение нескольких минут каждый). - Блокирование
Заполните окрашивания банку, что будет гавани держатель окрашивания слайд с 0,5% H 2 O 2 в метаноле (комнатной температуре в течение 30 минут). Отменить решение и промыть аква Dest (комнатной температуре в течение нескольких минут). Отменить решение и полоскать дважды TBS (рН 7,4) (комнатной температуре в течение 8 минут каждый раз). - Инкубация
Все инкубации во влажной камере при комнатной температуре. Около 150 мкл каждого из решений, перечисленных ниже используются на слайд. Слайды находятся во влажной камере и решения пипеткой на образцах (без мембранной части не должны быть застрахованы от решений).
Для каждого из следующих шагов, тщательно стряхнуть все решения до последующего решения не добавляется.- Инкубация с нормальной (блокировка) сыворотки (лошадь) (ABC комплект) 3 капли желтого раствора / 10 мл буфером для разведения в течение 20 минут.
- Инкубация с первичными антителами ARU0181, что этикетки крысы сосудистых эндотелиальных клеток. Антител разводят 1:600 буфером для разведения (Биосурс) (100 мкл разведенного в 40 раз [замороженных] плюс 900 мкл буфера для разведения) и инкубации происходит в течение ночи при 4 ° C.
- День 2
Слайды будут удалены из влажной камере, первичное антитело отбрасывается, и слайды находятся в держатель окрашивания слайд, который погружен в окрашивании банку и дважды промывали TBS(РН 7,8) в течение 8 минут.- Инкубация с биотинилированного антитела (ABC комплект)
Слайды размещаются горизонтально в увлажненной камере и инкубировали с 1 каплю синий раствор / 10 мл буфером для разведения в течение 30 минут. Отменить решение и место слайды в держатель окрашивания слайд погружен в окрашивании банку и полоскать дважды TBS (рН 7,4) в течение 8 минут. - Инкубация с реагентом ABC
Слайды снова располагаться горизонтально во влажной камере и следующие решения пипеткой на мембранных части образцов: по 2 капли оранжевый раствор плюс 2 капли коричневый раствор / 10 мл TBS (рН 7,4) в течение 30 минут. Тщательно перемешать 30 минут перед использованием! Отменить решение и место слайды в держатель слайдов в окрашивании банку и полоскать дважды TBS (рН 7,4) в течение 8 минут.
- Инкубация с биотинилированного антитела (ABC комплект)
- Окрашивание DAB (0,05%)
Этот шаг должен быть выполнен в вентилируемом химических капот!
Место слайды и добавить 3,3-диаминобензидина (DAB, Sigma-Aldrich) решения с помощью пипетки: 0,1% DAB решение в TBS (рН 7,4) [замороженных] разводят в соотношении 1:1 смесь 10 мкл H 2 O 2 и 7,5 мл TBS (рН 7,4). Это решение является стерильным фильтром непосредственно перед употреблением (для устранения каких-либо частиц, что может заслонить микроскопическая картина). Пятно образцов в течение 8 минут. Отменить решение и место слайды в окрашивания слайдов погружен в окрашивании банку. Промыть под проточной водой, а затем в царской Dest в течение нескольких минут. - Обезвоживание
Слайды находятся в держатель слайдов окрашивания. Промыть путем отбрасывания и заправки окрашивания сосуде аква Dest / этанол: аква Dest, 70% спирта, 95% спирта, абсолютного спирта, с 2 минут в каждом решении.
7. Работа с изображениями и оценка микрососудистой сети в каждом брыжеечной образца окна после иммуногистохимического окрашивания сосудистых эндотелиальных клеток
Как показано в фильме, микрососудов микроскопически визуализируется на месте в неповрежденной ткани.
- Во-первых, мы используем рисунок микроскопа с увеличением в диапазоне от 14 до 34 (Leica M Дикие 3Z), чтобы карандашом на белой бумаге всю площадь окна, а также всю территорию васкуляризированной (ВА) в брыжеечных окна. В. А., в процентах от всей площади, легко измеряется с помощью компьютеризированных или не компьютеризированных планиметрии (или просто путем вырезания и взвешивания образ целого окна, и образы всех ее частей васкуляризированной).
- Использование другой рисунок микроскопа, индивидуальные профили микрососудов, которые легко идентифицировать, рисуются черными чернилами на белой бумаге на 80 увеличении в случайно выбранных полей. Это отправная точка для последующей компьютеризированных морфометрических оценки микрососудистых длины (МВЛ), которая в основном измерение микрососудистой плотности.
- При желании переменные, связанные с микрососудистых структурообразования, а также тех, для оценки количества микрососудистых ростки и длина отдельных микрососудистых ростки (№ SP и Ле. С.П., соответственно) может быть определена. -Оптимального контраста между изображен черный структур судна и белый фон способствует подробный анализ изображений в большинстве коммерческих морфометрических компьютеризированных программ.
- В большинстве случаев основными переменными В. А. и МВЛ, которое при умножении вместе генерировать общая длина капилляров (TMVL).
8. Статистический анализ
Обычно мы используем стандартные непараметрические Mann-Whitney U-тест для анализа непарных (двусторонний) наблюдений. Среднее четыре брыжеечной окон на одно животное используется как независимые данные точки для каждой переменной брыжеечной окна. Критерия статистической значимости Р ≤ 0,05.
Discussion
Анализ был введен в 1986 году и имеет 3 последовательно получили дальнейшее развитие и уточнение в нашей лаборатории 7,10-12. Как отмечалось в обзорных статьях (приглашен) 1, 2, анализа сравнивает хорошо с других млекопитающих в естественных условиях анализа ангиогенеза в отношении особенно важны такие функции, как взрослые ткани тест изначально васкуляризированной и недостатки физиологического ангиогенеза; минимальные травмы, если таковые имеются, нанесенных ткани; действительно количественные переменные измерены, которая позволяет звуковой статистический анализ по доза-реакция и молекулярно-активность исследований; прорастания кровеносных сосудов происходит, который преобладает в нормальных тканях и опухолей, а также данных о токсичности легко накапливаются в крысах, которые растут энергично физиологически во взрослом возрасте. Невыгодные особенности могут включать то, что анализ является сравнительно много времени, особенно при оценке количества и длины отдельных сегментов капилляров и микрососудов ростки, что оно не позволяет real-time/serial наблюдений, и что она вряд ли подойдет для мышей так как многие брыжеечной окнами у мышей отсутствие потенциальных микрососудов родителей, из которых новые капилляры могут возникать.
В режиме реального времени наблюдения, однако, включены по прижизненной микроскопии, где экстериоризируется но нетронутыми брыжеечной окна растопыренными над столике микроскопа в то время как животное под наркозом, как описано в 1.
Значительные достижения в области ангиогенеза исследования были достигнуты в последние десятилетия с использованием моделей, таких как роговицы micropocket, цыпленок chorioallantoic мембраны, и подкожно анализов Матригель вилки, которые являются полезными, но в конечном счете, ограниченные средства. Будущее клинического применения антиангиогенного и проангиогенных терапии необходимость создания и проверки более чувствительным и биологически значимым, по-настоящему количественные доклинических моделях, например, описанный в настоящем докладе.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Финансовую поддержку для большинства исследований были предоставлены шведским Советом по медицинским исследованиям (грант 5942).
Materials
| Buffers and reagents | |||
| 0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest. |
|||
| Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest. |
|||
| TBS (pH 7.4) To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest. |
|||
| Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2) Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8). |
|||
| Sucrose solution 2.5% Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8). |
|||
| Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4) Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4). |
|||
| Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide (Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4). |
|||
| ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer. Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer. ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4). |
|||
| Mix these solutions 20 minutes before use! | |||
| Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.) | |||
| This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain. | |||
| Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols. |
|||
| Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503). DAB= 3,3’-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015). Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665). Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden) |
References
- Norrby, K.
- Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).
- Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery. Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).
- Norrby, K.
- Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A. Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).
- Norrby, K. Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo. J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).
- Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &, T. uneberg, S, Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat. Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).
- Norrby, K.
- Norrby, K., Nordenhem, A. Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo. APMIS. 118, 949-957 (2010).
- Norrby, K. Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis. Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).
- Norrby, K. Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis. Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).
- Norrby, K. Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis. Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).
