Summary
Een geautomatiseerde myography methode voor kracht metingen in geïsoleerde mesenteriale bloedvaten wordt beschreven. Er werken een Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A om reacties te bepalen fenylefrine en extracellulair calcium. De methode zorgt voor consistente bepaling van de isometrische reacties op agonisten in kleine vaten van de diameters van 60 - 300 urn, onafhankelijk van elkaar.
Abstract
Proximale weerstand schepen, zoals de mesenteriale bloedvaten, dragen substantieel bij aan de perifere weerstand. Deze kleine schepen van tussen de 100 tot 400 micrometer diameter functie in de eerste plaats in het sturen van de bloedtoevoer naar verschillende organen op basis van de algemene eisen van het lichaam. De rat a. mesenterica heeft een diameter van meer dan 100 micrometer. De myography techniek, het eerst beschreven door Mulvay en Halpern 1, was gebaseerd op de methode voorgesteld door Bevan en Osher 2. De techniek geeft informatie over kleine schepen onder isometrische omstandigheden, waarbij aanzienlijke verkorting van de spier bereiding wordt voorkomen. Aangezien de productie van kracht en gevoeligheid van vaartuigen naar de verschillende agonisten is afhankelijk van de mate van stretch, volgens de actieve spanning-lengte relatie, is het essentieel om krimp studies uit te voeren onder isometrische omstandigheden om de naleving van de montage van kabels te voorkomen. Roestvrijstalen draden verdienen de voorkeur boven wolfraam draden als gevolg van oxidatie van de laatste, die opgenomen reacties 3 beïnvloedt. De techniek maakt de vergelijking van agonist-geïnduceerde contracties van gemonteerde schepen te verkrijgen bewijs voor de normale functie van vasculaire gladde spiercellen receptoren.
Hebben we aangetoond in diverse studies dat geïsoleerde mesenterica slagaders die zijn aangegaan met phenylyephrine ontspannen na toevoeging van cumulatieve concentraties van extracellulair calcium (Ca 2 + e). De bevindingen leidde ons naar dat perivasculaire gevoelszenuwen, die de G-eiwit gekoppelde Ca 2 +-sensing receptor (CaR) express slot bemiddelen deze vasorelaxation reactie. Met behulp van een geautomatiseerde draad myography methode, we zien hier dat mesenterica slagaders van Wistar, Dahl zout-gevoelige (DS) en Dahl zout-bestendig (DR) anders ratten reageren op Ca 2 + e. Weefsels van Wistar ratten werden hogere Ca 2 +-gevoeligheid in vergelijking met die van DR en DS. Verminderde CaR uitdrukking in mesenteriale arteriën van DS ratten correleert met een verminderde Ca 2 + e-geïnduceerde relaxatie van geïsoleerde, pre-gecontracteerde slagaders. De gegevens suggereren dat de auto nodig is voor ontspanning van mesenteriale bloedvaten onder verhoogde adrenerge toon, zoals bij hypertensie, en geef een eigen gebrek van de CaR signaalweg in Dahl dieren, die veel strenger in de DS.
De methode is handig bij het bepalen van vasculaire reactiviteit ex vivo in mesenteriale weerstand slagaders en soortgelijke kleine bloedvaten en vergelijkingen tussen de verschillende agonisten en / of antagonisten kunnen eenvoudig en consistent worden beoordeeld side-by-side 6,7,8.
Protocol
1. Isolatie van ratten mesenteriale kleine slagader
- Verdoven van dieren met isofluraan in een gesloten kamer en veeg de buik met alcohol.
- Voer een mid-line laparotomie naar mesenteriale bed bloot te leggen.
- Met een schaar, verwijdert u ongeveer 85 cm van de darm met het voeden bloedvaten met de a. mesenterica superior. Snij het proximale uiteinde van de darm gedeelte dicht bij de pylorus en het distale einde de buurt van de ileo-coecal kruising. Segmenten van de darm geïsoleerd zijn van ratten die zijn diep onder narcose gebracht met isofluraan en gedood door de open-kist cardiale punctie.
- Geplaatst weggesneden gedeelte in een gecoate petrischaaltje met PSS en het uitvoeren van de dissectie van de a. mesenterica bij kamertemperatuur.
- Vastpinnen het proximale uiteinde van de darm aan de rechter kant en speld uit de rest van de intestineina tegen de klok richting (ieproximal einde aan de linker voeden vaatstelsel aan de andere kant van de darm).
- Ontleden van de tak II en III segmenten samen met een stuk van de proximale segment.
- Ontleden van de ader en isoleren van de slagader (met V-vormige tak punt) en reinig deze door het verwijderen van het vet-en bindweefsel. Vermijd direct contact met de slagader door te trekken voorzichtig met een pincet en snijden door het membraan van het bindweefsel.
2. Montage van het schip
- Knip twee korte segmenten (≈ 4 cm) van een 40 um wolfraam-vrij roestvrij staaldraad en, met een fijne tang, plaatst u een in het lumen van elke slagader zorg ervoor dat u het endotheel beschadigen. Gebruik de draad tip om het lumen te openen indien nodig. Bloed stroomt uit van het schip is een goed teken het lumen wordt geopend.
- Vul de myograph kamer met fysiologisch zout-oplossing (PSS, mM: 115 NaCl, KCl 4,7, 1,4 MgSO 4 0.7 H 2 O, 5 NaHCO 3, 1,2 K 2 HPO 4, 1,1 Na 2 HPO 4, 1,0 CaCl 2, 20 en HEPES 5 glucose, pH 7,4) met ascorbinezuur (100 uM) bij 37 ° C en het gebruik van tang voorzichtig overdracht van de schroefdraad schip segment van de petrischaal in de kamer bij kamertemperatuur en breng de weggesneden proximale schip segment naar de myograph kamer en trek de eind langs de draad om het te voeden in het vat. Voorkomen dat zich uitstrekt van het schip.
- Veilig de nabije uiteinde van de draad tegen de klok in de nabije schroef aan de rechter kaak aangesloten op de micrometer. Vang het vrije uiteinde van de draad met een tang en zet het vast met de klok mee onder de ver schroef aan de rechter kaak. Zorg ervoor dat het schip segment langs de draad is gelegen in de kloof tussen de kaken zonder enig contact met de kaak zelf.
- Uit elkaar schroeven van de kaken, en lijn de tweede draad parallel met het schip en plaats deze in de andere kant van het lumen. Zacht voer de draad door het lumen van het schip segment in een beweging met behulp van de reeds gemonteerde draad als een gids. Houd de draad ongeveer 1 cm van het schip om te voorkomen dat te rekken tijdens de manoeuvre, en raak het endotheel.
- Schroef de kaken en ervoor te zorgen dat de tweede montage draad beweegt onder de eerste een beveiligd op de rechter kaak.
- Veilig de nabije einde van de tweede draad in een richting van de klok onder de nabije bevestigingsschroef van de linker kaak aangesloten op de transducer.
- Zet het uiteinde van de draad onder de schroef aan de linker kaak en draai om de draad te rekken.
- Zodra montage is voltooid, moet u de motor in de "Montage Menu" en start normalisering van het schip.
3. Normalisatie
De Auto Dual Wire Myograph System-510A heeft een automatische normalisatie-functie, die wordt beoordeeld vanuit de "normalisatie" menu en laat het vaartuig worden uitgerekt tot een genormaliseerde interne omtrek van een gestandaardiseerde procedure volgens protocol van de fabrikant na evenwichtsinstelling gedurende 30 min bij 37 ° C. Een exponentiële curve wordt dan aangebracht op de interne omtrek druk van data. De procedure bepaalt de lumen diameter (d 100), dat de slagader zou hebben gehad in vivo bij het ontspannen en onder een transmurale druk van 100 mmHg 1 De normalisering parameters voor de rat a. mesenterica zijn als volgt.:
- Doel transmurale druk = 13,3 kPa (100 mm Hg).
- Tijd = 60 sec; Duur van elk van de normalisatie stappen.
- IC 1 / IC 100 = 0,9 (IC 1 = de genormaliseerde interne omtrek, IC 100 = interne omtrek overeenkomt met doel druk.
- Oculair kalibratie 2 * Δ (mm / oculair divisie), 2 delta is voor het programmeren van redenen.
Meet de lengte van de gemonteerde a. mesenterica met behulp van de microscoop oculair metingen wanneer de haarlijnen zijn over de heinde en ver uiteinden van het schip gemonteerde segment. In het kort, is de lengte van het schip gemonteerde segment gemeten bij maximale vergroting met een gekalibreerde oculaire eye-stuk in de dissectie microscoop. Het oog-stuk te lezen met haar-lijn over het einde van het segment (een 1) en de nabije einde van het segment (een 2) in oculaire divisies worden gemeten en geregistreerd. Deze waarden, met de micrometer lezingen, zijn voor en na het uitrekken van de schip geregistreerd en opgenomen in de menu's voor het programma om de aangepaste curve en de inwendige diameter die overeenkomt met de doelgroep een transmurale druk van 100 mm Hg te berekenen
In onze studies werden de slagaders ingesteld op de lumen diameter van d 1 = 0,9 xd 100, wat de werkzame kracht ontwikkeling maximaal is. Actieve kracht ontwikkeling van ≥ 10 mN in de rat mesenteriale slagaders wordt beschouwd als optimaal voor experimenten om door te gaan. Weefsels met een lagere actieve kracht waren weggegooid.
4. Meting van de reacties
Na normalisatie, zijn de mechanische en functionele eigenschappen van de schepen opnieuw geactiveerd door het uitvoeren van een "standaard start", die uitdagend schepen gaat van herhaalde verzoeken (meestal 2 of 3) van 5 uM fenylefrine (PE) te verkrijgen reproduceerbare contracties. Een typische "standaard start" in ons laboratorium bestaat uit een serie van stimulaties en wash-out periode als volgt:
- Vervang myograph kamerdeksel en begin beluchting met 95% lucht en 5% CO 2.
- Vul de kamer met verse PSS (met 100 uM ascorbinezuur)
- Contract schip met 5 uM PE gedurende 5 minuten en was vier keer met PSS buffer.
- Na de laatste wasbeurt, vul kamer met PSS en wacht drie minuten voor herhalen van stappen (ii) en (iii).
Na de standaard start, de slagader is klaar voor het experiment. Relaxaties van gecontracteerde schepen zijn beoordeeld door cumulatief toevoeging van toenemende concentraties van CaCl 2 (0,5 - 4 mm). Wanneer remmers worden gebruikt schepen zijn vooraf geïncubeerd met de verbindingen in de myograph kamer voor 20 min en aanwezig zijn tijdens de testen.
5. Data Analysis
De "normalisatie" gegevens voor schepen en kracht traces, direct omgezet naar tekstgegevens, werden geanalyseerd met de SigmaPlot 11,0 grafische programma (systat Software, Point Richmond, CA) en uitgezet als weergegeven in figuur 1. Concentratie-respons-gegevens, berekend op basis van de traces, werden geanalyseerd door het bepalen van EC 50-waarden van de experimentele gegevens gemonteerd op een vier-parameter logistische functie in het menu Farmacologie van het programma. Vergelijkingen tussen groepen en binnen groepen werden uitgevoerd door One Way Variantie-analyse (ANOVA) en verschillen met p <0,05 worden beschouwd als significant.
6. Representatieve resultaten:
| Parameters | Wistar | Dahl Salt-Sensitive | Dahl Salt-Resistant |
|---|---|---|---|
| L 100 (pm) | 83.26 ± 2.33 | 91.52 ± 4.67 | 117,45 ± 8,43 * |
| X 1 | 604,21 ± 41,97 | 752,24 ± 85,25 | 745,84 ± 110,09 |
| r 2 | 0,99 ± 0,003 | 0,97 ± 0,008 | 0,97 ± 0,007 |
* Het verschil tussen L 100 waarden voor Wistar en DR zijn statistisch significant. Shapiro-Wilk normaliteit Test doorgegeven (p = 0,588); gelijke variantie Test doorgegeven (p = 0,237).
L 100 = interne diameter van de gemonteerde segment die overeenkomt met het doel transmurale druk.
X 1 = De micro-klepstandsteller instelling nodig is om de gemonteerde schip strekken om de genormaliseerde interne omtrek (dat wil zeggen de waarde van de micrometer te lezen waar experimenten werden uitgevoerd).
r 2 = regressiecoëfficiënt voor de pasvorm van (X i, Y i) een exponentiële curve.
NB: De gedetailleerde procedure is beschreven in de handleiding voor de 510A Myograph System 6.
Tabel 1. Sample Lees-out van de normalisatie parameters voor de a. mesenterica segmenten van Wistar, DS en DR van Basic-programma getoond in de "Normalisatie Menu". Waarden zijn middelen (± SEM) van 5 dieren. * Verschillen tussen L 100 waarden voor Wistar en DS zijn statistisch significant (p <0,05).
| Wistar | DS | DR |
|---|---|---|
| 14,2 ± 0,6 | | 20,9 ± 1,3 * | |
Tabel 2. Ontwikkeld spanningen (MN) in mesenterica slagaders geïsoleerd van Wistar, DS en DR ratten, volgende toepassingen van 5 uM PE per vaartuig. Gerapporteerde waarden zijn gemiddelden (± SEM) van 6-8 dieren. * Significant verschillend van Wistar controles (p <0,05).
Figuur 1. Ca 2 + e-geïnduceerde relaxatie van een PE-gecontracteerde a. mesenterica van een Wistar rat gemonteerd in een draad myograph in een fysiologische zoutoplossing met 1 mM Ca 2 +. De slagader werd geëquilibreerd gedurende 30 minuten bij 37 ° C met een constante beluchting en de reacties op Ca 2 + e bepaald. Een vertegenwoordiger van kracht tracing bij toevoeging van 5 uM PE gevolgd door de cumulatieve toevoegingen van Ca 2 + wordt weergegeven.
Figuur 2. Ca 2 + e-geïnduceerde relaxatie van een PE-gecontracteerde a. mesenterica van een DS rat gemonteerd in een draad myograph in een fysiologische zoutoplossing met 1 mM Ca 2 +. De slagader werd geëquilibreerd gedurende 30 minuten bij 37 ° C met een constante beluchting en de reacties op Ca 2 + e bepaald. Een vertegenwoordiger van kracht tracing bij toevoeging van 5 uM PE gevolgd door de cumulatieve toevoegingen van Ca 2 + wordt weergegeven. Ca 2 + ontspanning was ernstig aangetast in dit weefsel in vergelijking met die van Wistar ratten en DR.
Figuur 3. Ca 2 + e-geïnduceerde relaxatie van een PE-gecontracteerde a. mesenterica van een DR rat gemonteerd in een draad myograph in een fysiologische zoutoplossing met 1 mM Ca 2 +. De slagader werd geëquilibreerd gedurende 30 minuten bij 37 ° C met een constante beluchting en de reacties op Ca 2 + e determined.A vertegenwoordiger van kracht tracing bij toevoeging van 5 uM PE gevolgd door de cumulatieve toevoegingen van Ca 2 + wordt weergegeven.
Figuur 4. A. [Ca 2 +] e-respons curves. B. Bar grafiek met EC 50-waarden voor de ontspanning wordt bepaald door de montage van de gegevens naar een vier parameter logistiek curve.C.CaR uitdrukking in mesenteriale arcades geïsoleerd van DR en DS ratten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hypertensie is een belangrijke oorzaak van cardiovasculaire, cerebrale en renale morbiditeit / mortaliteit. Het optreden van hypertensie is hoog in de bevolking en zout-gevoelige hypertensie is vooral hoog in de vergrijzing van de bevolking, en vaker voor bij zwarten dan blanken. Dit is vermoedelijk te wijten aan de neiging van de zwarten aan natrium te behouden in hun nieren 9. Zout-gevoeligheid is een belangrijke factor voor nierziekte en wordt geassocieerd met endotheliale dysfunctie, maar het mechanisme is niet volledig begrepen. Recente studies in ons laboratorium hebben uitgewezen dat een hoog zout dieet interstitiële vocht te verminderen Ca 2 +-concentratie ([Ca 2 +] IF), en de verhoging van de systolische druk in zout-gevoelige ratten 10,11. Deze effecten kunnen worden toegeschreven aan verlaagde expressie van de auto in mesenteriale arteriën en kidneys.Finding vergelijkbare reducties in CaR niveaus in zout-gevoelige patiënten met hypertensie kan een doelwit voor ontwikkeling van nieuwe therapieën te bieden. We zijn met behulp van de automatische draad myography met geïsoleerde mesenterica slagaders van een aantal diermodellen van hypertensie bij vasculaire reactiviteit studie om Ca 2 + e om het mechanisme van CaR signalering in het vaatstelsel te begrijpen.
[Ca 2 +] e in stand wordt gehouden binnen een nauwe bandbreedte (1,1 - 1,4 mm) bij de mens 12, dus de auto moet in staat zijn om kleine veranderingen in [Ca 2 +] e voor receptor activering mogelijk te maken. In feite is de auto is aangetoond dat kleine veranderingen op te sporen in Ca 2 + e 13, en een kleine toename in [Ca 2 +] IF die zich binnen de fysiologische range 14. In situ microdialyse studies meten van [Ca 2 +] IF in de duodenale submucosa en nieren cortex, twee weefsels die essentieel zijn voor de regulatie van perifere weerstand en bloeddruk (BP), toonde aan dynamische veranderingen als een functie van de darm lumen [Ca 2 +]. Toenemende gut [Ca 2 +] 0-6 mM, verhoogde de [Ca 2 +] IF 1,1 tot 1,9 mM 4,5,15, die in het bereik vastgesteld dat zij het perivasculaire zenuwen CaR 16 te activeren, en te ontspannen geïsoleerde mesenteriale slagaders 17. We hebben ook aangetoond dat de auto afneemt detecteert in [Ca 2 +] e en verhoging van de actie potentiaal duur door middel van activatie van de niet-selectieve kation kanaal, die op hun beurt verzwakt de impact op de release kans op neocorticale terminals 18. Dit suggereert dat de CaR pre-synaptische feedback geeft aan de hersenen prikkelbaarheid veranderen in reactie op de Ca 2 + e. Bovendien desensitisatie van de PVN CaR gebeurt met herhaalde, langdurige stimulatie 16, wat suggereert dat een begrip van de regulering van deze receptor zal haar rol te verduidelijken, zowel onder normale en hypertensieve condities. Bukoski en collega's hebben aangetoond dat kleine veranderingen in [Ca 2 +] IF zijn voldoende om de CaR te activeren en vasodilatoire synthese bij te dragen onder normale omstandigheden 3,4.19,. Op basis van deze waarnemingen, postuleren we dat deze reactie ook zal optreden onder omstandigheden van verhoogde vasculaire tonus zoals te zien bij hypertensie en kunnen derhalve worden benut om de bloeddruk te controleren. De studie van CaR activering en hoe dit leidt tot fosforylatie van signalering tussenproducten is dus verplicht om haar rol in de normale en hypertensieve fysiologie sonde. De auto is G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) en is geregeld via dezelfde mechanismen als andere GPCR's, die gemeenschappelijk zijn therapeutische doelwitten. Daarom zal het begrijpen van de mechanismen van de regulatie in de bloedvaten nuttige gegevens om zijn potentieel te bepalen als een doelwit voor anti-hypertensieve therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Het beschreven project werd ondersteund door Award Numbers R01 HL064761, R25 HL059868, 1SC1 HL099139 en P20 MD000175 vorm National Institutes of Health. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc. | Atlanta, GA. | 100151 | |
| PowerLab/4SP Data Acquisition System |  ADInstruments |
ML750 | New models with 4-16 input channels are available. |
| Dell Dimension XPS Gen 4 Computer | Dell | ||
| Stemi SV II (Apo) Dissection Microscope with Ocular | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Wistar, Dahl salt-sensitive, Dahl salt-resistant rats | Harlan Laboratories | ||
| Rodent chow | Harlan Laboratories | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Other chemicals | All chemicals used were of the purest grades available commercially. |
References
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260, 617-619 (1976).
- Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
- Mulvany, M. J. Procedures for investigating of small vessels using small vessel myograph. DMT Danish Myo Technology. , (2004).
- Angus, J. A., Wright, C. E. Techniques to study the pharmacodynamics of isolated large and small blood vessels. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 44, 395-407 (2000).
- Halpern, W., Mulvany, M. J., Warshaw, D. M. Mechanical properties of smooth muscle cells in the walls of arterial resistance vessels. J. Physiol. 275, 85-101 (1978).
- Lindhorst, J., Alexander, N., Blignaut, J., Rayner, B. Differences in hypertension between blacks and whites: an overview. Cardiovasc. J. Afr. 18, 241-247 (2007).
- Eley, S. L., Allen, C. M., Williams, C. L., Bukosi, R. D., Pointer, M. A. Action of thiazide on renal interstitial calcium. Am. J. Hypertens. 21, 814-819 (2008).
- Palmer, C. E., Rudd, M. A., Bujoski, R. D. Renal interstitial Ca2+ during sodium loading of normotensive and Dal-salt hypertensive rats. Am. J. Hypertens. 16, 771-776 (2003).
- Hurwitz, S. Homeostatic control of plasma calcium concentration. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 31, 41-100 (1996).
- Brown, E. M., MacLeod, R. J. Extracellular sensing and extracellular calcium signaling. Physiol. Rev. 81, 239-297 (2001).
- Breitwieser, G. E. Extracellular calcium as an integrator of tissue function. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40, 1467-1480 (2008).
- Mupanomunda, M. M., Wang, Y., Bukoski, R. D. Effect of chronic sensory denervation on Ca2+-induced relaxation of isolated mesenteric resistance arteries. Am. J. Physiol. 274, 1655-1661 (1998).
- Mupanomunda, M. M., Ishioka, N., Bukoski, R. D. Interstitial Ca2+ undergoes dynamic changes sufficient to stimulate nerve-dependent Ca2+-induced relaxation. Am. J. Physiol. 276, 1035-1042 (1999).
- Mupanomunda, M. M., Tian, B., Ishioka, N., Bukoski, R. D.
- Awumey, E. M., Hill, S. K., Diz, D. I., Bukoski, R. D. Cytochrome P-450 metabolites of 2-arachidonoylglycerol play a role in Ca2+-induced relaxation of rat mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2363-2370 (2008).
- Chen, W., Bergsman, J. B., Wang, X., Gilkey, G., Pierpoint, C. R., Daniel, E. A., Awumey, E. M., Dauban, P., Dodd, R. H., Ruat, M., Smith, S. M. Presynaptic external calcium signaling involves the calcium-sensing receptor in neocortical nerve terminals. PloS One. 5, e8563-e8563 (2010).
- Bukoski, R. D. The perivascular sensory nerve Ca2+ receptor and blood pressure regulation: a hypothesis. Am. J. Hypertens. 11, 1117-1123 (1998).
- Bukoski, R. D. Dietary Ca2+ and blood pressure: evidence that Ca2+-sensing receptor activated sensory nerve dilator activity couples changes in interstitial Ca2+ with vascular. 16, 218-221 (2001).
