Summary
Une méthode automatisée pour myographie mesures de force dans les artères mésentériques isolées est décrite. Elle emploie un myographe Mulvany-Halpern Auto fil double 510A pour déterminer les réponses à la phényléphrine et le calcium extracellulaire. La méthode permet la détermination constante de réponses isométriques aux agonistes dans les petits vaisseaux de diamètres de 60 - 300 pm, de manière indépendante.
Abstract
Vaisseaux de résistance proximal, comme les artères mésentériques, contribuer sensiblement à la résistance périphérique. Ces petits vaisseaux entre 100-400 um de diamètre en fonction principalement de diriger le flux sanguin vers différents organes en fonction de l'ensemble des besoins du corps. L'artère mésentérique de rat a un diamètre supérieur à 100 um. La technique myographie, d'abord décrit par Mulvay et Halpern 1, était basé sur la méthode proposée par Bevan et Osher 2. La technique fournit des informations sur de petits navires dans des conditions isométriques, où le raccourcissement substantiel de la préparation musculaire est empêchée. Depuis la production de force et de sensibilité des vaisseaux aux différents agonistes dépend de la mesure d'étirement, d'après les tensions actifs longueur relation, il est essentiel de mener des études de contraction isométrique dans des conditions pour empêcher le respect des fils de montage. Fils d'acier inoxydable sont préférables à des fils de tungstène en raison de l'oxydation de ce dernier, ce qui affecte les réponses enregistrées 3. La technique permet la comparaison des agonistes induit des contractions des vaisseaux montés pour obtenir des preuves pour la fonction normale de la lisse vasculaire récepteurs des cellules musculaires.
Nous avons montré dans plusieurs études qui artères mésentériques isolées qui sont contractés avec phenylyephrine détendre lors de l'addition des concentrations cumulées de calcium extracellulaire (Ca 2 + e). Les résultats nous ont amenés à conclure que les nerfs sensoriels périvasculaire, qui expriment les protéines G couplées Ca 2 +-récepteur sensible (RCA), la médiation de cette réponse vasorelaxation. En utilisant une méthode automatisée de fil myographie, nous montrons ici que d'artères mésentériques Wistar, Dahl sensibles au sel (DS) et Dahl résistant au sel (DR) des rats réagissent différemment à Ca 2 + e. Les tissus de rats Wistar ont montré supérieur Ca 2 +-sensibilité, par rapport à ceux de DR et DS. Réduction d'expression CaR dans les artères mésentériques de rats DS est en corrélation avec réduction de Ca 2 + e-relaxation induite par des isolés, pré-contractés artères. Les données suggèrent que la voiture est nécessaire pour la relaxation des artères mésentériques dans ton adrénergique accrue, comme c'est le cas dans l'hypertension, et d'indiquer un défaut inhérent à la voie de signalisation dans CaR animaux Dahl, qui est beaucoup plus sévère dans DS.
La méthode est utile pour déterminer la réactivité vasculaire ex vivo dans les artères de résistance mésentériques et semblables petits vaisseaux sanguins et des comparaisons entre les différents agonistes et / ou antagonistes peuvent être facilement et systématiquement évalués côte à côte 6,7,8.
Protocol
1. Isolement des rats petite artère mésentérique
- Anesthetize animal avec l'isoflurane dans une chambre fermée et essuyez l'abdomen avec de l'alcool.
- Effectuer une laparotomie mi-ligne d'exposer lit mésentérique.
- Avec des ciseaux, retirez environ 85 cm de l'intestin avec une alimentation vasculaire avec l'artère mésentérique supérieure. Coupez l'extrémité proximale de la section intestinale proche du pylore et l'extrémité distale à proximité de la jonction iléo-cœcale. Les segments de l'intestin sont isolés de rats qui sont profondément anesthésiés à l'isoflurane et euthanasiés par thorax ouvert ponction cardiaque.
- Placé section excisée dans un plat recouvert de Pétri contenant du PSS et effectuer la dissection de l'artère mésentérique à température ambiante.
- Pin bas de l'extrémité proximale de l'intestin sur le côté droit et broche le reste de l'intestineina le sens inverse (fin ieproximal sur la vascularisation d'alimentation à gauche sur la face cachée de l'intestin).
- Disséquer la Seconde branche et les segments III avec un morceau du segment proximal.
- Disséquer la veine et d'isoler l'artère (avec point de ramification en forme de V) et le nettoyer en enlevant les tissus adipeux et conjonctifs. Éviter tout contact direct avec l'artère en tirant doucement avec des pinces et couper à travers la membrane du tissu conjonctif.
2. Montage de bateau
- Coupez deux courts segments (≈ 4 cm) d'un de tungstène sans fil 40 um en acier inoxydable et, avec une pince fine, insérer une dans le lumen de chaque artère en prenant soin de ne pas endommager l'endothélium. Utilisez la pointe métallique pour ouvrir la lumière si nécessaire. Sang coulant hors du navire est un bon signe de la lumière est ouvert.
- Remplir la chambre myographe avec du sérum physiologique (PSS; mM: NaCl 115, KCl 4,7, 1,4 MgSO 4 .7 H 2 O, 5 NaHCO 3, 1,2 K 2 HPO 4, 1,1 Na 2 HPO 4, 1,0 CaCl2, 20 HEPES et 5 glucose, pH 7,4) avec de l'acide ascorbique (100 uM) à 37 ° C et en utilisant une pince transférer soigneusement le segment des navires fileté de la boîte de Pétri dans la chambre à température ambiante et le transfert du segment de vaisseau excisée proximale à la chambre myographe et tirez le fin le long du fil pour l'alimenter dans la cuve. Évitez d'étirer le navire.
- Fixez l'extrémité proche du câble dans le sens antihoraire sous la vis de fixation proximité sur la mâchoire droite connectée au micromètre. Catch l'extrémité libre du fil avec des pinces et sécuriser le sens des aiguilles sous les vis de fixation présent sur la mâchoire droite. Assurez-vous que le segment des navires le long du fil se trouve dans l'écart entre les mâchoires sans aucun contact avec la mâchoire elle-même.
- Vis les mâchoires, et d'aligner le deuxième fil en parallèle avec le navire et l'insérer dans l'extrémité de la lumière. Doucement le fil à travers l'alimentation de la lumière du segment de vaisseau en un seul mouvement en utilisant le câble déjà monté comme un guide. Tenir le fil d'environ 1 cm de la cuve pour éviter l'étirant pendant la manœuvre, et éviter de toucher l'endothélium.
- Vis les mâchoires ensemble et s'assurer que le second fil de montage se déplace sous le premier sécurisé sur la mâchoire droite.
- Fixez l'extrémité proche du deuxième fil dans le sens horaire sous la vis de fixation près de la mâchoire gauche relié au capteur.
- Fixez l'extrémité du fil sous la vis de fixation sur la mâchoire gauche et serrer à étirer le fil.
- Une fois le montage terminé, remettez le moteur dans le «Menu de montage" et de commencer la normalisation de la cuve.
3. Normalisation
Le myographe fil automatique du système double-510A a une fonction de normalisation automatisé, qui est évaluée à partir de la "normalisation" du menu et permet au navire d'être étiré à une circonférence normalisé interne par une procédure standardisée selon le protocole du fabricant après équilibration pendant 30 min à 37 ° C. Une courbe exponentielle est alors monté sur les données internes de pression circonférence. La procédure définit le diamètre de la lumière (D 100) que l'artère aurait eu in vivo lorsque détendu et sous une pression transmurale de 100 mmHg 1 Les paramètres de normalisation pour l'artère mésentérique de rat sont comme suit.:
- La pression transmurale Target = 13,3 kPa (100 mm Hg).
- Temps = 60 sec; Durée de chacune des étapes de normalisation.
- IC 1 / IC 100 = 0,9 (IC 1 = circonférence normalisé interne, IC 100 = circonférence interne correspondant à la pression cible.
- 2 calibration oculaire * Δ (mm / oculaire division); 2 delta est pour des raisons de programmation.
Mesurer la longueur de l'artère mésentérique montés à l'aide du microscope oculaire lectures lorsque les déliés sont sur les extrémités près et de loin la SEGM montés sur navireENT. En bref, la longueur du segment de vaisseau monté est mesurée à un grossissement maximum avec un oculaire calibré oculaire dans le microscope de dissection. La lecture de l'oculaire avec des cheveux en ligne sur l'extrémité du segment (a 1) et l'extrémité proche du segment (a 2) dans les divisions oculaires sont mesurés et enregistrés. Ces valeurs, avec les lectures du micromètre, avant et après étirement du navire sont enregistrées et sont entrés dans les menus pour le programme pour calculer la courbe ajustée et le diamètre intérieur correspondant à la pression transmurale une cible de 100 mm Hg
Dans nos études, les artères ont été mis au diamètre de la lumière d 1 = 0,9 xd 100, où le développement des forces actives est maximal. Développement de la force active de ≥ 10 mN dans les artères mésentériques du rat est considéré comme optimal pour des expériences de procéder. Tissus avec force active inférieure ont été rejetées.
4. Mesure des réponses
Après normalisation, les propriétés mécaniques et fonctionnelles des navires sont réactivés en effectuant un "démarrage standard», qui implique des navires difficiles avec des applications répétées (normalement 2 ou 3) de 5 uM phényléphrine (PE) afin d'obtenir des contractions reproductibles. Un typique "démarrage standard» dans notre laboratoire consiste en une série de stimulations et de périodes de sevrage comme suit:
- Remplacer la chambre myographe couvercle et commencer aération avec 95% d'air et 5% de CO 2.
- Remplir la chambre avec PSS fraîche (contenant l'acide ascorbique 100 uM)
- Contrat avec cuve 5 PE uM pendant 5 min et laver 4 fois avec un tampon PSS.
- Après le dernier lavage, la chambre de remplissage avec PSS et attendre 3 minutes avant de répéter les étapes (ii) et (iii).
Après le démarrage standard, l'artère est prêt pour l'expérience. Relaxations de navires sous contrat sont évalués par addition cumulée des concentrations croissantes de CaCl 2 (0,5 - 4 mm). Lorsque les bateaux inhibiteurs utilisés sont pré-incubées avec les composés dans la chambre de myographe pendant 20 minutes et présenter lors des dosages.
5. Analyse des données
La «normalisation» des données pour les navires et les tracés vigueur, directement convertis en données texte, ont été analysées avec le programme SigmaPlot 11,0 graphique (Systat Software, Point Richmond, CA) et tracées comme le montre la figure 1. Concentration-réponse des données, calculées à partir des tracés, ont été analysés par la détermination de valeurs de CE 50 à partir de données expérimentales équipé d'une fonction logistique à quatre paramètres dans le menu de Pharmacologie du programme. Comparaisons entre les groupes et au sein des groupes ont été réalisées par une analyse de variance (Anova) et les différences avec 0,05 <p sont considérées comme significatives.
6. Les résultats représentatifs:
| Paramètres | Wistar | Dahl sensibles au sel | Dahl résistant au sel |
|---|---|---|---|
| L 100 (um) | 83,26 ± 2,33 | 91,52 ± 4,67 | 117,45 ± 8,43 * |
| X 1 | 604,21 ± 41,97 | 752,24 ± 85,25 | 745,84 ± 110,09 |
| r 2 | 0,99 ± 0,003 | 0,97 ± 0,008 | 0,97 ± 0,007 |
* La différence entre les valeurs de L 100 Wistar et DR sont statistiquement significatives. Test de normalité de Shapiro-Wilk passé (p = 0,588); test de variance égale passé (p = 0,237).
L 100 = diamètre intérieur du segment de montée correspondant à la pression transmurale cibles.
X 1 = Le réglage du positionneur micro requise pour étirer le navire monté sa circonférence interne normalisée (ie la valeur de la lecture du micromètre au cours de laquelle les expériences ont été effectuées).
r 2 = coefficient de régression pour un ajustement de (X i, Y i) à une courbe exponentielle.
NB: La procédure détaillée est décrite dans le manuel pour le système 510A myographe 6.
Tableau 1. Exemple de lecture des paramètres de normalisation pour des segments de l'artère mésentérique du Wistar, DS et DR du programme de base indiqué dans le "Menu Normalisation". Les valeurs sont des moyens (± SEM) de 5 animaux. * Les différences entre les valeurs de L 100 Wistar et DS sont statistiquement significatifs (p <0,05).
| Wistar | DS | DR |
|---|---|---|
| 14,2 ± 0,6 | | 20,9 ± 1,3 * | |
Tableau 2. Tensions se sont développées (Mn) dans les artères mésentériques isolées de Wistar, les rats DS et DR, la suite d'applications de 5 uM PE pour chaque navire. Les valeurs indiquées sont des moyens (± SEM) de 6-8 animaux. * Significativement différent du contrôle Wistar (p <0,05).
Figure 1. Ca 2 + e-relaxation induite d'une artère mésentérique PE-traitance d'un rat Wistar monté dans un myographe fil dans une solution saline physiologique contenant 1 mM de Ca 2 +. L'artère a été équilibrée pendant 30 min à 37 ° C avec une aération constante et réponses à Ca 2 + e déterminé. A force représentative de traçage sur plus de 5 M PE suivie par les ajouts cumulatifs de Ca 2 + est affiché.
Figure 2. Ca 2 + e-relaxation induite d'une artère mésentérique PE-traitance d'un rat DS monté dans un myographe fil dans une solution saline physiologique contenant 1 mM de Ca 2 +. L'artère a été équilibrée pendant 30 min à 37 ° C avec une aération constante et réponses à Ca 2 + e déterminé. A force représentative de traçage sur plus de 5 M PE suivie par les ajouts cumulatifs de Ca 2 + est affiché. Ca 2 + de relaxation a été gravement compromise dans ce tissu par rapport à ceux de rats Wistar et DR.
Figure 3. Ca 2 + e-relaxation induite d'une artère mésentérique PE-traitance d'un rat DR monté dans un myographe fil dans une solution saline physiologique contenant 1 mM de Ca 2 +. L'artère a été équilibrée pendant 30 min à 37 ° C avec une aération constante et réponses à Ca 2 + e determined.A force représentative de traçage sur plus de 5 M PE suivie par les ajouts cumulatifs de Ca 2 + est affiché.
Figure 4. A. [Ca 2 +] e courbes de réponse. Diagramme à barres montrant B. valeurs de CE 50 pour la relaxation déterminées en ajustant les données pour une expression à quatre paramètres curve.C.CaR logistiques dans les arcades mésentériques isolés de rats DR et DS.
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Discussion
L'hypertension est une cause majeure de morbidité cardio-vasculaires, cérébrales et rénales / mortalité. La survenue d'une hypertension est élevé dans la population et sensibles au sel hypertension est particulièrement élevée dans la population vieillissante, et plus répandu chez les Noirs que les Blancs. Ceci est considérée comme étant due à la tendance des noirs à retenir de sodium dans leurs reins 9. La sensibilité au sel est un facteur majeur contribuant à la maladie rénale et est associée à une dysfonction endothéliale, mais le mécanisme n'est pas entièrement comprise. De récentes études dans notre laboratoire ont révélé que les régimes alimentaires en sel de réduire le liquide interstitiel Ca 2 + de concentration ([Ca 2 +] SI), et augmentation de la pression systolique chez les rats sensibles au sel 10,11. Ces effets peuvent être attribués à l'expression réduite des voitures dans les artères mésentériques et kidneys.Finding réductions similaires des taux CaR dans sensibles au sel chez les patients hypertendus pourrait constituer une cible pour le développement de nouvelles thérapies. Nous avons été en utilisant les fils myographie automatisé avec artères mésentériques isolées à partir d'un certain nombre de modèles animaux d'hypertension pour étudier la réactivité vasculaire à Ca 2 + e pour comprendre le mécanisme de signalisation de CaR dans le système vasculaire.
[Ca 2 +] e est maintenue dans une fourchette étroite (1,1 - 1,4 mm) chez les humains 12, donc la voiture doit être capable de détecter de petits changements de [Ca 2 +] e pour l'activation du récepteur soit possible. En fait, la voiture a été montré pour détecter de petits changements de Ca 2 + e 13 ans, et de petites augmentations de [Ca 2 +] SI qui sont dans la plage physiologique 14. Dans les études de microdialyse in situ de mesure [Ca 2 +] dans le SI duodénaux sous-muqueuse et cortex rénal, deux tissus qui sont essentiels pour la régulation de la résistance périphérique et la pression artérielle (PA), ont montré des changements dynamiques en fonction de l'intestin lumière [Ca 2 +]. L'augmentation de l'intestin [Ca 2 +] de 0 à 6 mm, a augmenté la [Ca 2 +] SI de 1,1 à 1,9 mM 4,5,15, qui est dans la fourchette observée pour activer le CaR nerveuses périvasculaires 16, et se détendre mésentériques isolées artères 17. Nous avons aussi montré que la voiture détecte diminutions de [Ca 2 +] e et d'augmenter la durée du potentiel d'action par l'activation du canal cationique non sélectif, qui à son tour atténue l'impact sur la probabilité de déclenchement aux bornes du néocortex 18. Cela suggère que la voiture offre de pré-synaptique rétroaction pour modifier l'excitabilité du cerveau en réponse à Ca 2 + e. Par ailleurs, la désensibilisation du CaR PVN se produit avec répétés, une stimulation prolongée 16, ce qui suggère que la compréhension de la régulation de ce récepteur permettra de clarifier son rôle dans des conditions normales et hypertendus. Bukoski et ses collègues ont montré que de petits changements de [Ca 2 +] SI sont suffisants pour activer la voiture et de contribuer à la synthèse vasodilatateur dans des conditions normales 3,4.19,. Basé sur ces observations, nous postulons que cette réponse sera également se produire dans des conditions de la tonicité vasculaire augmenté comme on le voit dans l'hypertension et peut donc être exploitée pour contrôler l'hypertension artérielle. L'étude de l'activation de voiture et comment cela conduit à la phosphorylation d'intermédiaires de signalisation est, par conséquent, nécessaire de sonder son rôle dans la physiologie normale et hypertendus. La voiture est G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) et est régie par des mécanismes similaires que d'autres RCPG, qui sont communes cibles thérapeutiques. Par conséquent, la compréhension des mécanismes de sa régulation dans les vaisseaux sanguins fournira des données utiles pour déterminer son potentiel en tant que cible pour le traitement antihypertenseur.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le projet décrit a été soutenu par un nombre Award R01 HL064761, R25 HL059868, 1SC1 HL099139 et P20 MD000175 forme National Institutes of Health. Le contenu est uniquement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut National de la Santé.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc. | Atlanta, GA. | 100151 | |
| PowerLab/4SP Data Acquisition System |  ADInstruments |
ML750 | New models with 4-16 input channels are available. |
| Dell Dimension XPS Gen 4 Computer | Dell | ||
| Stemi SV II (Apo) Dissection Microscope with Ocular | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Wistar, Dahl salt-sensitive, Dahl salt-resistant rats | Harlan Laboratories | ||
| Rodent chow | Harlan Laboratories | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Other chemicals | All chemicals used were of the purest grades available commercially. |
References
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