Medicine

התכווצות העורקים mesenteric ללימודי הרפיה באמצעות Myography בנקאית אוטומטית

Published: September 22, 2011 doi: 10.3791/3119

Lakeesha E. Bridges¹, Cicely L. Williams¹, Mildred A. Pointer^1,2,3, Emmanuel M. Awumey^1,2,3

¹Julius L. Chambers Biomedical/Biotechnology Research Institute, North Carolina Central University, Durham, ²Department of Biology, North Carolina Central University, Durham, ³Department of Physiology & Pharmacology and Hypertension & Vascular Research Center, Wake Forest University School of Medicine

Summary

שיטה myography אוטומטית עבור מדידות כוח בעורקים mesenteric מבודד מתואר. היא מעסיקה Mulvany-Wire הלפרן כפול אוטומטי Myograph 510A לקבוע התגובות phenylephrine וסידן תאיים. השיטה מאפשרת קביעת עקבית של תגובות איזומטרי כדי אגוניסטים בכלי קטן של קטרים של 6-30 מיקרומטר, באופן עצמאי.

Abstract

כלי ההתנגדות הפרוקסימלי, כמו עורקי mesenteric, לתרום באופן משמעותי את התנגדות היקפית. אלו כלי קטן של בין 100-400 מיקרומטר בתפקוד בקוטר בעיקר בהכוונת זרימת הדם לאיברים שונים בהתאם לדרישות הכללית של הגוף. עורק mesenteric עכברוש בעל קוטר גדול מ 100 מיקרומטר. הטכניקה myography, שתוארה לראשונה על ידי Mulvay ו הלפרן ^1, היה מבוסס על השיטה המוצעת על ידי ביוון אושר ^2. הטכניקה מספק מידע על כלי קטן בתנאים איזומטרי, שם קיצור משמעותי של הכנה השריר נמנעת. מאז ייצור כוח ורגישות כלי כדי אגוניסטים שונים תלויה מידת המתיחה, על פי היחס מתח באורך פעיל, חשוב לבצע מחקרים כיווץ איזומטרי בתנאים כדי למנוע קיום של חוטים גובר. חוטי נירוסטה הם העדיפו חוטי טונגסטן בשל חמצון של האחרונה, אשר משפיע על התגובות רשמה ^3. הטכניקה מאפשרת השוואה של אגוניסט-Induced להתכווצויות של כלי רכוב להשיג ראיות לתפקוד תקין של כלי דם לקולטנים המצויים בתאי שריר חלק.

הראינו במספר מחקרים כי העורקים mesenteric מבודדים כי הם התקשרה עם phenylyephrine להירגע על תוספת של ריכוז מצטבר של תאי סידן (Ca ^{2 +} _e). הממצאים הובילו אותנו למסקנה כי עצבי התחושה perivascular, אשר מבטאים את G-חלבון בשילוב Ca ^{2 +} חישה קולטן (CAR), לתווך את התגובה הזאת vasorelaxation. באמצעות שיטה אוטומטית myography תיל, אנו מציגים כאן העורקים mesenteric מ Wistar, דאל מלח רגיש (DS) ו דאל מלח עמידים (DR) חולדות מגיבים באופן שונה Ca ^{2 +} _דואר. רקמות של חולדות Wistar הראה Ca ^{2 +} גבוה יותר רגישות בהשוואה לאלו של DR ו DS. ביטוי רכב מופחתת בעורקים mesenteric מ DS חולדות בקורלציה עם הקטינה Ca ^{2 +} _e-Induced הרפיה של בודדים, טרום חוזה העורקים. הנתונים מראים כי הרכב נדרש הרפיה של העורקים mesenteric תחת הטון adrenergic מוגברת, כפי שקורה יתר לחץ דם, מצביעים על הפגם הטמון מסלול איתות רכב בבעלי חיים דאל, וזה הרבה יותר חמור DS.

השיטה יעילה בקביעת vivo לשעבר תגובתיות כלי הדם בעורקים התנגדות mesenteric דומים כלי דם קטנים השוואות בין אגוניסטים שונים ו / או היריבים ניתן בקלות באופן עקבי העריכו Side-by-הצד ^6,7,8.

Protocol

1. בידוד של העורק mesenteric עכברוש קטן

הרדימי חיה עם isoflurane בתא סגור לנגב את הבטן עם אלכוהול.
בצע laparotomy אמצע קו לחשוף המיטה mesenteric.
בעזרת מספריים, להסיר כ -85 ס"מ של המעי עם האכלה vasculature עם העורק mesenteric מעולה. חותכים את הקצה הפרוקסימלי של קטע המעי קרוב השוער ואת הקצה הדיסטלי ליד צומת ileo-coecal. קטעים של המעי מבודדים חולדות מורדמים עמוק isoflurane ו מורדמים על ידי לנקב הפתוח חזה לב.
מוצב סעיף נכרת בצלחת פטרי מצופה המכילה PSS ולבצע דיסקציה של העורק mesenteric בטמפרטורת החדר.
להצמיד את הקצה הפרוקסימלי של המעי בצד ימין סיכה את שארית בכיוון intestineina נגד כיוון השעון (סוף ieproximal על vasculature האכלה שמאל בצד המרוחק של המעי).
לנתח את השני ענף מגזרים השלישי יחד עם חתיכת קטע הפרוקסימלית.
מנתחים את הווריד ולבודד את העורק (עם נקודת בצורת V הסניף) ולנקות אותו על ידי הסרת שומן ורקמות החיבור. יש להימנע ממגע ישיר עם העורק על ידי משיכת בעדינות עם מלקחיים חיתוך דרך הממברנה של רקמת החיבור.

2. הרכבה של כלי

גזור שני קטעים קצרים (≈ 4 ס"מ) של 40 מיקרומטר ללא טונגסטן חוט נירוסטה, עם מלקחיים בסדר, להוסיף אחת לתוך לומן של עורק אחד נזהר שלא לפגוע האנדותל. השתמש קצה חוט כדי לפתוח את לומן במידת הצורך. הזרמת דם אל מחוץ לכלי סימן טוב לומן נפתח.
מלאו את תא myograph עם תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS: mm: 115 NaCl, KCl 4.7, 1.4 MgSO ₄ 0.7 H ₂ O, 5 NaHCO _3, 1.2 K ₂ HPO _4, 1.1 Na ₂ HPO _4, 1.0 CaCl _2, 20 ו HEPES 5 גלוקוז, pH 7.4) עם חומצה אסקורבית (100 מיקרומטר) בשעה 37 ° C באמצעות מלקחיים ובזהירות להעביר את מגזר כלי הליכי מצלחת פטרי החדרה בטמפרטורת החדר ולהעביר את מגזר כלי נכרת הפרוקסימלי לחדר myograph ומשוך סוף לאורך הקו כדי להאכיל אותו לתוך הכלי. הימנע מתיחת כלי.
Secure סוף ליד חוט נגד כיוון השעון תחת בורג קיבוע ליד בלסת הימנית מחוברת מיקרומטר. תפוס את הקצה החופשי של החוט עם מלקחיים לאבטח אותו עם כיוון השעון תחת הבורג לתקן הרבה על הלסת הימני. ודא כי מגזר כלי לאורך הקו ממוקם הפער בין הלסתות בלי כל קשר עם הלסת עצמו.
בורג את הלסתות זו מזו, וליישר את ההקבלה חוט השני עם כלי והכנס אותו בקצה המרוחק של לומן. בעדינות להאכיל את החוט דרך לומן של המגזר כלי בתנועה אחת באמצעות חוט רכוב כבר כמדריך. החזיקו את החוט על 1 ס"מ מן הספינה, כדי למנוע מתיחות זה במהלך התמרון, ולהימנע מלגעת האנדותל.
בורג את הלסתות יחד ולהבטיח את המהלכים second תיל הרכבה מתחת לראשון מאובטח על הלסת הימני.
Secure סוף ליד חוט השני בכיוון השעון תחת בורג קיבוע ליד הלסת השמאלי מחובר מתמר.
Secure לקצה חוט תחת בורג קיבוע בלסת שמאל ולהדק למתוח את החוט.
לאחר השלמת הרכבה, לאפס את המנוע "תפריט הרכבה" ולהתחיל נורמליזציה של כלי השיט.

3. נורמליזציה

חוט כפול אוטומטי Myograph System-510A יש תפקיד נורמליזציה אוטומטיות, אשר העריכו מתפריט "נורמליזציה" ומאפשר את כלי השיט כדי להיות מתוח היקף פנימי מתוקנן לפי נוהל אחיד על פי פרוטוקול של היצרן לאחר איזון למשך 30 דקות ב 37 ° C. עקומה מעריכית מצויד אז הנתונים לחץ פנימי היקף. הנוהל מגדיר את קוטר לומן (ד 100) כי העורק היה לי in vivo כאשר רגוע בלחץ transmural של 100 מ"מ כספית ¹ הפרמטרים נורמליזציה של העורק mesenteric עכברוש הן כדלקמן.:

לחץ יעד transmural = 13.3 kPa (100 מ"מ כספית).
זמן = 60 שניות; משך כל הצעדים נורמליזציה.
IC ₁ / ₁₀₀ = 0.9 IC (IC ₁ = היקף פנימי מנורמל, IC ₁₀₀ = היקף פנימי המקביל ללחץ היעד.
כיול מגדילה 2 * Δ (מ"מ / עינית חלוקה); 2 דלתא היא מסיבות תכנות.

מדוד את אורך של העורק mesenteric רכוב באמצעות העין פיסת קריאות מיקרוסקופ hairlines כאשר הם מעל מסתיים רחוק וקרוב של segm כלי רכובאף אוזן גרון. בקצרה, באורך של המגזר כלי רכוב נמדדת בהגדלה מקסימלית עם עינית מכויל העין היצירה המיקרוסקופ לנתיחה. קריאה העין חלקים עם קו השיער מעל הקצה המרוחק של המגזר (א ₁₎ ואת הקצה הקרוב של המגזר (א ₂₎ בענפי עינית נמדדים והקליט. ערכים אלה, עם קריאות מיקרומטר, לפני ואחרי מתיחת כלי נרשמות ונכנס לתוך התפריטים של התוכנית כדי לחשב את עקומת מצויד ואת קוטר פנימי המתאים בלחץ היעד transmural של 100 מ"מ כספית

במחקרים שלנו, העורקים נקבעו לקוטר לומן של ד ₁ = 0.9 XD _100, שם הוא פעיל לפיתוח כוח מרבי. פיתוח כוח פעילים של ≥ 10 mn בעורקים mesenteric חולדה נחשבת אופטימלית עבור ניסויים כדי להמשיך. רקמות בעוצמה נמוכה יותר פעיל שהושלכו.

4. מדידה של תגובות

לאחר נורמליזציה, המאפיינים מכני תפקודית של כלי הם יופעל מחדש על ידי ביצוע "מתחיל רגיל", הכוללת כלי מאתגר עם בקשות חוזרות ונשנות (בדרך כלל 2 או 3) של phenylephrine 5 מיקרומטר (PE) לקבל התכווצויות לשחזור. "להתחיל תקן" טיפוסית במעבדה שלנו מורכב מסדרה של גירויים ותקופות כשלון כדלקמן:

החלף קאמרית myograph לכסות ולהתחיל אוורור עם אוויר 95% ו 5% CO _2.
מלאו קאמרית עם PSS טרי (המכיל חומצה אסקורבית 100 מיקרומטר)
חוזה כלי עם 5 מיקרומטר PE 5 דקות ולשטוף 4 פעמים עם חיץ PSS.
אחרי ההדחה האחרונה, תא מילוי עם PSS ולחכות 3 דקות לפני חזרה על כל השלבים (ii) ו - (iii).

לאחר תחילת תקן, העורק מוכן הניסוי. הקלות של כלי התכווץ מוערכים על ידי תוספת מצטברת של ריכוזי הגוברת של CaCl ₂ (0.5-4 mM). כאשר כלי מעכבי משמשים הם מראש מודגרות עם תרכובות בתא myograph עבור 20 דקות ולהציג במהלך מבחני.

5. ניתוח נתונים

"נורמליזציה" הנתונים עבור כלי כוח, השרטוטים, המרה ישירות נתוני טקסט, נותחו עם 11.0 SigmaPlot גרפים התוכנית (Systat תוכנה, ריצ'מונד פוינט, CA) ואת זממו כפי שמוצג באיור 1. ריכוז בתגובה לנתונים, מחושב מתוך העתקים, נותחו על ידי קביעת EC ₅₀ ערכים מתוך נתוני הניסוי מצויד לתפקד ארבע פרמטר לוגיסטי בתפריט לפרמקולוגיה של התוכנית. השוואות בין קבוצות בתוך קבוצות בוצעו על ידי ניתוח דרך אחת שונות (ANOVA) והבדלים עם 0.05 p <נחשבים משמעותיים.

6. נציג תוצאות:

פרמטרים	Wistar	דאל מלח רגיש	דאל מלח עמידים
L ₁₀₀ (מיקרומטר)	83.26 ± 2.33	91.52 ± 4.67	117.45 ± 8.43 *
₁ X	604.21 ± 41.97	752.24 ± 85.25	745.84 ± 110.09
r ²	0.99 ± 0.003	0.97 ± 0.008	0.97 ± 0.007

* ההבדל בין L ₁₀₀ ערכים Wistar ו - DR הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית. שפירא, וילק מבחן הנורמליות עבר (p = 0.588); מבחן שונות שוויון עבר (p = 0.237).

L = ₁₀₀ בקוטר פנימי של המגזר רכוב המקביל ללחץ היעד transmural.

X ₁ = הגדרת positioner מיקרו נדרש למתוח את כלי רכוב על היקף פנימי מנורמל שלה (כלומר את הערך של קריאת מיקרומטר בו ניסויים בוצעו).

r ² = מקדם רגרסיה להתאמה של (X _i, Y _i) עקומה מעריכית.

הערה: הליך מפורט מתואר במדריך עבור מערכת Myograph 510A ^6.

טבלה 1. דוגמה לקריאה מתוך הפרמטרים נורמליזציה עבור מגזרים העורק mesenteric מ Wistar, DS ו DR מתוכנית בסיסי שמוצג "תפריט נורמליזציה". ערכים הם אמצעי (± SEM) של 5 החיות. * הבדלים בין L ₁₀₀ ערכים Wistar ו DS הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית (p <0.05).

Wistar	DS	DR
14.2 ± 0.6		20.9 ± 1.3 *

2. טבלת מתחים פותח (MN) בעורקים mesenteric מבודד Wistar, DS וחולדות DR, בעקבות בקשות של 5 מיקרומטר PE לכלי אחד. ערכים הם דיווחו אמצעי (± SEM) של 6-8 חיות. * שונה באופן משמעותי Wistar שולטת (p <0.05).

באיור 1. Ca ^{2 +} _e-Induced הרפיה של העורק PE-חלתה mesenteric מן חולדה Wistar רכוב myograph חוט תמיסת מלח פיזיולוגית המכילה 1 mM Ca ^{2 +.} העורק היה equilibrated למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם אוורור קבוע ותגובות Ca ^{2 +} _e נקבע. כוח נציג התחקות על תוספת של 5 מיקרומטר PE ואחריו שנוספו מצטברת של Ca ^{2 +} מוצג.

איור 2. Ca ^{2 +} _e-Induced הרפיה של העורק PE-חלתה mesenteric מן חולדה DS רכוב myograph חוט תמיסת מלח פיזיולוגית המכילה 1 mM Ca ^{2 +.} העורק היה equilibrated למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם אוורור קבוע ותגובות Ca ^{2 +} _e נקבע. כוח נציג התחקות על תוספת של 5 מיקרומטר PE ואחריו שנוספו מצטברת של Ca ^{2 +} מוצג. Ca ^{2 +} הרפיה נפגע קשות ברקמה זו בהשוואה לאלו של חולדות Wistar ו DR.

איור 3. Ca ^{2 +} _e-Induced הרפיה של העורק PE-חלתה mesenteric מן חולדה DR רכוב myograph חוט תמיסת מלח פיזיולוגית המכילה 1 mM Ca ^{2 +.} העורק היה equilibrated למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם אוורור קבוע ותגובות Ca ^{2 +} _e determined.A כוח נציג התחקות על תוספת של 5 מיקרומטר PE ואחריו שנוספו מצטברת של Ca ^{2 +} מוצג.

איור 4. א [Ca ^{2 +]} _דואר התגובה עקומות. בתרשים ב 'בר מראה EC ₅₀ ערכים לרגיעה נקבע על ידי התאמת הנתונים ביטוי four פרמטר לוגיסטי curve.C.CaR בתוך אולמות mesenteric מבודד חולדות DR ו DS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יתר לחץ דם הוא הגורם העיקרי לתחלואה קרדיווסקולרית, מוחין כליות / תמותה. המופע של יתר לחץ דם גבוה באוכלוסייה ומלח רגיש יתר לחץ דם גבוה במיוחד בקרב האוכלוסייה ההזדקנות, שכיחה יותר שחורים מאשר לבנים. זהו ככל הנראה בשל הנטייה של שחורים לשמור נתרן הכליות שלהם ^9. מלח רגישות היא גורם מרכזי התורם למחלות כליה קשורה בתפקוד האנדותל, אך המנגנון לא מובנת לחלוטין. מחקרים שנערכו לאחרונה במעבדה שלנו חשפו כי דיאטות מלח גבוהה להפחית נוזל interstitial Ca ^{2 +} ריכוז ([Ca ^{2 +]} _IF), ולהגדיל את הלחץ הסיסטולי מלח רגיש חולדות ^10,11. תופעות אלה ניתן לייחס ביטוי מופחת של מכוניות בעורקים mesenteric ו kidneys.Finding הפחתות דומות ברמות המכונית מלח רגישים חולי יתר לחץ דם יכול לספק מטרה לפיתוח טיפולים חדשים. We have been באמצעות myography חוט אוטומטית עם העורקים mesenteric מבודד מספר מודלים של בעלי חיים של יתר לחץ דם ללמוד תגובתיות כלי הדם כדי Ca ^{2 +} _e להבין את המנגנון של המכונית איתות vasculature.

[Ca ^{2 +]} _e נשמר בטווח צר (1.1-1.4 מ"מ) ¹² בני אדם, ולכן רכב חייב להיות מסוגל לזהות שינויים קטנים [Ca ^{2 +]} _e עבור הפעלת קולטן להיות אפשרי. למעשה, המכונית הוכח לזהות שינויים קטנים Ca ^{2 +} _e ^13, ומגבירה קטן [Ca ^{2 +]} _אם כי הם בטווח הפיזיולוגי ^14. במחקרים microdialysis באתרו מדידה [Ca ^{2 +]} _אם ב submucosa התריסריון ואת קליפת הכליה, שתי רקמות כי הם חיוניים להסדרת ההתנגדות ההיקפית, לחץ דם (BP), הראו שינויים דינמיים כפונקציה של המעי לומן [Ca ^{2 +].} הגדלת הבטן [Ca ^{2 +]} מ -0 עד 6 מ"מ, הגדיל את [Ca ^{2 +]} _אם 1.1-1.9 mM ^4,5,15, אשר בטווח שנצפה להפעלת רכב עצב perivascular ^16, ולהירגע mesenteric מבודד העורקים ^17. הראינו גם כי המכונית מזהה ירידה [Ca ^{2 +]} _e ולהגדיל את משך פעולה פוטנציאליים באמצעות הפעלת הערוץ הלא סלקטיבי קטיון, אשר בתורו פוחתת ההשפעה על הסיכוי לשחרר במסופים neocortical ^18. הדבר מרמז כי המכונית מספקת מראש הסינפטי משוב לשנות את רגישות המוח בתגובה Ca ^{2 +} _דואר. יתר על כן, הפחתת רגישות של המכונית PvN מתרחשת עם גירוי, חזר ממושכת ^16, טוען כי הבנה של רגולציה של קולטן זה יהיה להבהיר את תפקידה תחת שני תנאים נורמליים יתר לחץ דם. Bukoski ועמיתיו הראו כי שינויים קטנים [Ca ^{2 +]} _אם הם מספיק כדי להפעיל את המכונית לתרום סינתזה vasodilator בתנאים נורמליים ^3,4.19,. בהתבסס על תצפיות אלה, אנו מניחים כי תשובה זו יתרחש גם בתנאים של צליל של כלי הדם גדל כמו לראות יתר לחץ דם ולכן יכול להיות מנוצלת כדי לשלוט בלחץ הדם. המחקר של הפעלת המכונית איך זה מוביל זירחון של איתות ביניים היא, אפוא, חובה לחקור את תפקידה הפיזיולוגיה נורמלי יתר לחץ דם. המכונית G-חלבון קולטן מצמידים (GPCR), והוא מוסדר באמצעות מנגנונים דומים כמו GPCRs אחרות, שהן מטרות טיפוליות משותפות. לכן, הבנת מנגנוני ויסות שלה בכלי הדם תספק מידע שימושי כדי לקבוע את הפוטנציאל שלה כיעד לטיפול נגד יתר לחץ דם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

הפרויקט מתואר נתמכה על ידי מספרים פרס HL064761 R01, R25 HL059868, 1SC1 HL099139 ו P20 MD000175 טופס המכונים הלאומיים לבריאות. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של מכוני הבריאות הלאומיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Auto Dual Wire Myograph System-510ADMT-USA, Inc.	Atlanta, GA.	100151
PowerLab/4SP Data Acquisition System	ADInstruments	ML750	New models with 4-16 input channels are available.
Dell Dimension XPS Gen 4 Computer	Dell
Stemi SV II (Apo) Dissection Microscope with Ocular	Carl Zeiss, Inc.
Wistar, Dahl salt-sensitive, Dahl salt-resistant rats	Harlan Laboratories
Rodent chow	Harlan Laboratories
Phenylephrine	Sigma-Aldrich
Other chemicals			All chemicals used were of the purest grades available commercially.