Summary
Profitant des avancées dans le développement de fluorophore et la technologie d'imagerie, une méthode simple de Alexa Fluor étiquetage des virus de la dengue a été conçu pour visualiser les interactions précoces entre le virus et la cellule.
Abstract
Les événements au début de l'interaction entre le virus et la cellule peut avoir une influence profonde sur l'issue de l'infection. Déterminer les facteurs qui influencent cette interaction pourrait conduire à une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie et ainsi influencer la conception de vaccin ou thérapeutiques. Ainsi, le développement de méthodes pour sonder cette interaction pourrait être utile. Les récents progrès dans le développement des fluorophores 1-3 et la technologie d'imagerie 4 peut être exploitée pour améliorer nos connaissances actuelles sur la pathogénie de la dengue et d'ouvrir ainsi la voie pour réduire les millions de cas de dengue survenant chaque année.
Le virus de la dengue a enveloppé une externes échafaudage constitué de 90 glycoprotéine de l'enveloppe (E) dimères protégeant le réservoir nucléocapside, qui contient un seul brin ARN positif du génome 5. Les sous-unités protéiques identiques sur la surface du virus peuvent donc être étiquetés avec un colorant amine réactive et visualisées par microscopie d'immunofluorescence. Ici, nous présentons une méthode simple de l'étiquetage des virus de la dengue avec Alexa Fluor succinimidyl ester colorant dissous directement dans un tampon bicarbonate de sodium qui a produit virus hautement viable après l'étiquetage. Il n'ya pas de procédure standardisée pour l'étiquetage des virus vivants et le protocole du fabricant existants pour l'étiquetage des protéines nécessite généralement la reconstitution de la teinture dans le diméthylsulfoxyde. La présence de diméthylsulfoxyde, même en quantités infimes, peut bloquer l'infection productive des virus et aussi induire 6 cytotoxicité cellulaire. L'exclusion de l'utilisation de diméthylsulfoxyde dans ce protocole ainsi réduit cette possibilité. Alexa Fluor colorants ont photostabilité supérieure et sont moins sensibles au pH que les colorants communs, tels que la fluorescéine et la rhodamine 2, ce qui les rend idéales pour des études sur l'absorption cellulaire et le transport endosomal du virus. La conjugaison de Alexa Fluor colorant n'a pas d'incidence sur la reconnaissance du virus de la dengue labellisé par le virus de l'anticorps spécifique et de ses récepteurs putatifs en 7 cellules de l'hôte. Cette méthode pourrait avoir des applications utiles dans les études virologiques.
Protocol
1. Alexa Fluor étiquetage des virus de la dengue
- Avant la réaction de marquage, de purifier virus de la dengue avec coussin de saccharose et de préparer les réactifs et les équipements nécessaires, comme indiqué dans le protocole.
- Préparer une solution fraîche de tampon 0,2 M de bicarbonate de sodium, pH 8,5 (tampon de marquage), et 1,5 M de tampon d'hydroxylamine, pH 8,3 (arrêt réactif), juste avant l'étiquetage et stériliser par filtration avec des filtres seringue 0,2 um.
- Diluez environ 3x10 8 unités formant plaque (UFP) de virus purifié de dengue dans 1ml de tampon d'étiquetage dans un tube de 2 ml. Cela peut être étendue proportionnellement pour l'étiquetage lot de virus.
- Reconstituer le lyophilisé Alexa Fluor 594 (AF594), les esters succinimidyle à 1mm dans l'étiquetage de tampon juste avant la réaction de marquage. Fluorochromes autres de la série Alexa Fluor colorant peut être utilisé en fonction de ses besoins. Minimiser l'exposition à la lumière à partir de cette étape.
- Ajouter 100 pi de l'AF594 1mM de colorant pour le virus dilué en remuant délicatement avec la pointe de la pipette.
- Incuber le mélange réactionnel étiquetage à température ambiante pendant 1 heure dans l'obscurité. Mélanger par inversion douce toutes les 15 minutes.
- Spin brièvement le tube dans une centrifugeuse de table et ajouter 100 ul de réactif d'arrêt au mélange réactionnel tout en remuant délicatement avec la pointe de la pipette.
- Incuber à température ambiante pendant une heure supplémentaire dans l'obscurité. Mélanger par inversion douce toutes les 15 minutes.
2. Purifiant Alexa Fluor étiquetés virus de la dengue
- En attendant, équilibrer la colonne de purification avec le tampon de votre choix. Dans cette expérience, une colonne PD-10 est équilibrée avec 25ml de tampon HNE (Hepes 5 mM, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA), pH 7,4, avant de l'utiliser.
- Appliquer le virus marqués au sommet de la colonne et commencer à recueillir l'écoulement continu une fois le virus pénètre dans la matrice étiquetés. Remplir la colonne avec le tampon HNE fois que tous les virus marqués est entré dans la matrice. Jeter la première 2.5ml accréditives et de recueillir les 2ml prochaine fraction de virus étiquetés.
- Aliquoter et stocker purifiée AF594 virus de la dengue étiqueté -80 ° C, loin de la source lumineuse.
- Dégeler une aliquote et déterminer le titre du virus étiquetés par dosage de plaque avant d'utiliser le lot de virus étiquetés.
- Graine 5x10 4 par puits de cellules Vero, cultivés dans M-199 un milieu de croissance, dans une plaque 4-même avec une lamelle sur le fond du puits un jour avant l'infection.
- Retirer le surnageant de culture dans le bien et d'infecter les cellules avec une multiplicité d'infection de 1 du virus étiquetés en volume 100 ul (dilué dans M-199 milieu d'entretien, au besoin) pour 10min à 37 ° C.
- Retirez les inoculums et laver les lamelles à deux reprises en 1xPBS.
- Fixer les cellules en paraformalydehyde 3% pour 30 minutes.
- Lavez les lamelles de 3 fois dans 1xPBS.
- Perméabiliser les cellules avec une solution contenant perméabilisation saponine à 0,1% et 5% de SAB dans 1xPBS pour les 30mins.
- Incuber les cellules avec des pur-centrifugation clarifié surnageant de culture de 3H5 anticorps d'hybridome monoclonaux pour 1h dans une chambre humide, protégé de la lumière.
- Lavez les lamelles de 3 fois dans du tampon de lavage (1xPBS contenant du chlorure de calcium 1 mM, 1 mM de chlorure de magnésium et de 0,1% de saponine).
- Incuber les cellules avec AF488 anticorps anti-souris IgG, 1:100 dilué dans une solution de perméabilisation, pour 45 minutes dans la chambre humide, protégé de la lumière.
- Lavez les lamelles de 3 fois dans du tampon de lavage et rinçage une fois dans l'eau déminéralisée.
- Tamponnez le bord de la lamelle sur une serviette en papier pour drainer l'excès d'eau et monter sur lame de verre avec 8μl Mowiol 4-88 Dabco 2,5% contenant.
- Laisser la solution de montage pour régler une nuit à 4 ° C avant d'afficher à l'aide d'un microscope confocal Zeiss. Acquisitions séquentielles doivent être effectués excitation d'un fluorophore à une époque et de la commutation entre les détecteurs de façon concomitante.
- Les images sont ensuite analysées pour la co-localisation de la coloration des anticorps protéine E du virus étiquetés en utilisant le logiciel Zeiss LSM zen pour estimer le degré d'étiquetage.
3. Les résultats représentatifs
Un exemple du rendement du virus de la dengue étiquetés avec AF594 colorant est montré dans la figure 2. Normalement, moins de 10 fois tomber du titre initial devrait être observé à la suite d'étiquetage réussi. Cependant, il convient de noter que tous les tampons doivent être préparés frais pour l'étiquetage de réussir et l'Alexa Fluor esters succinimidyle doit être utilisé immédiatement après reconstitution comme ils s'hydrolyser en acides libres non réactifs dans les solutions aqueuses 8.
Ensuite, le virus étiqueté doit être vérifié pour la fluorescence suffisante avant de l'utiliser dans les expériences. Un test d'immunofluorescence simples a été faite sur des cellules Vero et le degré d'étiquetage peut être estimée à partir de la co-localisation du virus étiquetés avec des anti-E coloration des anticorps de protéines. Romprecellules ont été examinés et al une image typique confocal est montré dans la figure 3. Co-localisation d'analyse des images en utilisant le logiciel LSM zen démontré chevauchent coefficients allant de 0,65 à 0,8, ce qui suggère que quelque 65 à 80% des virions ont été marquées avec le colorant.
Figure 1.Overall schéma illustrant l'Alexa Fluor colorant étiquetage de procédure virus de la dengue. D'abord, les tampons pertinentes et virus de la dengue purifiés sont préparés. L'Alexa Fluor colorant est reconstitué et ajouté au virus de la dengue dilué dans l'étiquetage de mémoire tampon. La réaction est alors arrêtée 1 heure plus tard avec l'ajout de réactif d'arrêt. Par la suite, le virus marqué est purifié par une colonne d'exclusion de taille pour enlever sans colorant. Enfin, le virus est ré-étiquetés titré par dosage de plaque et testé pour la fluorescence.
Figure 2. Le nombre moyen de virions viables (UFP / ml) telle que déterminée sur un essai de plaque avant et après AF594 étiquetage. Une aliquote de l'AF594 virus de la dengue étiqueté est décongelé et re-titré par dosage de plaque et il montre généralement moins de 10 fois à partir de chute de le titre de départ. Les barres d'erreur indiquent l'écart-type des doublons.
Figure 3. Co-localisation des étiquettes avec des protéines AF594 dengue E du virus dans des cellules Vero. Cellules cultivées sur des lamelles de la veille ont été infectés par la dengue AF594 étiquetés à MOI de 1 pour 10 minutes à 37 ° C. Les cellules ont ensuite été fixés et marqués avec des anticorps anti-E, et examinés pour colocalisation de la protéine E (vert) et AF594 étiquetage (rouge). Signaux fluorescents ont été visualisés sous grossissement 63X en utilisant Zeiss LSM 710 microscope confocal. La barre d'échelle est 10 microns. Jaunes indiquent les zones de colocalisation, comme indiqué dans l'encart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bien AF594 colorant a été utilisé dans ce rapport, une large gamme de fluorophores dans la série Alexa Fluor esters succinimidyle est disponible avec la chimie étiquetage similaire. Cela pourrait étendre l'application de l'étiquetage au-delà de l'imagerie. La cytométrie en flux peut être utilisé comme une alternative à la microscopie confocale pour estimer le degré d'étiquetage pour les fluorophores qui peuvent être excités et détectés par la machine FACS.
Alexa Fluor colorants sont de petites molécules qui réagissent avec des groupes amino libres, principalement l'arginine et la lysine 9, normalement vers l'extérieur face à des résidus de protéines. Dans notre laboratoire, la conjugaison du virus de la dengue avec 100 microns d'Alexa Fluor 594 colorant fourni une luminosité suffisante pour l'imagerie avec une perte minimale du titre viral. Luminosité différente peut être atteint en faisant varier la concentration du colorant utilisé. Cependant, l'augmentation de la concentration de colorant peut réduire la viabilité du virus 7,10. Une limitation possible est l'ingérence dans la liaison du récepteur à cause du blocus de l'accès par les fluorophores. Par conséquent, selon l'application, un niveau optimal de l'étiquetage devrait être déterminé à assurer un équilibre entre le degré d'étiquetage et abrogation10 fonctionnelle. Notez que la concentration peut aussi être affectée par la réactivité de post-conditionnement des esters Alexa Fluor succinimidyle 8.
L'étiquetage direct des virus de la dengue avec Alexa Fluor colorants présentés ici ne nécessite aucune mesure d'étiquetage supplémentaires pour visualiser le virus, éliminant ainsi la possibilité de non-spécifique de coloration indirecte des anticorps antiviraux. Elle permet également de suivre en temps réel de la post-internalisation des événements dans l'imagerie de cellules vivantes. Cette méthode est relativement simple, et parce que la conjugaison est stable, il peut être utilisé pour produire et stocker de lot marqué de virus pour des expériences multiples, par opposition aux colorants fluorescents lipophile, comme à longue chaîne carbocyanine1 ,1-dioctadécyl-3, 3, colorants 3,3-tetramethylindodicarbocyanine (DID) ou styryle, qui ne peuvent pas être stockées dans le froid pendant plus de 3 jours.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le Conseil national de la recherche médicale, à Singapour.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
| To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
References
- Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &, Davidson, M. W.
- Panchuk-Voloshina, N. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Kuhn, R. J. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108, 717-725 (2002).
- Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis. BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).
- Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus. J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).
- Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , Invitrogen. (2009).
- Huang, S. Analysis of proteins stained by Alexa dyes. Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).
- Freistadt, M. S., Eberle, K. E. Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies. J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).
