Summary
蛍光体の開発とイメージング技術、ウイルスはウイルスと細胞の間で早期に相互作用を視覚化するために考案されたデング熱ののAlexa Fluor ®標識の簡単な方法の進歩を活用して。
Abstract
ウイルスと細胞の間の相互作用の初期段階でのイベントは、感染の結果に大きな影響を持つことができます。この相互作用に影響を与える要因を決定することは疾患の病因の理解の向上につながるため、ワクチンや治療薬の設計に影響を与える可能性がある。したがって、この相互作用を調べるための方法の開発は有用であろう。蛍光体の開発1-3とイメージング技術4の最近の進歩は、デング熱発症機序に関する現在の知識を向上させるため、毎年発生するデング熱感染数百万人を削減する道を開くために悪用される可能性があります。
包まれたデング熱ウイルスは、単一のプラス鎖RNAゲノム5を含むヌクレオカプシドシェルを、保護する90エンベロープ糖タンパク質（E）二量体で構成される外部足場を持っています。ウイルスの表面上に同一のタンパク質サブユニットは、このようにアミン反応性色素で標識し、免疫蛍光顕微鏡法によって可視化することができます。ここで、我々はAlexa Fluorスクシンイミジルエステル色素がラベルの後に非常に実行可能なウイルスをもたらした重炭酸ナトリウム緩衝液中で直接溶解でデング熱ウイルスの標識の簡単な方法を提示する。生きているウイルスやタンパク質標識は、通常、ジメチルスルホキシド中の染料の再構成を必要とするために、既存の製造業者のプロトコルのラベリングのための標準化された手順はありません。ジメチルスルホキシドの存在は、さらに微量で、ウイルスの増殖感染を遮断し、また細胞毒性6を誘発することができます。このプロトコルのジメチルスルホキシドの使用の排除は、このように、この可能性を減少させた。のAlexa Fluor ®色素は、優れた光安定性を持ち、細胞の取り込みとウイルスのエンドソーム輸送の研究に最適です、あまりpH感受性などフルオレセインやローダミン2のような一般的な染料、よりです。のAlexa Fluor ®色素のコンジュゲーションは、ウイルス特異的抗体と7宿主細胞内でのその推定受容体による標識デング熱ウイルスの認識に影響を与えなかった。このメソッドは、ウイルス学的研究に有用なアプリケーションを持つことができます。
Protocol
1。デング熱ウイルスののAlexa Fluor ®標識
- ラベリング反応の前に、ショ糖クッションでデング熱ウイルスを精製し、プロトコルに示されるように必要な試薬や機器を準備する。
- ラベルとフィルタは0.2μmのシリンジフィルターで殺菌する直前に、新鮮な0.2M炭酸水素ナトリウム緩衝液、pH 8.5（標識バッファー）、および1.5Mヒドロキシルアミン緩衝液、pH 8.3（試薬を停止する）準備。
- 2ミリリットルチューブ内のバッファを標識する1mlのデング熱ウイルスを精製したのは約3 × 10 8プラーク形成単位（pfu）を希釈する。これは、ウイルスのバッチの標識のために比例してスケールアップすることができます。
- 再構成する凍結乾燥のAlexa Fluor ® 594（AF594）標識反応直前にバッファのラベル付けさ1mmのスクシンイミジルエステル。のAlexa Fluor ®色素シリーズからの他の蛍光色素は、自分のニーズに応じて使用することができます。このステップ以降から光への曝露を最小限に抑えることができます。
- ピペットの先端で軽く攪拌しながら希釈したウイルスに1mMのAF594染料液100μlを追加。
- 暗所で1時間、室温で標識反応ミックスをインキュベートする。穏やかな逆転であらゆる15分を混ぜる。
- 卓上遠心機でチューブを軽くスピンし、ピペットの先端で軽く攪拌しながら反応混合物に停止試薬100μLを加える。
- 暗闇の中でさらに1時間室温でインキュベートする。穏やかな逆転であらゆる15分を混ぜる。
2。浄化のAlexa Fluor ®は、デング熱ウイルスを標識し
- その間に、選択肢のバッファーで精製カラムを平衡化します。この実験では、PD - 10カラムは、使用前に、pH7.4のHNEのバッファの25ミリリットル（5mMのヘペス、150mmのNaClを、0.1mmのEDTA）で平衡化する。
- 列の先頭にラベルの付いたウイルスを適用し、ラベルの付いたウイルスが行列に入ると、フロースルーを収集を開始。すべてのラベルの付いたウイルスが行列を入力した後、HNEのバッファーでカラムを埋める。フロースルーの最初の2.5ミリリットルを破棄し、標識ウイルスの割合の次の2ミリリットルを収集する。
- -80でAF594というラベルのデング熱ウイルスを精製分注し、店舗° C、離れて光源から。
- oneアリコートを解凍し、標識ウイルスのバッチを使用する前に、プラークアッセイで標識されたウイルスの力価を決定する。
- シード5 × 10 4ウェルあたりの感染の前によく日の底面上にカバースリップの4ウェルプレートでM - 199の増殖培地で増殖させたVero細胞、、。
- で37ウェル中に培養上清を除去し、10分間100μlのボリューム（必要に応じてM - 199維持培地で希釈）で標識したウイルスの1の感染多重度で細胞に感染℃に
- inoculumsを削除し、1xPBSで二度カバーグラスを洗う。
- 30分3％paraformalydehydeで細胞を固定する。
- 1xPBSでカバーグラス3回洗浄する。
- 30分のための1xPBSで0.1％サポニンと5％のBSAを含む透過液と細胞を透過処理。
- 原液光から保護するために、湿度の高い部屋で1時間のために3H5モノクローナル抗体のハイブリドーマの培養上清を遠心分離、清澄化した細胞をインキュベートする。
- （1xPBSは、1mMの塩化カルシウム、1mMの塩化マグネシウムと0.1％のサポニンを含む）洗浄バッファーでカバースリップ3回洗浄する。
- 遮光して湿気の多い部屋で45分、のためのAF488抗マウスIgG抗体、透過液中に希釈1:100、で細胞をインキュベートします。
- カバーガラスの洗浄バッファーで3回洗浄し、脱イオン水で一度すすいでください。
- DAB8μlMowiol 4〜88を含む2.5％DABCOで余分な水分を排出し、スライドガラスにマウントするためにペーパータオルに対するカバースリップの端。
- ツァイス共焦点顕微鏡を使用して表示する前に一晩4に設定してマウントソリューション° Cを許可する。シーケンシャルの買収は、付随して検出器の間の時間とスイッチングでエキサイティングな蛍光団を実行する必要があります。
- 画像は、ラベリングの度合いを推定するためにツァイスLSM禅ソフトウェアを用いて標識ウイルスのE蛋白質の抗体染色の共局在のために分析されます。
3。代表的な結果
AF594色素で標識されたデング熱ウイルスの収量の例を図2に示されています。通常は、初期の力価からわずか10倍ドロップが成功したラベリング後に観察されるべきである。しかし、それはすべてのバッファがラベル成功させるために、それらが水溶液8の非反応性の遊離アミノ酸に加水分解としてのAlexa Fluorスクシンイミジルエステルが再構成後すぐに使用する必要があるために新鮮に準備する必要があることに留意すべきである。
次に、標識されたウイルスは、実験で使用する前に、十分な蛍光をチェックする必要があります。シンプルな免疫蛍光アッセイは、Vero細胞で行われ、ラベリングの度合いは、抗E蛋白質の抗体染色で標識したウイルスの共局在から推定することができる。断ち切るらの細胞を調べたところ、典型的な共焦点画像を図3に示されています。 LSM禅ソフトウェアを使用して画像の共局在の解析は、ビリオンの約65〜80％が色素で標識されたことを示唆し、0.65から0.8までの係数を重ねる示した。
図1.Overallスキームは、デング熱ウイルスの手続きののAlexa Fluor ®色素のラベルを描いた。まず、関連するバッファーと精製されたデング熱ウイルスが用意されている。のAlexa Fluor ®色素は、再構成し、バッファをラベルに希釈したデングウイルスに追加されます。反応は、その後、停止試薬を加えると1時間後に停止されます。その後、標識されたウイルスは、無料の色素を除去するためにサイズ排除カラムを通して精製される。最後に、標識されたウイルスは、プラークアッセイにより再滴定し、蛍光のためにテストされています。
図2。 AF594ラベリングの前と後のプラークアッセイで決定される実行可能なビリオン（PFU / ml）の数を意味する。AF594というラベルのデング熱ウイルスのアリコートを解凍し、プラークアッセイにより再滴定し、それが通常はより小さいよりも10倍ドロップを示しています開始タイター。エラーバーは、重複の標準偏差を示している。
図3。前日カバーグラス上で成長させたVero細胞におけるデングウイルスEタンパク質とAF594ラベルの共局在。細胞を37℃で10分間1のMOIでのAF594というラベルのデング熱に感染していた℃、細胞は、その後修正及び抗E抗体で標識し、Eのタンパク質の共局在（緑）とAF594ラベル（赤）を調べた。蛍光シグナルはツァイスLSM 710共焦点顕微鏡を用いて63X倍率で可視化した。スケールバーは、10μmである。挿入図に示すように、黄色、共局在の領域を示します。
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Discussion
AF594染料がこのレポートで使用されていますが、のAlexa Fluorスクシンイミジルエステルシリーズの蛍光体の広い範囲で同様のラベリングの化学で使用可能です。これは、イメージングを超えてラベリングアプリケーションを拡張することができます。フローサイトメトリーは、FACSの機械によって励起して検出できる蛍光物質のラベリングの度合いを推定するための共焦点顕微鏡の代替として使用することができます。
のAlexa Fluor ®色素は遊離アミノ基、主にアルギニンとリシン9、通常は外側にタンパク質の残基が直面していると反応する小さな分子である。 Alexa Fluor 594の色素の100μMとデング熱ウイルスの研究室、共役してウイルス力価の損失を最小限に抑えて撮影するのに十分な明るさを提供する。異なる明るさは、使用する色素の濃度を変化させることによって達成することができる。しかし、染料濃度を増加させることは、ウイルスの生存率7,10を減らすことができます。一つの可能な制限は、フルオロフォアからのアクセスの遮断による受容体の結合に干渉です。したがって、アプリケーションに応じて、ラベルの最適なレベルは、標識および機能abrogation10の度合いのバランスを確保するために決定する必要があります。濃度は、8のAlexa Fluorスクシンイミジルエステルの後の包装の反応性によって影響を受ける可能性があることに注意してください。
のAlexa Fluor ®色素は、ここで紹介するとデング熱ウイルスの直接標識は、このように間接的な抗ウイルス抗体の非特異的な染色の可能性を除去し、ウイルスを視覚化するために追加のラベル表示の手順を必要としません。また、生細胞イメージングの後の内部化のイベントをリアルタイムで追跡することができます。この方法は比較的簡単です、そして接合が安定しているので、それはのような長鎖carbocyanine1 -1,1 - ジオクタデシル- 3、3、のような親油性蛍光染料とは対照的に、複数の実験のためのバッチ標識ウイルスを生成して格納するために使用することができます以上の3日間寒さの中に格納できない3,3 - tetramethylindodicarbocyanine（DID）またはスチリル染料、。
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Disclosures
我々は、開示に何もない。
Acknowledgments
この作品は、国立医学研究評議会、シンガポールによって資金を供給されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Hydroxylamine | Sigma-Aldrich | 159417 | |
| Sodium hydroxide | Merck & Co., Inc. | 106498 | |
| AF594 succinimidyl esters | Molecular Probes, Life Technologies | A20004 | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H6147 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| M-199 | Invitrogen | 11150 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| 4-well plate | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Coverslips | Einst | 0111520 | |
| Microscope slide | Sail Brand | 7105 | |
| 3H5 hybridoma | ATCC | HB46 | |
| 10x PBS | BUF-2040-10X1L | 1st Base | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Paraformaldehye | Sigma-Aldrich | 15,812-7 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Sigma-Aldrich | D27802 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| To prepare M-199 growth medium, add 50ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
| To prepare M-199 maintenance medium, add 15ml of FBS, 5ml of sodium pyruvate and 5ml of non-essential amino acids to 500ml of M-199, sterile filter. | |||
References
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