のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

この実験の全体的な目的は、顕微鏡観察のためにデングウイルスの蛍光標識を行うことです。必要な緩衝液を調製し、ショ糖クッションを用いてデングウイルスを精製し、標識緩衝液中でAmy React Alexa flow染料とデングウイルスを再構成します。100 µMのAlexa flowを用いてデングウイルスを標識します。

1時間反応させた後、サブ試薬を用いて標識反応を停止させます。サイズ排除カラムを用いて標識デングウイルスを精製します。プラークアッセイにより標識ウイルスの力価を再測定し、免疫蛍光染色法により標識率を推定します。

こんにちは。私はDSO国立研究所のSam Jangです。NUS大学院医学部を卒業後、現在はWee博士の研究室にて新興感染症プログラムに従事しています。本日は、イメージング解析のために、アミン反応性Alexa Fluor染料を用いて dengue virus を蛍光標識する方法をご紹介します。Alexa Fluor染料は、フルオレセインやローダミンなどの一般的な染料よりも安定性に優れ、pHの影響を受けにくいため、ウイルスの細胞内取り込みやエンドソーム輸送に関する研究に最適です。

Alexa Fluorで標識したデングウイルスは、デング熱の病原性の理解を促進します。それでは、手順を開始しましょう。標識反応の前に、記載されたプロトコルに従って新鮮な標識バッファーと停止試薬を調製し、ショ糖クッション法でデングウイルスを精製します。精製したデングウイルスを適切な量だけマイクロ遠心チューブ内の標識バッファーに加え、濃度を300 million forming units/mLに調整します。

これは比例してスケールアップ可能です。ウイルスのバッチラベル化を行う場合は、ラベル化反応の直前に、凍結乾燥されたAlexaフロア色素をラベル化バッファーで1 mMに再構成してください。

このステップ以降は、光への曝露を最小限に抑えてください。デモンストレーションのため、Alexa flow dyeは遮光せずに使用します。マイクロピペットチップで穏やかに撹拌しながら、1 mM Alexa flow dye 800 µLを希釈したデングウイルスに加えます。

室温にて、遮光しながら1時間インキュベートし、15分ごとに緩やかに転倒混和させます。1時間後、チューブを短時間遠心分離します。マイクロピペットで緩やかに撹拌しながら、サブリージョンの800 µLを分取し、室温にてさらに1時間インキュベートします。この際、遮光し、15分ごとに緩やかに転倒混和させてください。

その間に、精製カラムを25 mLのHNEバッファーで平衡化させます。1時間のインキュベーション後、標識したウイルスをカラムにアプライし、フロースルーの回収を開始します。カラムをHNEバッファーで満たしてください。

ラベル化されたウイルスがすべてマトリックスに进入したら、流出液の最初の 2.5 milliliters を廃棄し、次に 2 milliliters のラベル化ウイルス分画を回収します。精製されたラベル化ウイルスを −80 °C で凍結保存します。プラークアッセイにより、ラベル化ウイルスのタイターを決定します。

典型的な実験では、ウイルス価の低下は10倍未満にとどまるはずです。標識後、標識度を評価するために免疫蛍光アッセイを実施します。そのために、ヘモサイトメーターを用いてウイルス細胞数を算出し、細胞密度が50,000 cells/mLになるよう、適切な量の細胞を培地に加えます。

滅菌済みのガラスカバーを装着した4ウェルプレートの各ウェルに、1 mLのウイルス細胞を分注します。細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。プレートをインキュベーターから取り出し、各ウェルから上清を吸引除去します。その後、100 µLの容量で約1 MOIの標識ウイルスを加え、37 °Cで10分間反応させます。

接種液を除去し、各ウェルの細胞を0.5 millilitersのPBSバッファーで洗浄します。この手順をさらに2回繰り返します。各ウェルに200 microlitersの3%per for multi heightを加え、室温で30 Minutes間細胞を固定します。

各ウェルを0.5 mLのPBSバッファーで3回洗浄します。室温で固定液を用いて細胞を30分間固定します。精密ピンセットを使用して、ウェルからカバーガラスを取り除きます。

カバーの端を吸い取り紙で吸い取り、余分な液体を除去します。ろ紙の上で滑らせるようにして、カバーの細胞側を配置します。

パラフィン片上の25 µLのデングウイルスeタンパク質抗体に浸します。遮光した室温の加湿チャンバー内で1時間インキュベートします。次に、カバーガラスを6ウェルプレートに移し、各ウェルに2 mLの洗浄バッファーを加えます。

上清を吸引します。最後の洗浄後、これらの洗浄手順をさらに2回繰り返します。微小ピンセットを用いて、ウェルからカバーガラスを取り除きます。

カバーの端を浸して余分な液体を取り除きます。ペーパーワイプで軽く吸い取ります。カバーのセル側を配置します。

パラフィルム上に、Alexa Fluor 488抗マウス二次抗体25 µLを分注します。遮光した状態で、室温の加湿チャンバー内で45分間インキュベートします。インキュベーション完了後、カバーガラスを6ウェルプレートに移し、各洗浄につき2 mLの洗浄バッファーを用いて細胞を3回洗浄します。最後の洗浄後、ウェルからカバーガラスを取り出し、イオン水で1回すすぎます。

ペーパーに吸い取らせて余分な液体を除去します。8 µLの緩やかな封入剤を用いて、カバーガラスを顕微鏡スライドに封入します。封入剤を4 °Cで一晩静置して固めます。

これでサンプルを蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で観察する準備が整いました。カバーガラスの表面に没入油を少量滴下し、顕微鏡に固定します。スライドを顕微鏡のステージにセットしてください。

顕微鏡対物レンズが浸油に接触するまでステージを調整します。鮮明な画像を得るために、Zes Zenソフトウェアを使用して周囲の照明を消してください。接眼レンズからサンプルを直接観察するには、「ocular」タブをクリックしてください。

細胞を含む視野を探し、フォーカスを調整します。次に、取得モードに切り替えます。蛍光チャンネル間のクロストークを最小限に抑えるため、Alexa Fluor 488とCy5にそれぞれ個別のトラックを選択してください。

色素および設定を、連続的な励起および検出に合わせます。画像が露出過多または不足にならないよう、レーザーパワーのゲインとオフセットを調整してください。画像をキャプチャし、コロカライゼーション機能を用いて関心領域を解析します。

オーバーラップ係数を用いて、Alexa Flo Dyeによるデングウイルスの標識度を推定することができます。ウイルス細胞を用いて簡易的な免疫蛍光アッセイを行い、標識されたウイルスと抗Eタンパク質抗体染色の共局在から標識度を推定しました。オーバーラップ係数は0.65から0.8の範囲であり、約65%から80%の粒子がAlexa Flo Dyeで標識されていることが示唆されました。標識手順を成功させるためには、標識バッファーを適切に調製し、標識前にAlexa Flo Dyeを新しく再構成することが重要です。

使用する染料の濃度は、必要に応じてさらに最適化することが可能です。このデングウイルスのホライゾン標識法は、他のウイルスの標識にも応用できる可能性があります。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。ラベル化実験の成功をお祈りしております。