初代ラット皮質ニューロンとグリアのBilaminarの共培養

Summary

ここでは、グリアフィーダー層の存在下で培養ラット大脳皮質ニューロンのためのプロトコルを提供しています。培養神経細胞は極性を確立し、シナプスを作成し、そのような電気生理学、カルシウムイメージング、細胞生存アッセイ、免疫細胞化学、およびRNA / DNA /タンパク質の分離など、さまざまな用途での使用のためのグリア細胞から分離することができる。

Abstract

このビデオでは、グリアフィーダー層、bilaminarまたは共培養モデルとして知られているシステムの存在下で培養ラット大脳皮質ニューロンのプロセスをガイドします。このシステムは、ガラスまたはプラスチック製の成長基板のどちらかを必要とする実験の様々なニーズに適しており、ニューロンの他のタイプの培養にも使用できます。

後期胚のステージ（E17）から得られたラット皮質ニューロンは、ガラス製カバースリップまたはそれぞれ、皿やプラスチック製のカバースリップ（Thermanoxとして知られている）上に成長させたグリア細胞のフィーダー層が直面している組織培養皿に播種されています。 2つの構成の選択は、特定の実験が必要な場合があります使用されるテクニック、、かどうかに依存し、そのニューロンは、ガラス（例えば、カルシウムイメージングに対するウエスタンブロット）で栽培されています。グリアフィーダー層、混合グリア細胞のアストログリア富化二次培養は、別々に新生仔ラットの皮質（P2 - 4）から神経細胞への事前の用意されています解剖。

神経細胞の培養物と比較して、この培養系の主な利点は、唯一の神経細胞の成長、生存、そしてより正確に生体内で脳の環境に類似したグリアフィーダー層、から分泌される栄養因子が提供する差別化のサポートです。また、共培養は、ニューロングリアの相互作用^1を研究するために使用することができます。

同時に、神経細胞層におけるグリア細胞のコンタミネーションは、他の確立された方法に匹敵する実質的に純粋な神経細胞層につながる別の手段（低密度の文化、有糸分裂阻害剤の添加、最適化された培地の血清および使用の欠如^）、1によって阻止される^-3。神経細胞は、容易に培養中にいつでもグリア層から分離し、電気生理学^4、細胞分子生物学^5-8、生化学^5、画像処理とマイクに至るまでさまざまな実験的なアプリケーションに使用できますroscopy ^{4,6,7,9,10。}いくつかの細胞株は、プロセスを拡張する作業が主なニューロンは、機能的なシナプス^11を形成する神経細胞株で観察されていないプロセスを軸索と樹状突起を拡張。

この共培養系を用いて培養ラット海馬ニューロンの詳細なプロトコールは、以前は^4,12,13記載されている。ここでは詳細皮質ニューロンに適した修正プロトコルを。約20x10 ^6個の細胞がそれぞれのラットの胚から回収されるように、この方法では、ニューロン（しかし非常に均一な神経細胞集団が心配ではない）を大量に必要とする実験のために特に有用である。ニューロンとグリア細胞の調製は時間特異的に計画する必要があります。我々は、ニューロンをサポートするために、培養ラット皮質ニューロンと同様に培養グリア細胞のためのステップバイステップのプロトコルを提供します。

Protocol

1。グリアの解剖（〜2週間メッキニューロン前）

1. 70％エタノールで清の代わりに滅菌ツールの準備を行うには、60 mmの培養ディッシュ（脳あたり一皿）に4 mLの冷解剖媒体を追加し、解凍するため氷の2.5％トリプシンとDNaseを置く（表VIにおける手術器具の詳細を表示する）。
2. 100ミリメートル滅菌シャーレ2〜4日齢の子犬と場所の頭を刎ねるために、大きなハサミを使用してください。
3. 皮膚を通して正中線のカットを作成し、頭蓋骨を露出する肌を引き戻すために培地はさみを使用してください。脳組織の下に損傷を与えることなく、頭蓋骨を通して正中線カットと2つの側面カットをするために湾曲したハサミを使用してください。脳を露出する上部の頭蓋骨を取り外します。
4. 脳を抽出し、（組成は表Iを参照）4 mLの冷解剖の培地を含む独自の60mmディッシュに入れてください。実体顕微鏡（ライカZOOM 2000、ズーム制御：7-30）の下に皿を置き、半球を分離するために5番の鉗子を使用し、中脳を削除し、そして皮OFF髄膜。
5. 冷たい解剖培地で新鮮な60mmディッシュ内のすべての解剖脳皮質を収集し、湾曲したハサミを持つ組織をミンチ。
6. 滅菌済み15 mLの試験管にみじん切りの組織を移す。冷たい解剖培地で4.5 mLまでのボリュームを持参し、2.5％トリプシンの500μLを加える。 パラフィルムで真空管をラップし、反転によって5分ごとに混合、15分間37℃の水浴中に浮く。

   （注意：ここで我々は最大5頭まで使用しているとき我々は一般的に従うプロトコルを記述し、より多くの子犬が使用されている場合、ボリュームが適切に調整する必要があります）

7. 引き継がトリプシン含有解剖媒体の体積を最小限に、新しい15 mLの試験管に組織を移す。新鮮な解剖培地で4.8mLにボリュームを持参し、60 ug / mlと（ストック溶液：解剖の培地2ml中のDNaseおよび5 mgの硫酸マグネシウム3mgの）の最終濃度になるように200μLのDNaseを加える。滅菌5mLのピペットで静かに〜20回ひいて粉にするTEは、その後（組成については、表IIを参照）グリアメッキ培地10mLを加える。
8. 組織の大部分は4-5分のために解決することを許可し、50mLのチューブに細胞懸濁液の上位80％を譲渡。グリアのメッキ媒体（および必要に応じてより小さいピペットを用いて）の、さらに2〜3 mLの組織の粉砕を繰り返して、再び、組織が和解し、以前のコレクションに上位80％を追加することができます。 280グラム（またはIECセントラCL2遠心1300 rpm）で15分間グリアメッキ媒体と遠心で20mLの全量をもたらす。
9. 上清を吸引除去し、（ほぼ使用される子犬の数に応じて5〜7 mLを用いて）グリアメッキ培地で細胞ペレットを再懸濁します。その後解剖し、各脳に対して10mLを持つために追加のメッキ媒体を追加してください。各75センチメートル²フラスコ（フラスコあたりつまり1つの脳）にも、プレートの細胞懸濁液10mlを混ぜる。
10. 37℃インキュベーターにセットして培養フラスコを移動℃のCO2（5〜10％、ナトリウムbicarbonaに比例する培地のTEの内容）。 3〜4日ごとにし、24〜48時間後に培地を変更します。

2。二次グリア（メッキのニューロンの48時間前）

1. 各洗浄とオートクレーブthermanoxの周囲に溶融paraplastワックスの3小滴を加えることによってthermanoxカバースリップを（神経細胞が皿上に播種する場合）を用意。細胞はthermanoxのこの側面に播種されます。私たちのthermanoxは再利用可能な手作りです〜プラスチックからカット60 mmの挿入（試薬の表VIを参照）を介して掘削〜50 2 mmの穴を、市販の文化も挿入が代わりに使用することもできる。
2. 精力的にどんなアタッチされていない細胞を除去するために、各フラスコを振って、PBSで2回と主なグリアを洗ってください。コンフルエント主要グリアと各フラスコには約1000万アストログリアを提供する、従って私達は定期的に実験2〜4フラスコを使用してください。
3. 0.05パーセントtryspin - EDTA（PBS中、第9 mLに希釈した1 mL10X 0.5パーセントトリプシン- EDTAストック溶液）で細胞を剥離する。コンビNEは、1つの50 mLコニカルチューブに2フラスコから細胞と（試薬の表IIを参照）グリア細胞のメッキ液の同量を追加します。 280 gで15分間遠心する上清を吸引除去し、グリア細胞のメッキ媒体の数mLでグリア細胞ペレットを溶解する。
4. 血球計数器を用いて細胞をカウントし（〜1 × 10 ⁶細胞/ mL）、必要に応じて細胞懸濁液を希釈し、プレートは（60皿（神経細胞がカバーグラス上に播種される場合）で、またはthermanoxのカバースリップ上のいずれかの細胞を神経細胞は、上にメッキされる場合60ミリメートル皿）。細胞は、グリア細胞のメッキ液を使用して、皿やthermanoxあたり500,000個の細胞で播種してください。その後2時間グリアメッキ媒体におけるフリップthermanoxと水没のセルの後thermanoxカバーグラス、滴下方法で細胞のプレート600μL、の場合に。
5. 神経カバースリップのための二次グリアの60 mmディッシュを準備する場合、神経解剖の前に夕方のN2.1に培地を変更してください。

3。神経解剖と文化

1. 物理的に細胞層を分離し、細胞の掻き取りを防止するために、各滅菌カバーグラスの周囲に溶融paraplastワックスの3小滴を追加することにより、カバーガラス（直径15mm）を準備します。細胞はカバースリップのこの側面上にメッキされます。
2. 2時間または一晩、0.5 mg / mLのポリリジンでコーティングプレートやカバースリップ（表VIを参照してくださいどちらポリ- L -リジンまたはポリ- D -リジンは、ホウ酸緩衝液に溶解した）。滅菌水で2〜3回洗い、完全に乾かします。注：カバーグラスをカバースリップを組織培養皿に配置されている場合、簡単に発生する可能性ポリ-リジンまたはセルメッキ、とコーティングの間にこぼれる/ソリューションの広がりを避けるために、疎水性のペトリ皿に配置されています。
3. グリア郭清（ステップ1.1）の場合と神経解剖の準備。 17日間の妊娠ラットを安楽死させる、70％エタノールで毛皮をスプレーし、子宮を露出する皮膚を通して内側にカット。すべての胎児を取り出して、中に置いてください滅菌100 mmディッシュ。
4. 急速に自由細かく分析し、それぞれの胎児の首を切る、冷たい解剖の培地（4mL）で独自の60mmディッシュに各ヘッドを配置すること。約2,000万のニューロンがそれぞれE17胎児に由来すると我々は、通常、実験4〜5胎児を解剖。より多くの胚が必要な場合は、全体の手順は（ステップ3.4から3.12から）以上の90〜100分を持続していないことを確認してください。
5. 実体顕微鏡とNo.1/No.5鉗子を使用すると、皮膚や頭蓋骨を開いて引っ張って脳を抽出し、半球を分離し、中脳と髄膜を除去することによって大脳皮質を分離。
6. 冷たい解剖培地と新鮮な60mmディッシュにすべて切除した皮質を収集し、そして約1 mmの部分に曲線ハサミで組織をミンチ。
7. 滅菌済み15 mLの試験管にみじん切りの組織を移す。冷たい解剖培地で4.5 mLまでのボリュームを持参し、2.5％トリプシンの500μLを加える。 パラフィルムで真空管をラップし、15 minu用36 ° Cの水浴中に浮く反転によって5分ごとに混合TES、。
8. 引き継がトリプシン含有解剖媒体の体積を最小限に、新しい15 mLの試験管に組織を移す。新鮮な解剖培地で4.8 mLに持参し、60 ug / mlとの最終濃度になるように200μLのDNaseを加える。滅菌5または2 mLのピペットで約10回をひいて粉にする、組織の大部分を分離するファイアーポリッシュ（コールド）パスツールピペットを使用して、必要に応じてこの手順を繰り返します。 4-5分のために解決するし（もしあれば、一般的には非常に少ない）は、組織の残りの部分ができます。
9. 組織の定着部分を残しながら、上部のシングルセルサスペンションを削除し、ニューロンのメッキ液の等量（表IIIを参照）を使用して、新しいチューブにこのソリューションを配置。優しくよく混ぜ合わしかし、その後、細胞を数える;必要に応じて15ミリメートルカバースリップ（200μLで35,000細胞ごと）または60 mmディッシュ（3 mLの^{1 × 10 6}細胞ずつ）上にプレート。インキュベーター（36.5 ° C、5〜10％CO2）にセルを転送する。
10. 3-4時間のCOMBIN後電子ニューロン層と次のように二次グリア。 60 mmの培養ディッシュ上でニューロンの場合は、、暖かいDMEMで細胞を洗浄の無血清培地4mlの（N2、表IVを参照）に培地を変更し、各プレート（グリア細胞は神経細胞が直面している必要があります）にグリアワンthermanoxを追加します。神経細胞をカバーグラスの場合は、ニューロンが下向きで、二次グリアの各60 mmディッシュに3〜5カバースリップを転送する。
11. 24時間ニューロンをめっきした後、グリア細胞の増殖を防ぐために、各皿にシトシン-β- D -アラビノフラノシドの10μMを追加。我々は、4mMのストック溶液を準備し、N2培地で1:10に希釈し、各ディッシュに希釈した溶液の25 UL / mLを加える。
12. 正確な時間が必要な分化段階に依存するが、細胞は一般的に、文化の中で7〜10日後に実験に使用され、生存期間が有意に低下することなく4週間にのために育っている。最初の週後に、それはメディアの半分のボリュームが毎週交換することをお勧めします。

ニューロンは基板に取り付けて数時間後、彼らはlamelliopodiaを拡張し始める。プロセスは、細長い（図2A）と文化の中で数日間にわたって分極し続け、そして拡張された軸索と樹状突起は、（図2B、MAP2染色）はっきりと見える。ニューロンは樹状喬木がより精巧になり、それらがシナプスの連絡先を開発する成熟するにつれて、約2-3週間、多くの樹状突起をめっきした後（図^2C）11表示されます。

図1。グリアフィーダーレイヤー（二次グリア）と一緒に培養ラット皮質ニューロンのための手順のフローチャート。最初に、11日間神経解剖する前に、主要なグリア細胞の培養は、新生児ラット（P2 - 4）から調製される。細胞（神経解剖前にプライマリグリアと二日をめっき後のおよそ九日）コンフルエントのときに、アストロサイトはメカです。anically皿またはthermanox上にオリゴデンドロサイト前駆細胞とミクログリアとメッキのどちらか（二次グリア）から分離。ニューロンは、E17胚およびカバースリップ上または皿（ポリ-リジンでコーティングされた）のいずれかでメッキの皮質から取得されます。メッキ後4時間、ニューロンの層は二次グリアに追加されます。

図2様々な段階での文化の例（例えば、5時間、12 DIV、21 DIV）。。図は、異なる時点でのカバースリップ上で皮質ニューロンの代表的なイメージです。ニューロンは、基板のニューロンに接続した後lamelliopodiaを拡張し始める。位相コントラスト画像は5時間メッキ（）の後にいくつかの拡張神経突起を示しています。真ん中の画像（B、Cookら、2010年から、許可を得ては）固定され、神経細胞樹状突起のマーカーMAP2で免疫染色12 DIV皮質ニューロンを示しています。ヘキスト染色をcounterstaiとして使用された寧。神経細胞が成熟するにつれて樹状突起棘は、また（C）見えるようになります。スケールバー：A、B =25μmと、C =10μmである。

Discussion

ニューロンは、実験的な分析のために容易に分離できるようにすることながら、このプロトコルでは、グリア細胞の存在下で培養ラット初代皮質ニューロンための方法を提供する。健康な神経表現型のグリアの開発をサポートする一方、生理学的に適切な方法で実験的な治療にも変調する神経細胞応答。さらに、この細胞集団の神経細胞で培養する前に、主要なグリアを継代することにより選択的に炎症性ミクログリアの刺激を防止する、アストロサイトにおいて豊富になります。しかし、グリア細胞の種々の割合が望ましいことが実験で、特定の種​​類については、このように追加のグリア細胞の培養物は、この細胞組成を最適化するために実施することができる。このプロトコルはまた、特定の実験的な要求に合うように、このような海馬などの脳の他の領域から派生した培養ニューロン、に適応することができます

この手法の主要な関心事は、細菌の続きを妨げることが挙げアミノ化と神経細胞層にグリア増殖を防ぎます。このシステムは、このように無菌テクニックはすべての段階で特に重要な、抗生剤が含まれていません。グリア増殖は、抗有糸分裂剤シトシンアラビノフラノシド、低密度のメッキおよび無血清培養液の添加により防止され、このプロトコルのアストロサイトは神経細胞層の^1,4のセルの以上3〜5％未満を構成する必要があります以下のと1％未満のミクログリアが検出されなければなりません。 Immunopanningまたは他の技術であっても、この低グリア汚染^4を除去するために使用することができます。

分析のための単一の型を分離することが望ましい場合は、この手法はまた、共培養するための接着細胞タイプのあらゆる種類を変更することができます。例えば、このシステムが正常のCa ²に骨芽細胞の影響を分析するために適合された⁺骨転移癌細胞¹⁴にシグナリング。