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Biology

La ultrafiltración de flujo tangencial: "en verde" Método para la selección del tamaño y concentración de las nanopartículas de plata coloidal

Published: October 4, 2012 doi: 10.3791/4167
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1
1Department of Chemistry, Wright State University, 2Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University

Summary

Ultrafiltración de flujo tangencial (TFU) es un método de recirculación para la separación basada en el peso de muestras biológicas. TFU fue adaptado al tamaño-select (1-20 nm de diámetro) y muy concentrar un gran volumen de polidispersos nanopartículas de plata (4 ml L de 15,2 g

Abstract

Hoy en día, AGNPS son ampliamente utilizados en la fabricación de productos de consumo, 1 desinfectantes de agua, 2 terapéuticos, 1, 3 y dispositivos biomédicos 4 debido a sus propiedades antimicrobianas potentes. 3-6 Estas aplicaciones de nanopartículas están fuertemente influenciadas por el tamaño y estado de agregación AgNP . Muchos de los retos existentes en la fabricación controlada 7 y tamaño de aislamiento basado en 4,8 de AGNPS no funcionalizado, homogéneos que estén libres de recubrimiento químicamente agresivo / agentes estabilizadores o disolventes orgánicos. 7-13 Limitaciones emergen de la toxicidad de los reactivos, los altos costos o reducirse eficiencia de los métodos de síntesis de AgNP o aislamiento (por ejemplo, centrifugación, solubilidad dependiente del tamaño, cromatografía de exclusión molecular, etc.) 10,14-18 Para superar esto, se mostró recientemente que el ST permite un mayor control sobre el tamaño, concentración y agregación estado de Creighton AGNPS (300ml de 15,3 mg ml -1 a 10 ml de 198,7 mg ml -1) que los métodos convencionales de aislamiento tales como ultracentrifugación. 19

ST es un método de recirculación comúnmente utilizado para el aislamiento basado en el peso de proteínas, virus y células. 20,21 Brevemente, la muestra de líquido se hace pasar a través de una serie de membranas de fibra hueca con un tamaño de poro en el intervalo de 1.000 kD a 10 kD. Componentes más pequeños suspendido o disuelto en la muestra pasará a través de la barrera porosa junto con el disolvente (filtrado), mientras que los constituyentes mayores son retenidas (retenido). TFU puede ser considerado un "verde" método, ya que no daña la muestra ni requiere disolvente adicional para eliminar el exceso de reactivos tóxicos y subproductos. Además, AFT se puede aplicar a una gran variedad de nanopartículas como ambos filtros hidrófobos e hidrófilos están disponibles.

Los dos objetivos principales de este estudio fueron: 1) para ilustrarlos aspectos experimentales de la TFU enfoque a través de una experiencia de video invitado y 2) para demostrar la viabilidad del método de AFT para grandes volúmenes de nanopartículas coloidales y menores volúmenes de retenido. En primer lugar, AGNPS unfuctionalized (4 L, 15,2 mg ml -1) se sintetizaron usando el método bien establecido Creighton 22,23 por la reducción de AgNO 3 con NaBH 4. AgNP polidispersidad fue minimizado a continuación a través de una TFU 3-paso utilizando un filtro de 50-nm (460 cm 2) para eliminar AGNPS y AgNP agregados-mayor que 50 nm, seguido por dos 100-kD (200 cm 2 y 20 cm 2) filtros para concentrar los AGNPS. Las muestras representativas se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión, UV-Vis espectrofotometría de absorción, espectroscopia Raman, y plasma acoplado inductivamente espectroscopia de emisión óptica. El retenido final consistió altamente concentrado (4 ml, 8,539.9 mg ml -1) todavía humilde agregada y homogéneaAGNPS de 1-20 nm de diámetro. Esto corresponde a un rendimiento de concentración de plata de aproximadamente 62%.

Protocol

1. Síntesis de AGNPS coloidales

El mecanismo de reacción para el método Creighton (ligeramente modificada, de bajo costo) 22 se describe en gran detalle en la información de apoyo de referencia Pavel et.al junto con la hidrólisis no deseada reacción secundaria de NaBH 4 a temperatura ambiente o superior. 23

  1. Limpiar todo el material de vidrio durante 12-24 h en un 10% de HNO 3 baño, después de 4-12 horas en un NaOH 1,25 M en baño de etanol al 40%, y finalmente autoclave. Cristalería debe enjuagarse por completo con un mínimo de cinco veces con agua ultrapura (17 MW o más) después de que el ácido y los pasos para el baño.
  2. Preparar 300 ml de una 2 mM NaBH 4 y 100 ml de solución de un 1 mM AgNO 3 solución con agua tratada en autoclave se enfrió a 10 ° C. Las temperaturas más bajas evitará que la reacción secundaria de NaBH 4.
  3. Añadir 300 ml de 2 mM NaBH 4 a una solución de 500 ml cont matraz Erlenmeyer de reacciónaining una barra de agitación y envolver el matraz con papel de aluminio para evitar la oxidación de la plata. Colocar el matraz en un baño de hielo en una placa de agitación y se agita la solución a 325 rpm durante 10 min.
  4. Primer una bureta 25 ml por lavado con una columna llena de agua ultrapura. Después del cebado, Llenar la bureta con solución de AgNO 3 y envolver con papel de aluminio.
  5. En un cuarto oscuro, añadir 50 ml de 1 mM de AgNO 3 solución a una velocidad de 1 gota sec -1 a la solución NaBH 4 con agitación continua (Figura 1A). Cubrir la sección central del aparato con una "tienda lámina" para minimizar la exposición de la luz durante el AgNO 3 adición. El AgNO 3 Además se requieren 30-40 min. Reponer el baño de hielo periódicamente.
  6. Después de la AgNO 3 adición es completa, reponer el baño de hielo y se continúa agitando la solución coloidal por un período adicional 45-50 min. La formación de AGNPS coloidales es señalado por un cambio en el color de incoloroa un color amarillo dorado, que es característica de la máxima resonancia de plasmón superficial de AGNPS (Figura 1B).
  7. Una vez que la reacción se ha completado, refrigerar el coloide. AgNP lotes coloidales se pueden combinar después de una semana si el coloide se ha mantenido constante, es decir, la solución coloidal no ha agregado y el lote se ha caracterizado usando espectrofotometría UV-Vis absorción y la espectroscopia Raman para identificar posible agregación o contaminantes.

2. Caracterización de AGNPS coloidales

Un espectrofotómetro Cary 50 UV-VIS-NIR (Varian Inc.) y un sistema Raman LabRamHR 800 (Horiba Jobin Yvon, Inc.) equipado de una Olympus BX41 microscopio confocal Raman, se utilizaron para la caracterización AgNP. El Cary WinUV software, LabSpec v.5 y Origen 8,0 software se utilizaron para la recolección de datos y análisis.

Nota: Los parámetros de adquisición tendrá que ser optimizado foLos modelos r otros instrumentos.

Determinación de la resonancia de plasmón superficial de AGNPS coloidal mediante espectrofotometría UV-VIS

  1. Llenar un 1 cm 3 cubeta desechable con Creighton coloide y agua ultrapura en una relación en volumen 1:10. Llene otra cubeta de 1 cm 3 de agua ultrapura para una corrección de línea de base en blanco. Limpie el exterior de ambas cubetas con un Kimwipe.
  2. Ajuste el espectrofotómetro a modo de absorbancia a partir de un mínimo de Y de -0,5 a un máximo de 1,0 Y. Establece la ventana X de escaneo a 200-800 nm y seleccione una velocidad de barrido rápido de 4.800 min -1 nm con corrección de línea de base.
  3. Insertar la cubeta llena de agua en el instrumento y ejecutar una exploración basal. Repetir si es necesario hasta un control de línea base no cero se consigue.
  4. Reemplazar la cubeta de referencia con la cubeta de muestra e iniciar una exploración de absorbancia para la recogida del espectro de absorción UV-Vis de la muestra coloidal (Figura 1C).

    Purity Test de AGNPS coloidal mediante espectroscopia Raman

    Debido a la limitación de tiempo de la demostración en video (10-15 min vídeo) y la limitación de espacio del texto del protocolo (máximo 3 páginas), esta sección experimental no será grabada en video.

    1. Establezca los ajustes de los parámetros del instrumento de la siguiente manera: fuente de excitación (632,8 nm He-Ne), el filtro (sin filtro, la potencia del láser en la muestra ~ 17 mW), el agujero confocal (300 m), el espectrómetro (730 cm -1), rejilla holográfica (600 arboledas / mm), la lente objetivo (50x larga distancia objetivo de aire de trabajo), el tiempo de exposición (30 s), y ciclos de acumulación (5).
    2. Utilizar una pipeta limpia para llenar una cubeta de cuarzo de 2 ml de coloide y suavemente inserte el enchufe. Utilice un Kimwipe para limpiar huellas digitales, manchas o coloide de la superficie de la cubeta. Significativamente más baja la platina del microscopio. Seleccione la lente objetivo 50x y colocar la cubeta en el escenario.
    3. Enfoque la laser haz en el coloide AgNP directamente debajo de la pared interior de la cubeta usando el modo de vídeo del instrumento y la cámara Olympus. Apague las luces de las habitaciones y adquirir espectro Raman (Figura 1D).

    3. Tamaño de selección y concentración de AGNPS coloidal mediante ultrafiltración de flujo tangencial (TFU)

    Un KrosFlo II Investigación de filtrado del sistema (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) fue utilizado para limitar la polidispersidad AgNP y concentrar ellos (Figura 2). Los tres pasos del proceso de TFU fueron: (1) Tamaño de selección de AGNPS y AgNP-agregados de 50-nm de diámetro y más grandes usando un 50-nm MidiKros polisulfona módulo (460 cm 2), 2) la selección del tamaño y la concentración de AGNPS de 1-20 nm de diámetro usando un 100-kD MidiKros filtro (200 cm 2), y (3) la reducción de volumen adicionalmente usando un MicroKros 100 kD polisulfona de filtro (20 cm 2) (Figura 3).

    1. Conectar el tamaño de la tubería de alimentación 17 MasterFlex a la bomba peristáltica de acuerdo a la Figura 2A. Una unión en Y y una unión de tubo se necesita para la puesta a punto. Conecte el tubo al módulo de 50-nm MidiKros. Asegúrese de fijar la tubería para filtrar utilizando bridas. Seleccione 17 tubos de tamaño con el botón SIZE.
    2. Seleccione a la izquierda dirección de la bomba mediante el botón DIR. Asegúrese de que el botón MODE está en INT.
    3. Baje la velocidad de la bomba a menos de 300 ml min-1 antes de arrancar la bomba. La velocidad de la bomba debe ser ajustada de acuerdo con el tamaño de la tubería usada. Debería ser un ajuste pequeño para permitir al operador reaccionar rápidamente a las fugas potenciales, pero suficientemente grandes para tener todavía un efecto de cebado del sistema. Con el fin de crear el vacío necesario para extraer coloide del depósito en el tubo y el filtro, cortar el tubo que conduce desde la sección inferior del filtro a la parte superior de la unión en Y en el centro de la tubería.
    4. Una vez que el líquido fluye libremente a través del tubo, apague la bomba, únase a la sección rota de la tubería con un cruce de tubos y asegurar con abrazaderas de plástico. Encienda la bomba de nuevo y continuar filtración.
    5. Compruebe el circuito de la tubería de fugas. Si se encuentra una fuga, arreglar la fuga mediante el ajuste de la instalación o volver a obtener-con una brida de plástico. Una vez que el sistema de tubos está libre de fugas, puede ser la tasa de flujo de la bomba aumentó a no más de 700 ml min-1. Este valor de velocidad de la bomba debe ser optimizado de acuerdo al tamaño de la tubería para evitar el fallo del tubo. Continuar la filtración hasta que el líquido en la botella del depósito se agota a casi nada.
    6. Una vez la filtración se completa, se recoge el filtrado que contiene AGNPS diámetro de 50-nm y smaller. El retenido se puede guardar para su posterior análisis de acuerdo con la aplicación específica AgNP.

    Paso 2

    1. Enjuague el tubo con 2% de HNO 3 y agua ultrapura antes de instalar las MidiKros 100 kD filtrar utilizando la misma configuración que para el módulo de 50-nm.
    2. Repita el paso 3.3 con el módulo de 100 kD MidiKros.
    3. Una vez la filtración se completa, recogen los contenidos de la tubería y el filtro (100-kD retenido). El volumen debe ser de aproximadamente 50 ml.

    Paso 3

    1. Conectar el tamaño de la tubería 14 y los MasterFlex MicroKros 100 kD filtro a la bomba peristáltica de acuerdo a la Figura 2B. Asegure todas las uniones con bridas. Seleccione el tamaño del tubo 14 de la bomba mediante el botón SIZE y menor será la velocidad de la bomba a 30 ml min -1.
    2. Comience el proceso de filtración. Compruebe el circuito de la tubería de fugas. Si se encuentra una fuga, arreglar la fuga, ajustando el ajusteting o re-asegurando con una brida de plástico.
    3. Una vez que el sistema de tubos está libre de fugas, el caudal de la bomba se puede aumentar a no más de 90 ml min-1. Continuar la filtración hasta que el líquido que queda en la botella de depósito contiene una cantidad mínima de concentrado.
    4. Los contenidos restantes de la tubería y el filtro puede ser recogida en la botella de depósito mediante la eliminación de la sonda de alimentación desde la botella mientras la bomba está en funcionamiento. Una vez que los contenidos de los tubos y el filtro están en la botella de depósito, la bomba puede ser apagado.

    4. La cuantificación de la cantidad de plata coloidal en AGNPS por plasma de acoplamiento inductivo espectroscopia de emisión óptica (ICP-OES)

    Cada muestra fue digerida químicamente coloidal y la cantidad de plata se cuantificó mediante ICP-OES utilizando un espectrómetro A 710E (Varian Inc.). Una curva de regresión lineal para la calibración de plata (Figura 4) se construyó utilizando ocho normas de plata (0, 3, 7, 10, 15, 25, 50, y 100 mg L -1), que se preparó a partir de un estándar de plata 10.000 mg ml -1 para el análisis de trazas de metales (Ultra Scientific).

    1. Químicamente digerir las muestras utilizando HNO 3. Las muestras representativas son el original coloide (paso 1), 50-nm filtrado (paso 1), 100-kD retenido (paso 2), y final de 100 kD retenido (paso 3) (Figura 3).
    2. Las muestras deben ser diluidas con 2% de HNO 3, utilizando las relaciones de volumen siguientes: 1:1000 para el original coloide, 1:1000 para el filtrado 50-nm, 1:25,000 para la primera 100-kD retenido, y para 1:250,000 el final de 100 kD retenido. Para evitar la lixiviación de plata, todas las muestras deben almacenarse en recipientes de polipropileno de baja densidad.
    3. Establecer los parámetros del instrumento ICP-OES como sigue: longitud de onda de Ag (328.068 nm), la potencia (1,20 kW), flujo de plasma (15,0 L min -1), de flujo auxiliar (1,50 L min -1), y la presión del nebulizador (200 kPa ).
    4. Cada sample debe ser medido por triplicado con un tiempo de repetición de 10 s. Entre de medición de tiempo de estabilización de 15 segundos y un retardo de 30 segundos muestra la absorción se debe utilizar. Un blanco de método debe ser introducido entre cada muestra para reducir el potencial de contaminación cruzada.

    5. Distribución del Tamaño de AGNPS coloidal mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM)

    A Phillips EM 208S TEM se utiliza para visualizar las AGNPS coloidales. Micrografías electrónicas fueron capturadas utilizando una cámara de alta resolución Gatan Bioscan y analizados con el software ImageJ. 24

    1. Diluir la muestra de material retenido 100 kD con agua ultrapura (1:100 relación de volumen). Depósito 20 l de la original de coloide y la diluida 100-kD retenido (paso 3) sobre rejillas de oro 300 de malla formvar recubiertos (Microscopía Electrónica de Ciencias). Permitir que las rejillas a secar en un desecador. Ver en un día.
    2. Establecer el potencial de aceleración del instrumento TEM a 70 kV para visualizar AGNPS. CApture micrografías electrónicas (Figura 5) utilizando la cámara de alta resolución y guardar como archivos de formato de imagen etiquetada (TIFF).

    6. Los resultados representativos

    Síntesis y Caracterización de AGNPS coloidales

    Cuatro litros de AGNPS Creighton coloidales se sintetizaron utilizando con éxito la configuración representada en la figura 1A. El final de coloide tenía un característico color amarillo dorado (Figura 1B). 22, 23 El espectro de absorción UV-VIS de este coloide tenía un típico agudo, simétrico pico de plasmón de superficie (SPR) a 394 nm (Figura 1C). El espectro Raman del original coloide Creighton y el final de retentado de 100 kD presenta sólo tres modos de vibración, a saber, la flexión (1640 cm -1) y los modos de tensión simétrica y asimétrica de H 2 O (3245 cm -1 y 3390 cm -1 , respectivamente) (Figura 1D). </ P>

    AFT de AGNPS coloidales

    La configuración de la TFU y esquemática del proceso de 3-paso TFU se representan en las figuras 2 y 3, respectivamente. En el paso 1, un filtro de 50-nm (460 cm 2) se utilizó para seleccionar por tamaño y de quitar AGNPS y AgNP agregados de diámetro-50-nm y más grandes de la original coloide (alrededor de 100 ml de 50-nm retenido). Este paso también fue acompañado por una reducción de volumen pequeño de 4 L de original coloide hasta 3,9 L de 50-nm filtrado. No etapa de ruptura lavado a contracorriente o flujo se utilizó. La mayor reducción de volumen (es decir, la eliminación de agua) se obtuvo en el paso 2, cuando el filtrado 50-nm se ejecuta posteriormente a través de un filtro de 100 kD (200 cm 2). La resultante de 100 kD retenido tenía un volumen total de 50 ml. La mayoría de los subproductos de síntesis y reactivos en exceso se elimina en este paso a través del disolvente agua (3.850 ml de 100-kD filtrado). Además, la concentración de AgNP se logró mediante la adicion de una tercera etapa de filtración para el procedimiento previamente descrito. 19 En este paso 3, un filtro de 100 kD de un área superficial más pequeña (20 cm 2) redujo el volumen retenido de 100-kDa a 4,0 ml. Las mediciones de TEM demostrará que esta final de 100 kD retenido consiste sobre todo en humildes AGNPS agregados de 1-20 nm de diámetro.

    ICP-OES y TEM de AGNPS coloidales

    Una curva de calibración lineal de regresión (Figura 4) para la plata fue construido a partir de ocho estándares (0, 3, 7, 10, 15, 25, 50, y 100 mg L -1). La cantidad de plata en cada una de las cuatro muestras representativas coloidales A continuación se determinó a partir de la curva de calibración ICP-OES mediante extrapolación: original coloide (15,2 ppm, Figura 3A), 50-nm filtrado (14,1 ppm, Figura 3B), primera 100 - kD retenido (683,1 ppm, Figura 3C) y final de 100 kD retenido (8,538.9 ppm, Figura 3D).El rendimiento real de 15,2 ppm es muy cercana a la teórica rendimiento típico de 15,4 ppm para la reacción de Creighton. La extrema concentración de AGNPS (4 ml de 8,538.9 ppm) se reflejó en un cambio dramático en el color desde el amarillo dorado para el original coloide al marrón oscuro para la final de 100 kD retenido (Figura 3, las inserciones de imágenes vial). La calidad de los filtros se encontró que era crítica para el proceso de AFT, en particular al paso 1. Las concentraciones retenido final varió de 3,390.1 a 9,333.3 ppm ppm dependiendo de la condición de los filtros (muy usado versus completamente nuevo). Si la membrana de poros se ve comprometida, AGNPS que tienen diámetros de menos de 50-nm también se mantendrá y, posteriormente, se reducirá la cantidad total de AGNPS que se recoge en el filtrado. Optimización del proceso de filtración para incluir el monitoreo de presión y limpieza adecuada puede aumentar la vida útil de los filtros.

    Micrografías representativas de TEM de el original coloide Creighton y la final de 100 kD retenido (paso 3) se muestran en la Figura 5A y 5C, respectivamente. En su estado no agregado, AGNPS aparecen como zonas negras redondas sobre un fondo gris claro. Aproximadamente 800 AGNPS se identificaron en las micrografías de MET de cada una de las dos muestras y se analizaron usando el software Image J. Una partícula fue definida por un perímetro completo y cerrado. Un valor umbral de área se fijó en 1,0 nm 2 de acuerdo con la resolución de las micrografías TEM. Los recuentos AgNP y datos de área fueron exportados a Microsoft Excel y los diámetros AgNP se extrapolan. El diámetro promedio de AgNP en el original coloide y el final de retentado de 100 kD se determinó que 9,3 nm y 11,1, respectivamente. Las medidas del diámetro de las AGNPS fueron exportados a Origin 8,0 software y un histograma tamaño TEM se construyó para cada muestra (Figura 5B y 5D).

    1 "src =" / files/ftp_upload/4167/4167fig1.jpg "/>
    Figura 1. A) Síntesis de configuración, B) características de color, C) UV-Vis espectro de absorción, y D) espectro Raman de AGNPS Creighton coloidales.

    Figura 2
    Figura 2 Configuración TFU experimental para A dos pasos) 1 y 2:. I) depósito que contiene AGNPS Creighton coloidales. II) recipiente para la recogida de filtrado. III) Y-unión en la tubería. IV) la cabeza de la bomba peristáltica. . V) O 50-nm o 100-kD Mediodía Kros filtro B) Paso 3: I) que contiene Reservoir AGNPS Creighton coloidales. II) recipiente para la recogida de filtrado. III) 100-kD Micro Kros filtro.

    Figura 3
    Diagrama de flujo de la Figura 3. Representa el proceso de AFT. Las cajas sombreadas azul-marcar las suspensiones coloidales de AGNPS recogidos para análisis posteriores. Vial photographs mostrar A) original coloide lote, B) 50-nm filtrado recogido después de procesar el original coloide a través del filtro 50-nm (460 cm 2), C) retenido primera 100-kD obtenido después de la reducción de volumen con el 100-kD Mediodía Kros filtro (200 cm 2), y D) retenido final de 100 kD resultante de la reducción de volumen con el 100-kD Micro Kros filtro (20 cm 2). El 100-kD filtrado parece agua.

    Figura 4
    Figura 4 ICP-OES calibración lineal construido con ocho estandartes de plata:. 0, 3, 7, 10, 15, 25, 50 y 100 mg L -1.

    Figura 5
    Micrografías de la figura 5. TEM de una AGNPS) original Creighton y C) 100 final-kD retenido (barra de escala es100 nm). Histogramas TEM tamaño, construidos mediante el análisis de aproximadamente 800 AGNPS para B) originales AGNPS Creighton, y D) retenido final de 100 kD. El recuadro en la Figura 5B muestra el amplio rango de tamaño de 41-75 nm para fines de comparación. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

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Discussion

UV-Vis Espectrofotometría de absorción y espectroscopia Raman de AGNPS coloidales

Es bien sabido que el número de picos de resonancia de plasmones superficiales en el espectro de absorción de un coloide disminuye a medida que la simetría de los aumentos AGNPS. Además, AgNP agregación conduce a la aparición de picos más amplios o rojo cambió-. 25,26 La presencia de un único pico agudo y simétrico SPR a 394 nm es indicativo de AGNPS pequeñas, esféricas de agregación moderada y distribución de tamaño.

La pureza de las muestras coloidales antes y después de la ultrafiltración se demostró mediante los espectros Raman de la original coloide Creighton y el final de retentado de 100 kD, que exhibieron sólo tres modos de vibración característicos a H 2 O. La señal de Raman asociado con impurezas orgánicas o contaminantes de ultrafiltración de Raman grandes secciones transversales se verá reforzada a través de la proximidad inmediata a la AgNPsuperficie (es decir, la llamada de superficie mayor espectroscopia Raman (SERS) efecto).

ICP-OES y TEM de ultrafiltrado AGNPS coloidales

La adición de un tercer paso, la filtración de 100 kD para el procedimiento previamente informado TFU 19 facilita la reducción exitosa de un mayor volumen de AGNPS Creighton coloidales (4L lote de 15,2 ppm) en un volumen de 1.000 veces más pequeña de retenido (4 ml de 8,538.9 ppm). Esto corresponde a un rendimiento TFU concentración de aproximadamente 62%, teniendo en cuenta la cantidad de AGNPS y AgNP-agregados de diámetro 50-nm y más grandes que se han eliminado. El grado de concentración es notable porque el final de retentado de 100 kD en su mayoría consistía en AGNPS monodispersas que eran 1-20 nm de diámetro y libres de exceso de reactivos y subproductos. El tercero, 100-kD etapa de filtración mejorado el rendimiento de concentración de 45% 20 a 62%. Otras mejoras TFU en el tamaño de selección y concentración de AGNPSse podría obtener mediante la utilización de membranas de fibras huecas adicionales. Filtros de tamaño de poro en el intervalo desde kD a 10 kD y áreas de superficie de 5,1 m 2 1.000 a 8 cm 2 están actualmente disponibles para ambas muestras hidrófobos e hidrófilos. Tampón de intercambio también puede realizarse durante la TFU, dependiendo de las aplicaciones posteriores. Cuando la reducción de volumen superior a 800-veces (es decir, cuando el volumen se reduce de 4 L a menos de 5 ml), hay una disminución en la estabilidad y la vida útil de la suspensión coloidal, debido al grado de concentración extrema. La vida útil de estos altamente concentrado, AgNP no funcionalizado es aproximadamente una a dos semanas a 10 ° C. Mientras inconveniente, esta limitación se gestiona a través de la planificación cuidadosa investigación y preparación. Este grado extremo de concentración fue deseado para estudios en curso nanotoxicity a diversas concentraciones. Lotes menos concentradas de AGNPS se espera que tengan una mejor estabilidad y vida útil más larga.

(Figura 5A y 5C) mostró un aumento en la frecuencia de AGNPS mínimamente agregados en la final de retenido 100-kD en comparación con el original coloide. Los histogramas de tamaño de TEM de las dos muestras coloidales (Figura 5B y 5D) confirmó además que la polidispersidad de los AGNPS Creighton coloidales se limita a través de AFT. Polidispersidad limitación adicional puede lograrse mediante el empleo de una serie de membranas de filtración de tamaños de poro más pequeños. Los diámetros de la AGNPS Creighton varió de 1 nm a 75 nm (Figura 5B y la inserción que muestra los contenedores de tamaño ampliado 41-75 nm), mientras que los AGNPS y / o AgNP-agregados de 50 nm y más grandes (0,9% de ciento AGNPS total) estaban ausentes en el histograma tamaño TEM de la final de 100 kD de la muestra (Figura 5D). El retenido de 100 kD se compone principalmente de AGNPS que tenían un diámetro de 1-20 nm, había una pequeña contribución (12,4%) desde AGNPS en el 21-40 contenedores de tamaño. Figura 5B y 5D confirmó que la distribución del tamaño de tendencia se mantuvo para el retenido 100-kD durante el proceso de AFT con la excepción del rango de 1-5 nm tamaño. Hubo una disminución notable en la frecuencia de los AGNPS más pequeñas de 1-5 nm de diámetro para la muestra de 100 kD (de 33,2% a 21,3%), que se atribuyó a AgNP paso a través del filtro de membrana en el filtrado. Como resultado, el diámetro AgNP promedio aumentó de 9,3 nm para el original coloide a 11,1 nm para la final de 100 kD retenido. Debido a aproximadamente 800 AGNPS se analizaron para ambas muestras coloidales, la disminución en la frecuencia de pequeñas AGNPS en los 1-5 nm (11,9%) y 6-10 nm (1,3%) rangos de tamaño fue acompañado por un correspondiente aumento en la frecuencia de las más grandes AGNPS en los cubos de 11-25 nm de tamaño (es decir, aproximadamente 12,8% de la original coloide al retenido 100 kD).

En conclusión, la AFT ha demostrado ser un eficiente, "verde" si el método paraze-selección y concentración de AGNPS coloidales con agregación mínima a escalas de volumen diferentes. La eliminación del uso de reactivos químicos agresivos o disolventes orgánicos procedentes de la síntesis AgNP (para mejor tamaño, la forma, y ​​el control de la agregación) puede reducir significativamente la toxicidad AgNP al tiempo que mejora su índice terapéutico. AGNPS de polidispersidad limitada puede encontrar otras aplicaciones inmediatas industriales y de investigación, debido a su mejorada catalítica, 27 optoelectrónico 28, 29 o SERS basados ​​en las propiedades de biosensores. 9,19,30,3131 Un estudio muy reciente realizado por Lander et al. 32 mostraron que las micro y membranas de ultrafiltración hechas de cinco diferentes materiales poliméricos (polisulfona, polietersulfona, nylon, acetato de celulosa, y fluoruro de polivinilideno) puede ser aplicado con éxito para la selección de tamaño de nanopartículas funcionalizadas. Estas NPs de 2-10 nm de diámetro tenía Ag, Au o Ti O 2 núcleos y fueron funcionalizados con recubrimientos de polímeros orgánicos que llevaron apositivas o negativas cargas superficiales. Tanto los núcleos y la funcionalidad de la superficie de las nanopartículas se encontró que desempeñan un papel importante en la retención de NP o paso a través de las membranas (0,2 nm a 0,22 micras). Como era de esperar, los NPs de carga positiva se rechazaron completamente (> 99%) por las membranas de carga negativa que tenían 20-veces mayor tamaño de poro que los diámetros de NP. A partir de estos experimentos, uno se entera de que el mecanismo de interacción debe ser cuidadosamente considerado en futuros estudios con nanopartículas funcionalizadas.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Los fondos de la Fundación Nacional de Ciencia a través de la NUE en Ingeniería y los Programas LEADER Consorcio se agradece.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silver nitrate (AgNO3) Acros Organics Inc. CAS: 7761-88-8
Sodium borohydride (NaBH4) Acros Organics Inc. CAS: 16940-66-2
Nitric acid (HNO3, Optima) Fisher Scientific Inc. A467-1 Trace metal grade for ICP analysis
10,000 μg ml-1 silver standard, EnviroConcentrate Ultra Scientific US-IAA-047
KrosFlo Research IIi Tangential Flow Filtration System Spectrum Laboratories Inc. SYR2-U20-01N
0.05 μm PS (0.5 mm) 460 cm2 Spectrum Laboratories Inc. X30S-900-02N
Midi 100 kD PS 200 cm2 Spectrum Laboratories Inc. X3-100S-901-02N
Micro100 kD PS 20 cm2 Spectrum Laboratories Inc. X1AB-300-10N
MasterFlex C-Flex tubing L/S Size 17 Cole-Palmer Instrument Co. 06424-17
MasterFlex C-Flex tubing L/S Size 14 Cole-Palmer Instrument Co. 06424-14
Cary 50 UV-VIS-NIR spectrophotometer Varian Inc.
LabRam HR 800 system Horiba Jobin Yvon Inc.
Varian 710ES ICP-–S Varian Inc.

Table 1. Specific reagents and equipment.

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