Summary
Tangentiële stroming ultrafiltratie (TFU) is een recirculatie methode voor het gewicht gebaseerde scheiding van biosamples. TFU werd aangepast op maat-select (1-20 nm diameter) en zeer geconcentreerd een grote hoeveelheid polydisperse zilveren nanodeeltjes (4 L van 15,2 ug ml
Abstract
Tegenwoordig worden AgNPs veel gebruikt in de vervaardiging van consumentenproducten, 1 water ontsmettingsmiddelen, 2 therapeutica, 1, 3 en biomedische apparaten 4 als gevolg van hun krachtige antimicrobiële eigenschappen. Drie-zes Deze nanodeeltjes toepassingen worden sterk beïnvloed door de AgNP grootte en aggregatietoestand . Vele problemen bestaan in de gecontroleerde vervaardiging 7 en grootte gebaseerde isolatie van 4,8 gefunctionaliseerde homogene AgNPs die vrij zijn van agressieve aftopping / stabilisatoren of organische oplosmiddelen. 7-13 beperkingen voortvloeien uit de toxiciteit van reagentia, hoge kosten of verlaagd efficiency van de AgNP synthese of isolatiemethoden (bijvoorbeeld centrifugatie, grootte-afhankelijke oplosbaarheid, size-exclusion chromatografie, enz.). 10,14-18 Daarom maken we recent aangetoond dat TFU meer controle over de grootte, de concentratie en maakt aggregatietoestand van Creighton AgNPs (300ml van 15,3 ug ml-1 tot 10 ml van 198,7 ug ml-1) dan met conventionele methoden van isolatie zoals ultracentrifugatie 19.
TFU is een recirculatie gebruikelijke methode voor het gewicht gebaseerde isoleren van eiwitten, virussen en cellen. 20,21 kort het vloeibare monster wordt door een reeks van holle vezelmembranen met poriegrootte tussen 1.000 kD tot 10 kD. Kleinere gesuspendeerd of opgelost in het monster samen door het poreuze barrière met het oplosmiddel (filtraat), terwijl de grotere bestanddelen behouden (retentaat). TFU kan worden beschouwd als een "groen"-methode omdat het geen schade toebrengt aan het monster, noch vereist extra oplosmiddel aan giftige overtollige reagentia en bijproducten te elimineren. Bovendien kan TFU worden toegepast op een grote verscheidenheid van nanodeeltjes als zowel hydrofobe als hydrofiele filters zijn.
De twee belangrijkste doelstellingen van dit onderzoek waren: 1) om te illustrerende experimentele aspecten van de TFU aanpak door middel van een uitnodiging video-ervaring en 2) om de haalbaarheid van de TFU methode voor grotere volumes van colloïdale nanodeeltjes en kleinere hoeveelheden retentaat aan te tonen. Eerste unfuctionalized AgNPs (4 L, 15,2 ug ml-1) werden gesynthetiseerd met behulp van gevestigde methode Creighton 22,23 door reductie van AgNO 3 met NaBH4. AgNP polydispersiteit werd geminimaliseerd via een 3-traps TFU met een 50 nm-filter (460 cm 2) en AgNPs AgNP-aggregaten groter dan 50 nm, gevolgd door twee 100-kD (200 cm 2 en 20 cm 2) filters verwijderen de AgNPs concentreren. Representatieve monsters werden gekarakteriseerd met transmissie-elektronenmicroscopie, UV-Vis absorptiespectrofotometrie, Raman spectroscopie, en inductief gekoppeld plasma optische emissie spectroscopie. De uiteindelijke retentaat bestond uit sterk geconcentreerde (4 ml, 8,539.9 ug ml -1) nog laag geaggregeerde en homogeneAgNPs van 1-20 nm in diameter. Dit komt overeen met een zilverconcentratie opbrengst van ongeveer 62%.
Protocol
1. Synthese van Colloïdaal AgNPs
Het reactiemechanisme voor de Creighton methode (licht gewijzigd goedkope) 22 wordt in detail beschreven in het ondersteunende informatie referentie Pavel et.al samen met de ongewenste hydrolyse nevenreactie van NaBH4 bij kamertemperatuur of hoger 23.
- Reinig het glaswerk gedurende 12-24 uur in een 10% HNO3 bad, dan voor 4-12 uur in een 1,25 M NaOH in 40% ethanol bad en tenslotte autoclaaf. Glaswerk grondig worden gespoeld minste vijfmaal met ultrazuiver water (17 MQ of hoger) dan de zuur en base bad stappen.
- Bereid 300 ml van een 2 mM NaBH4 oplossing en 100 ml van een 1 mM oplossing AgNO 3 met geautoclaveerd water afgekoeld tot 10 ° C. De lagere temperaturen voorkomt de nevenreactie van NaBH4.
- Voeg 300 ml van 2 mM NaBH4 oplossing in een 500 ml Erlenmeyer reactiekolf containing een roerstaaf en Wikkel de kolf in aluminiumfolie om zilver oxidatie te voorkomen. Plaats de kolf in een ijsbad op een roerplaat en roer de oplossing bij 325 rpm gedurende 10 minuten.
- Prime een 25 ml buret door spoelen met een volledige kolom van ultrapuur water. Na priming, vul de buret met AgNO 3-oplossing en wrap met aluminiumfolie.
- In een donkere kamer, 50 ml 1 mM AgNO 3 oplossing met een snelheid van 1 druppel sec'1 de NaBH4 oplossing onder voortdurend roeren (Figuur 1A). Bedek het middendeel van de inrichting een "folie tent" blootstelling aan licht te minimaliseren tijdens de toevoeging AgNO 3. De AgNO 3 Daarnaast vergt 30-40 min.. Periodiek Vul het ijsbad.
- Na AgNO 3 toevoeging voltooid is, vult de ijsbad en blijf roeren de colloïdale oplossing voor een extra 45-50 min. De vorming van colloïdale AgNPs wordt door een kleurverandering van kleurlooseen goudgeel, die kenmerkend is voor de oppervlakte plasmon resonantie maximaal AgNPs (Figuur 1B).
- Als de reactie is voltooid, koel de colloïde. Colloïdale AgNP batches kan gecombineerd worden na een week wanneer de colloïdale bleef consistent, dwz dat de colloïdale oplossing niet samengevoegd en de batch werd gekenmerkt met UV-Vis absorptiespectrometrie en Raman spectroscopie mogelijke aggregatie of verontreinigingen identificeren.
2. Karakterisatie van colloïdale AgNPs
Een Cary 50 UV-VIS-NIR spectrofotometer (Varian Inc) en een LabRamHR 800 Raman systeem (Horiba Jobin Yvon, Inc) voorzien van een Olympus BX41 microscoop confocale Raman, werden gebruikt voor AgNP karakterisering. De Cary WinUV software, LabSpec v.5 en Origin 8,0 software werden gebruikt voor de gegevensverzameling en-analyse.
Opmerking: De overname parameters moeten worden geoptimaliseerd for andere instrumentatie modellen.
Bepaling van de Surface Plasmon Resonance van Colloïdaal AgNPs via UV-Vis spectrofotometrie
- Vul een 1 cm 3 wegwerp cuvet met Creighton colloïde en ultrapuur water in een 1:10 volumeverhouding. Vul een andere 1 cm 3 kuvet met ultrapuur water voor een lege basislijn correctie. Wrijf de buitenkant van beide cuvetten met een Kimwipe.
- Stel de spectrofotometer om absorptie van een mode Y minimum van -0,5 tot een Y maximaal 1,0. Stel de X scanvenster naar 2-800 nm en selecteer een snelle scansnelheid van 4.800 nm min -1 met een uitgangswaarde van correctie.
- Breng de cuvet gevuld met water, in het instrument en uitvoeren van een basislijn scan. Herhaal dit indien nodig tot een van nul basislijn besturing wordt bereikt.
- Vervang de blanco cuvet met het monster cuvette en initiëren een absorptie scan voor het verzamelen van de UV-Vis-absorptiespectrum van de colloïdale monster (Figuur 1C).
Zuiverheid Test van Colloïdaal AgNPs via Raman spectroscopie
Als gevolg van de beperking in de tijd van de video demonstratie (10-15 min video) en de beperkte ruimte van het protocol tekst (maximaal 3 bladzijden), zal deze experimentele sectie niet gefilmd.
- Stel het instrument parameter instellingen als volgt: excitatiebron (632,8 nm He-Ne), filter (geen filter, laser vermogen bij de steekproef ~ 17 mW), confocale gat (300 pm), spectrometer (730 cm -1), holografisch raster (600 bosjes / mm), objectief (50x lange werkafstand lucht objectief), de belichtingstijd (30 s), en de accumulatie cycli (5).
- Gebruik een schone pipet aan op een 2 ml kwarts cuvet met colloïden te vullen en voorzichtig steek de stekker. Gebruik een Kimwipe schoon te maken uit vingerafdrukken, vlekken of colloïd van het oppervlak van de cuvet. Aanzienlijk verlagen de microscoop podium. Selecteer de 50x objectief en plaats de cuvet op het podium.
- Stel scherp op het laser licht aan het AgNP colloïd direct onder de binnenwand van de cuvet met behulp van de video-modus van het instrument en de Olympus camera. Zet kamer verlichting en het verwerven van Raman spectrum (figuur 1D).
3. Grootte-selectie en concentratie van colloïdaal AgNPs via tangentiële stroming Ultrafiltratie (TFU)
Een KrosFlo II Research filtersysteem (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) werd gebruikt om de polydispersiteit AgNP perken en te (figuur 2) concentreren. De drie stappen van de werkwijze TFU waren: (1) Grootte-selectie AgNPs en AgNP-aggregaten van 50 nm in diameter en met een grotere 50 nm MidiKros polysulfon module (460 cm 2), 2) Grootte selectie en de concentratie van AgNPs van 1-20 nm in diameter met een 100-kD MidiKros filter (200 cm 2) en (3) Een volumevermindering behulp van een 100-kD MicroKros polysulfon filter (20 cm 2) (Figuur 3).
- Sluit de maat 17 MASTERFLEX voeden slang aan op de peristaltische pomp volgens 2A figuur. A Y-junctie en een buis knooppunt zullen zijn voor de set-up. Bevestig de slang aan de 50-nm MidiKros module. Zorg ervoor dat u slangen vast te filteren met behulp van kabelbinders. Selecteer slang maat 17 met behulp van toets SIZE.
- Selecteer linksom pomp richting met DIR-knop. Zorg ervoor dat de knop MODE op INT.
- Laat de pomp-tarief naar 300 ml min -1 voordat de pomp. Het pompvermogen worden aangepast aan de grootte van de gebruikte buis. Moet een kleine instelling mogelijk de operator onmiddellijk reageren op mogelijke lekken maar groot genoeg om nog een effect van priming het systeem. Om het vacuum nodig colloid trekken uit het reservoir in de buis en filter maken, snijden de leidingen die uit het onderste gedeelte van het filter tot het bovenste gedeelte van de Y-junctie in het midden van de buis.
- Zodra de vloeistof vrij kan stromen door de buis, zet de pomp, sluit het gebroken gedeelte van buis met een buis kruising en zet vast met kabelbinders. Druk nogmaals op de pomp en verder filtratie.
- Controleer de slangen circuit op lekkage. Als er een lek wordt gevonden, bevestigen het lek door het aanpassen van de inrichting of opnieuw vastzetten met een sluitstrip. Zodra het buissysteem lekvrij is, het pompdebiet kan op niet groter dan 700 ml min-1. Dit pompvermogen waarde moet worden geoptimaliseerd op basis van diameter pompslang buizen storing te voorkomen. Verder filtratie totdat de vloeistof in het reservoir fles leeg is om bijna niets.
- Zodra de filtratie voltooid, het eluaat dat bevat AgNPs van 50 nm diameter en smaller. Het retentaat kan worden opgeslagen voor verdere analyse volgens de specifieke toepassing AgNP.
Stap 2
- Spoel de slang met 2% HNO 3 en ultrapuur water voorafgaand aan de installatie van de 100-kD MidiKros filteren met behulp van dezelfde setup als voor de 50-nm-module.
- Herhaal stap 3.3 het gebruik van de 100-kD MidiKros module.
- Zodra de filtratie voltooid, verzamel de inhoud van de buis en het filter (100-kD retentaat). Het volume moet ongeveer 50 ml.
Stap 3
- Sluit de maat 14 MASTERFLEX buizen en de 100-kD MicroKros filter om de peristaltische pomp volgens 2B figuur. Zet alle kruispunten met kabelbinders. Selecteer slang maat 14 op de pomp met behulp van de toets SIZE en laat de pomp die tot 30 ml min -1.
- Begin het filtratieproces. Controleer de slangen circuit op lekkage. Als er een lek wordt gevonden, bevestigen het lek door het aanpassen van de pasvormting of opnieuw vastzetten met een sluitstrip.
- Zodra het buissysteem lekvrij is, kan het pompdebiet verhoogd tot niet groter dan 90 ml min-1. Verder filtratie totdat de resterende vloeistof in het reservoir fles bevat een minimale hoeveelheid concentraat.
- De resterende inhoud van de buis en het filter kan worden verzameld in het reservoir fles door het verwijderen van de sonde uit de fles terwijl de pomp nog loopt. Zodra de buis en filter inhoud in het reservoir fles, kan de pomp worden uitgeschakeld.
4. Kwantificering van Silver Bedrag van colloïden AgNPs door inductief gekoppelde plasma optische emissie spectroscopie (ICP-OES)
Elk monster werd colloïdale chemisch ontsloten en de hoeveelheid zilver werd gekwantificeerd door ICP-OES een A 710E spectrometer (Varian Inc.) Een lineaire regressie kalibratiecurve voor zilver (fig. 4) werd geconstrueerd met acht zilveren standaarden (0, 3, 7, 10, 15, 25, 50 en 100 ug L -1), die werden bereid uit een 10.000 ug ml-1 zilver standaard sporenmetalen analyse (Ultra Scientific).
- Chemisch verteren monsters met behulp van HNO 3. De representatieve monsters de originele colloïde (stap 1), 50 nm filtraat (stap 1), 100-kD retentaat (stap 2) en final 100 kD retentaat (stap 3) (figuur 3).
- De monsters worden verdund met 2% HNO 3 met de volgende volumeverhoudingen: 1:1000 voor de originele colloïd, 1:1000 voor de 50-nm filtraat, 1:25.000 voor de eerste 100-kD retentaat, en 1:250.000 voor de laatste 100-kD retentaat. Om zilver uitspoeling te voorkomen, worden alle monsters worden opgeslagen in een lage dichtheid polypropyleen containers.
- Stel de ICP-OES instrument parameters als volgt: golflengte voor Ag (328.068 nm), vermogen (1,20 kW), plasma flow (15,0 L min -1), extra stroom (1,50 L min -1), en vernevelaar druk (200 kPa ).
- Elke sample worden in drievoud gemeten met een kopie van 10 s. Tussen meting stabilisatietijd van 15 sec en 30 sec sample opname vertraging worden gebruikt. Werkwijze blanco worden ingevoerd tussen elke sample om mogelijke kruisbesmetting te verminderen.
5. Grootteverdeling van Colloïdaal AgNPs via Transmissie Elektronen Microscopie (TEM)
Een Phillips EM 208S TEM werd gebruikt om de colloïdale AgNPs visualiseren. Electronenmicroscoop werden gevangen met behulp van een hoge resolutie Gatan Bioscan camera en geanalyseerd in ImageJ software. 24
- Verdun het 100-kD retentaat monster met ultrazuiver water (1:100 volumeverhouding). Borg 20 ui van het oorspronkelijke colloïde en het verdunde retentaat 100 kD (stap 3) op 300-mesh formvar-gecoate goud roosters (Electron Microscopy Sciences). Laat de roosters te drogen in een exsiccator. Binnen een dag.
- Stel het versnellen potentieel van de TEM instrument bij 70 kV op AgNPs visualiseren. CApture electronenmicroscoop (figuur 5) met behulp van de camera met hoge resolutie en opslaan als tagged image bestanden formaat (tiff).
6. Representatieve resultaten
Synthese en karakterisatie van colloïdale AgNPs
Vier liter Creighton colloïdale AgNPs met succes gesynthetiseerd met de setup weergegeven in figuur 1A. De uiteindelijke colloïde een karakteristieke goudgele kleur (Figuur 1B). 22, 23 De UV-Vis-absorptiespectrum van deze colloïdale een typische scherpe, symmetrische piek oppervlakteplasmonresonantie (SPR) had bij 394 nm (Figuur 1C). De Raman spectrum van het oorspronkelijke Creighton colloïde en de laatste 100-kD retentaat ingediend drie trillingsmodes, namelijk het buigen (1640 cm -1) en symmetrische en asymmetrische strekmodus H 2 O (3245 cm -1 en 3390 cm -1 , respectievelijk) (Figuur 1D). </ P>
TFU van Colloïdaal AgNPs
De setup TFU en het schema van het 3-staps proces TFU afgebeeld in figuren 2 en 3 respectievelijk. In stap 1 wordt een 50 nm filter (460 cm 2) werd gebruikt om op grootte selecteren en AgNPs en AgNP-aggregaten te verwijderen van 50 nm en grotere diameter van de oorspronkelijke colloïde (ongeveer 100 ml van 50 nm retentaat). Deze stap werd met een klein volume reductie van 4 liter oorspronkelijke colloïde tot 3,9 L van 50 nm filtraat. Geen terugspoelen of de stroom onderbreking stap werd gebruikt. Het grootste volume reductie (bijvoorbeeld verwijdering van water) verkregen in stap 2, wanneer de 50 nm filtraat werd vervolgens geleid door een 100-kD filter (200 cm 2). De resulterende 100 kD retentaat was een totaal volume van 50 ml. De meeste bijproducten synthese en overmaat reagentia werden geëlimineerd in deze stap door het water oplosmiddel (3,850 ml van 100 kD filtraat). Verder werd AgNP concentratie bereikt door addition van een derde filtratiestap de eerder beschreven procedure. 19 In deze stap 3 is een 100-kD filter van een kleiner oppervlak (20 cm 2) verminderde de 100-kD retentaatvolume tot 4,0 ml. De TEM metingen tonen dat deze laatste 100 kD retentaat bestaat hoofdzakelijk uit laag geaggregeerde AgNPs van 1-20 nm in diameter.
ICP-OES en TEM van Colloïdaal AgNPs
Een lineaire regressie kalibratiecurve (Fig. 4) voor zilver is opgebouwd uit acht normen (0, 3, 7, 10, 15, 25, 50 en 100 ug L -1). De hoeveelheid zilver in elk van de vier representatieve monsters colloïdale werd vervolgens bepaald uit de ICP-OES kalibratiecurve door extrapolatie: original colloid (15,2 ppm, Figuur 3A), 50 nm filtraat (14,1 ppm, Figuur 3B), eerste 100 - kD retentaat (683,1 ppm, figuur 3C) en laatste 100-kD retentaat (8,538.9 ppm, Figuur 3D).De werkelijke opbrengst van 15,2 ppm ligt zeer dicht bij de typische theoretische opbrengst van 15,4 ppm voor de Creighton reactie. De extreme concentratie van AgNPs (4 ml van 8,538.9 ppm) werd weerspiegeld door een dramatische verandering in de kleur van goudgeel voor de originele colloïd tot donkerbruin voor de laatste 100-kD retentaat (figuur 3, inlegwerk van flacon foto's). De kwaliteit van de filters bleek essentieel voor het TFU proces, met name naar stap 1. De uiteindelijke retentaat concentraties varieerden van 3,390.1 9,333.3 ppm ppm tot afhankelijk van de toestand van de filters (veelgebruikte versus nieuw). Indien het membraan poriën worden gecompromitteerd, dat AgNPs diameters minder dan 50 nm worden bewaard en vervolgens daling van de totale hoeveelheid AgNPs dat wordt verzameld in het filtraat. Optimalisatie van het filtratie proces drukbewaking omvatten adequate reiniging kan de levensduur van de filters.
Representatieve TEM microfoto van de originele Creighton colloïde en de laatste 100-kD retentaat (stap 3) worden getoond in Figuur 5A en 5C respectievelijk. In hun geaggregeerde toestand, AgNPs verschijnen als zwarte ronde gebieden op een lichtere grijze achtergrond. Ongeveer 800 AgNPs werden in de TEM microfoto's van elk van de twee monsters en werden geanalyseerd met de Image J software. Een deeltje is gedefinieerd door een volledige en gesloten omtrek. Een gebied drempelwaarde werd ingesteld op 1,0 nm 2 volgens de resolutie van de TEM microfoto. De AgNP telt en omgeving gegevens werden vervolgens geëxporteerd naar Microsoft Excel en de AgNP diameters werden geëxtrapoleerd. De gemiddelde diameter AgNP in de oorspronkelijke colloïde en de laatste 100-kD retentaat werden bepaald op 9,3 nm en 11,1 nm. De diameter metingen van de AgNPs werden vervolgens geëxporteerd naar Origin 8,0 software en een TEM grootte histogram werd gebouwd voor elk monster (Figuur 5B en 5D).
1 "src =" / files/ftp_upload/4167/4167fig1.jpg "/>
Figuur 1. A) Bereiding setup, B) kleur, C) UV-Vis-absorptiespectrum en D) Raman spectrum van Creighton colloïdale AgNPs.
Figuur 2 TFU experimentele opstelling voor A) de stappen 1 en 2:. I) Reservoir met Creighton colloïdale AgNPs. II) Reservoir voor filtraat collectie. III) Y-splitsing in buizen. IV) Slangenpomp hoofd. . V) Ofwel 50-nm of 100-kD Midi Kros filter B) stap 3: I) Reservoir met Creighton colloïdale AgNPs. II) Reservoir voor filtraat collectie. III) 100-kD Micro Kros filter.
Figuur 3. Stroomschema beeltenis van de TFU-proces. De blauw gearceerde boxen geven de colloïdale suspensies van AgNPs verzameld voor verdere analyse. Vial photographs toon A) Original colloid batch, B) 50-nm filtraten na verwerking van de oorspronkelijke colloïde via de 50 nm filter (460 cm 2), C) eerste 100-kD retentaat verkregen na volumevermindering de 100-kD Midi Kros filter (200 cm 2), en D) final 100 kD retentaat gevolg van de volumereductie de 100-kD Micro Kros filter (20 cm 2). De 100-kD filtraat op water lijkt.
Figuur 4 ICP-OES lineaire kalibratie geconstrueerd met acht zilveren normen:. 0, 3, 7, 10, 15, 25, 50 en 100 ug L -1.
Figuur 5. TEM microfoto van A) originele Creighton AgNPs en C) laatste 100-kD retentaat (schaal bar is100 nm). TEM size histogrammen geconstrueerd door analyse ongeveer 800 AgNPs B) originele Creighton AgNPs en D) final 100 kD retentaat. De inzet in Figuur 5B toont de uitgebreide 41-75 nm formaat bereik voor vergelijkingsdoeleinden. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
UV-Vis absorptie spectrofotometrie en Raman Spectroscopie van Colloïdaal AgNPs
Het is bekend dat het aantal oppervlakplasmaresonantie pieken in het absorptiespectrum van een colloïde afneemt als de symmetrie van de AgNPs toeneemt. Bovendien AgNP aggregatie leidt tot het verschijnen van breder of rood-verschoven pieken. 25,26 De aanwezigheid van een enkele scherpe symmetrische piek bij SPR 394 nm indicatief is voor kleine, bolvormige AgNPs van matige aggregatie en grootteverdeling.
De zuiverheid van de colloïdale monsters voor en na ultrafiltratie werd aangetoond door de Raman spectra van de oorspronkelijke Creighton colloïde en de laatste 100-kD retentaat, dat slechts drie trillingsmodes kenmerkend voor H 2 O. vertoonden De Raman-signaal in verband met organische verontreinigingen of ultrafiltratie verontreinigingen van grote Raman doorsneden zou worden vergroot door de directe nabijheid van de AgNPoppervlak (de zogenaamde oppervlakte versterkte Raman spectroscopie (SERS) effect).
ICP-OES en TEM van geültrafiltreerde Colloïdaal AgNPs
De toevoeging van een derde, 100 kD filtratiestap de eerder gerapporteerde TFU procedure 19 vergemakkelijkt de succesvolle vermindering van een groter volume Creighton colloïdale AgNPs (4L batch van 15,2 ppm) in een 1.000-voudig kleiner volume retentaat (4 ml 8,538.9 ppm). Dit komt overeen met een concentratie TFU opbrengst van ongeveer 62% met inachtneming van de hoeveelheid AgNPs en AgNP-aggregaten van 50 nm diameter en groter dan verwijderd. De mate van concentratie is opmerkelijk omdat de laatste 100-kD retentaat vooral bestond uit monodisperse AgNPs die waren 1-20 nm in diameter en vrij van overtollig reagentia en bijproducten. De derde, 100 kD filtratiestap verbeterd de concentratie opbrengst van 45% 20 tot 62%. Verdere TFU verbeteringen in de grootte-selectie en concentratie van AgNPskunnen worden verkregen door gebruik te maken van extra hollevezelmembranen. Filters met een poriëngrootte variërend van 1.000 kD tot 10 kD en oppervlak van 5,1 m 2 tot 8 cm 2 beschikbaar voor zowel hydrofobe als hydrofiele monsters. Buffer uitwisseling kan ook worden uitgevoerd tijdens TFU, afhankelijk verdere toepassingen. Wanneer de volumevermindering 800-voudig (wanneer een volume van 4 L tot minder dan 5 ml) overschrijdt, is er een afname van de stabiliteit en houdbaarheid van de colloïdale suspensie door de extreme mate van concentratie. De houdbaarheid van deze sterk geconcentreerde, gefunctionaliseerde AgNP ongeveer een tot twee weken bij 10 ° C. Terwijl onhandig, wordt deze beperking beheerd door middel van zorgvuldig onderzoek planning en voorbereiding. Deze extreme concentratie werd gewenst lopende nanotoxicity studies bij verschillende concentraties. Minder geconcentreerde partijen AgNPs verwacht betere stabiliteit en een langere houdbaarheid hebben.
(Figuur 5A en 5C) vertoonden een verhoogde frequentie van minimaal geaggregeerde AgNPs in de laatste 100-kD retentaat ten opzichte van de oorspronkelijke colloïde. De TEM omvang histogrammen van beide colloïdale monsters (Figuur 5B en 5D) verder bevestigd dat de polydispersiteit van de colloïdale Creighton AgNPs beperkt door TFU. Verdere polydispersiteit beperking kan worden bereikt door een aantal filtratiemembranen kleinere poriën. De diameters van de Creighton AgNPs varieerde van 1 nm tot 75 nm (figuur 5B en de inzet geeft de geëxpandeerde 41-75 nm grootte bins), terwijl de AgNPs en / of AgNP-aggregaten van 50 nm en groter (0,9% van percent totale AgNPs) waren afwezig in de TEM omvang histogram van de laatste 100-kD monster (Figuur 5D). De 100-kD retentaat werd meestal samengesteld AgNPs die diameters van 1-20 nm had, was er een kleine bijdrage (12,4%) van AgNPs in de 21-40 size bakken. Figuur 5B en 5D bevestigd dat de grootteverdeling trend werd bewaard voor het 100-kD retentaat tijdens het TFU proces met uitzondering van de 1-5 nm grootte. Er was een duidelijke afname in de frequentie van de kleinere AgNPs van 1-5 nm in diameter voor de 100-kD monster (van 33,2% naar 21,3%), wat werd toegeschreven aan passage AgNP door het membraan filter in het filtraat. Daardoor is de gemiddelde AgNP diameter nam toe van 9,3 nm voor de originele colloïd tot 11,1 nm voor de laatste 100-kD retentaat. Omdat ongeveer 800 AgNPs werden geanalyseerd op zowel colloïdale monsters werd de frequentie verlaagd kleinere AgNPs in de 1-5 nm (11,9%) en 6-10 nm (1,3%) maatbereik samen met een overeenkomstige toename in de frequentie van grotere AgNPs in de maat 11-25 nm bakken (dwz ongeveer 12,8% van de oorspronkelijke colloid het 100-kD retentaat).
Concluderend TFU bleek een efficiënte, "groene" methode voor de SiZE-selectie en concentratie van colloïdale AgNPs met minimale aggregatie op verschillende volume schalen. Het elimineren van het gebruik van chemisch agressieve reagentia of organische oplosmiddelen uit de AgNP synthese (voor een betere grootte, vorm, en aggregatie controle) aanzienlijk kan verminderen AgNP toxiciteit, terwijl het verbeteren van hun therapeutische index. AgNPs van beperkte polydispersiteit kan vinden andere onmiddellijke industriële en wetenschappelijke toepassingen vanwege hun verbeterde katalytische, 27 opto-elektronische 28, 29 of SERS gebaseerde biosensing eigenschappen. 9,19,30,3131 Een zeer recente studie van Lander et al.. 32 toonde aan dat micro- en ultrafiltratie membranen uit vijf verschillende polymere materialen (polysulfon, polyethersulfon, nylon, cellulose acetaat en polyvinylideenfluoride) succes kan worden uitgevoerd voor de grootte selectie van gefunctionaliseerde NPs. Deze NPs van 2-10 nm in diameter hadden Ag, Au of Ti 2 O kernen en werden gefunctionaliseerd met organische polymeer coatings die totpositief of negatief oppervlakteladingen. Zowel de kernen en het oppervlak functionaliteit van de NP bleken een belangrijke rol in de NP behoud of passage spelen door de membranen (0,2 nm tot 0,22 pm). Zoals verwacht zijn de positief geladen NPs te verwerpen (> 99%) door het negatief geladen membranen die 20-maal groter dan de poriegrootte NP diameters hebben. Uit deze experimenten, leert men dat de interactie mechanisme moet zorgvuldig worden overwogen in toekomstige studies met gefunctionaliseerde NP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De financiering van de National Science Foundation door de NUE in Engineering en het LEADER-Consortium Programma's wordt dankbaar erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver nitrate (AgNO3) | Acros Organics Inc. | CAS: 7761-88-8 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Acros Organics Inc. | CAS: 16940-66-2 | |
| Nitric acid (HNO3, Optima) | Fisher Scientific Inc. | A467-1 | Trace metal grade for ICP analysis |
| 10,000 μg ml-1 silver standard, EnviroConcentrate | Ultra Scientific | US-IAA-047 | |
| KrosFlo Research IIi Tangential Flow Filtration System | Spectrum Laboratories Inc. | SYR2-U20-01N | |
| 0.05 μm PS (0.5 mm) 460 cm2 | Spectrum Laboratories Inc. | X30S-900-02N | |
| Midi 100 kD PS 200 cm2 | Spectrum Laboratories Inc. | X3-100S-901-02N | |
| Micro100 kD PS 20 cm2 | Spectrum Laboratories Inc. | X1AB-300-10N | |
| MasterFlex C-Flex tubing L/S Size 17 | Cole-Palmer Instrument Co. | 06424-17 | |
| MasterFlex C-Flex tubing L/S Size 14 | Cole-Palmer Instrument Co. | 06424-14 | |
| Cary 50 UV-VIS-NIR spectrophotometer | Varian Inc. | ||
| LabRam HR 800 system | Horiba Jobin Yvon Inc. | ||
| Varian 710ES ICP-–S | Varian Inc. | ||
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- The Project on Emerging Nanotechnologies. , Available from: http://www.nanotechproject.org/inventories/consumer/analysis_draft (2011).
- Savage, N., Diallo, M. S. Nanomaterials and Water Purification: Opportunities and Challenges. Journal of Nanoparticle Research. 7, 331-342 (2005).
- Jain, J. Silver Nanoparticles in Therapeutics: Development of an Antimicrobial Gel Formulation for Topical Use. Mol. Pharmaceutics. 6, 1388-1401 (2009).
- Dal Lago, V., Franca, dO., de, A. G., Kobarg, J., Borba Cardoso, M. Size-selective silver nanoparticles: future of biomedical devices with enhanced bactericidal properties. J. Mater. Chem. 21, 12267-12273 (2011).
- Panacek, A. Silver Colloid Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Their Antibacterial Activity. J. Phys. Chem. B. 110, 16248-16253 (2006).
- Elechiguerra, J. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. Journal of Nanobiotechnology. 3, 6 (2005).
- Jana, N. R., Sau, T. K., Pal, T. Growing Small Silver Particle as Redox Catalyst. J. Phys. Chem. B. 103, 115-121 (1999).
- Tolaymat, T. M. An evidence-based environmental perspective of manufactured silver nanoparticle in syntheses and applications: A systematic review and critical appraisal of peer-reviewed scientific papers. Sci. Total Environ. 408, 999-1006 (2010).
- Willets, K. Surface-enhanced Raman scattering (SERS) for probing internal cellular structure and dynamics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394, 85-94 (2009).
- Novak, J. P., Nickerson, C., Franzen, S., Feldheim, D. L. Purification of Molecularly Bridged Metal Nanoparticle Arrays by Centrifugation and Size Exclusion Chromatography. Anal. Chem. 73, 5758-5761 (2001).
- Hossain, M. K., Kitahama, Y., Huang, G. G., Han, X., Ozaki, Y. Surface-enhanced Raman scattering: realization of localized surface plasmon resonance using unique substrates and methods. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394, 1747-1760 (2009).
- Henglein, A., Giersig, M. Formation of Colloidal Silver Nanoparticles: Capping Action of Citrate. J. Phys. Chem. B. 103, 9533-9539 (1999).
- Sapsford, K. E., Tyner, K. M., Dair, B. J., Deschamps, J. R., Medintz, I. L. Analyzing Nanomaterial Bioconjugates: A Review of Current and Emerging Purification and Characterization Techniques. Anal. Chem. 83, 4453-4488 (2011).
- Al-Somali, A., Krueger, K. M., Falkner, J. C., Colvin, V. L. Recycling Size Exclusion Chromatography for the Analysis and Separation of Nanocrystalline Gold. Anal. Chem. 76, 5903-5910 (2004).
- Hanauer, M., Pierrat, S., Zins, I., Lotz, A., Sonnichsen, C. Separation of Nanoparticles by Gel Electrophoresis According to Size and Shape. Nano Lett. 7, 2881-2885 (2007).
- Sweeney, S. F., Woehrle, G. H., Hutchison, J. E. Rapid Purification and Size Separation of Gold Nanoparticles via Diafiltration. J. Am. Chem. Soc. 128, 3190-3197 (2006).
- Clarke, N. Z., Waters, C., Johnson, K. A., Satherley, J., Schiffrin, D. J. Size-Dependent Solubility of Thiol-Derivatized Gold Nanoparticles in Supercritical Ethane. Langmuir. 17, 6048-6050 (2001).
- Schaaff, T. G. Isolation of Smaller Nanocrystal Au Molecules: Robust Quantum Effects in Optical Spectra. J Phys Chem B. 101, 7885-7891 (1997).
- Trefry, J. C. Size Selection and Concentration of Silver Nanoparticles by Tangential Flow Ultrafiltration for SERS-Based Biosensors. J. Am. Chem. Soc. 132, 10970-10972 (2010).
- Bhattacharjee, S., Bhattacharjee, C., Datta, S. Studies on the fractionation of & beta-lactoglobulin from casein whey using ultrafiltration and ion-exchange membrane chromatography. J. Membr. Sci. 275, 141-150 (2006).
- Eppler, A., Weigandt, M., Schulze, S., Hanefeld, A., Bunjes, H. Comparison of different protein concentration techniques within preformulation development. Int. J. Pharm. 421, 120-129 (2011).
- Creighton, J. A., Blatchford, C. G., Albrecht, M. G. Plasma resonance enhancement of Raman scattering by pyridine adsorbed on silver or gold sol particles of size comparable to the excitation wavelength. J. Chem. Soc. Faraday Trans. 2, 790-798 (1979).
- Pavel, I. E. Estimating the Analytical and Surface Enhancement Factors in Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS): A Novel Physical Chemistry and Nanotechnology Laboratory Experiment. J. Chem. Educ. , (2011).
- Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij (1997).
- Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment. J. Phys. Chem. B. 107, 668-677 (2003).
- Śileikaitċ, A., Prosyčevas, I., Puišo, J., Juraitis, A., Guobienċ, A. Analysis of Silver Nanoparticles Produced by Chemical Reduction of Silver Salt Solution. Mater. Sci. (Medziagotyra). 12, 287-291 (2006).
- Lewis, L. N. Chemical catalysis by colloids and clusters. Chem. Rev. 93, 2693-2730 (1993).
- Li, Y., Wu, Y., Ong, B. S. Facile Synthesis of Silver Nanoparticles Useful for Fabrication of High-Conductivity Elements for Printed Electronics. J. Am. Chem. Soc. 127, 3266-3267 (2005).
- Sun, Y., Xia, Y. Shape-Controlled Synthesis of Gold and Silver Nanoparticles. Science. 298, 2176-2179 (2002).
- Han, X., Zhao, B., Ozaki, Y. Surface-enhanced Raman scattering for protein detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394, 1719-1727 (2009).
- Pavel, I. Label-Free SERS Detection of Small Proteins Modified to Act as Bifunctional Linkers. J. Phys. Chem. C. 112, 4880-4883 (2008).
- Ladner, D. A., Steele, M., Weir, A., Hristovski, K., Westerhoff, P. Functionalized nanoparticle interactions with polymeric membranes. J. Hazard. Mater. , (2011).
