Summary
Wij rapporteren een efficiënte en eenvoudige methode om embryo's te isoleren in een vroeg stadium van de ontwikkeling van
Abstract
In bloeiende planten, het embryo zich ontwikkelt binnen een voedende weefsel - het endosperm - omringd door de moederlijke zaad integumenten (of zaadhuid). Als gevolg daarvan, is de isolatie van de plant embryo's in een vroeg stadium (1 cel tot bolvormige stadium) technisch uitdagende vanwege hun relatieve ontoegankelijkheid. Efficiënte handmatige dissectie in de aanloopfase wordt sterk belemmerd door de kleine omvang van jonge Arabidopsis zaden en de kleverigheid van het embryo aan het omringende weefsel. Hier beschrijven we een werkwijze die de efficiënte isolatie van jonge Arabidopsis embryo maakt, bevatten tot 40 embryo's in 1 uur tot 4 uur, afhankelijk van de stroomafwaartse toepassing. Embryo's worden uitgebracht in een isolement buffer met iets breken 250-750 zaden met een plastic stamper in een Eppendorf buis. Een glazen microcapillaire bevestigd aan ofwel een standaard laboratorium pipet (via een rubberen buis) of een hydraulisch gestuurde microinjector wordt gebruikt om embryo's te verzamelen van druppeltjes plaatsd op een multi-well slide op een omgekeerde lichtmicroscoop. De technische vaardigheden die nodig zijn eenvoudig en gemakkelijk overdraagbaar, en de basis-setup is dure apparatuur nodig. Verzamelde embryo's zijn geschikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals RT-PCR, RNA sequentie, DNA methylatie analyse, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), immunokleuring en reporter assays.
Introduction
De embryo van bloeiende planten wordt omgeven door het endosperm, een voedingsweefsel afgeleid van een tweede fertilisatiegebeurtenis. Zowel embryo en endosperm zijn omgeven door verschillende cellagen van de zaadhuid. Gezamenlijk vormen deze weefsels een zaad dat in de vrucht te ontwikkelen. Zo zijn weefsel-en cel-specifieke analyses van Arabidopsis embryo's sterk aangetast vanwege hun ontoegankelijkheid. Toch embryo's in de late-bolvormige of latere stadia zijn relatief goed vatbaar voor handmatige dissectie met behulp van fijne wolfraam naalden onder de stereomicroscoop, of door lichte druk op het zaad met behulp van een tang om ze te halen. Dergelijke technieken zijn met succes toegepast transcriptoom of epigenoom profilering analyses zoals microarray hybridisatie bisulfietsequencing of RNA sequentie (bijvoorbeeld 1-3). In tegenstelling, studies van embryo's in de zygote tot begin bolvormige stadium blijven technisch uitdagend. Tot op heden slechts een paar studies hebben reported transcriptoomanalyses op jonge embryo's met behulp van laser-capture microdissectie (LCM) van embryonale weefsels van vaste zaad hoofdstukken 4 of manuele extractie van individuele embryo vanuit zaden met behulp van fijne instrumenten 5. Echter, LCM apparatuur niet algemeen beschikbaar en handmatige extractie embryo in een vroeg stadium is tijdrovend en vereist uitstekende dissectie vaardigheden die niet makkelijk overdraagbaar. Naast genoom-brede analyses, in situ genexpressie analyses zijn ook moeilijk te voeren op jonge hele-mount embryo van Arabidopsis. Tot op zekere hoogte kunnen jonge embryo op objectglaasjes worden vrijgegeven door lichte druk op de zaden en gebruikt voor reporter assays of proteindetectie door immunokleuring (zie bijvoorbeeld 6,7). Deze techniek is echter niet mogelijk high-throughput embryo isolatie, waardoor kwantitatieve analyse belemmeren.
Daarom is een efficiënt en snel ontwikkeld protocolvoor vroege embryo isolatie van Arabidopsis zaden die is eenvoudig op te zetten, gemakkelijk overdraagbaar, en geschikt voor een verscheidenheid van downstream toepassingen. Het basisprincipe is om voorzichtig te verpletteren zaden - ontleed van jonge siliques in een Eppendorf buisje met een plastic stamper in een geschikte isolatie buffer. Het extract wordt in druppels op een multi-well glijbaan en gescreend op de aanwezigheid van vrijgekomen embryo's in de gewenste fase met behulp van een omgekeerde microscoop. Embryo's worden verzameld met behulp van een glazen microcapillaire bevestigd aan een microinjector of een standaard laboratorium pipet. Voor moleculaire toepassingen, worden embryo's tweemaal gewassen door herhaalde introductie in druppels van nieuwe isolatie buffer voor het overzetten naar de bestemming buffer in een minimaal volume. Voor cytologische toepassingen (reporter assays, immunokleuring, FISH), kunnen wasstappen worden weggelaten.
De methode biedt verschillende voordelen: (i) het levert 25-40 embryo ~ 45 min voor cytologische appcaties of 3-4 uur gedurende moleculaire toepassingen (waaronder de wasstappen), (ii) het mogelijk isoleren van specifieke embryonale stadia, (iii) het kan gemakkelijk worden overgedragen aan andere personen laboratoria vanwege de eenvoudige installatie, (iv) vereist betaalbaar Voorzieningen voor basale configuratie die vatbaar is voor upgrades, en (v) werd met succes gebruikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals RNA sequencing 8, genspecifieke DNA-methylatie analyse 9 reporter assays (10 en Raissig et al.., in prep.) en VIS (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux ongepubliceerde, zie figuur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedure wordt samengevat in het in figuur 1 getoonde stroomdiagram. De microcapillairen en instrumentele instellingen worden getoond in Figuur 2 en Figuur 3, en typische stappen embryo isolement getoond in figuur 4.
1. Materiaal en Buffer Voorbereiding
1.1 Silicon coating van glas microcapillairen
- Plaats de microcapillairen in een 15 ml Falcon buis met ~ 5 ml Sigmacote (Sigma) en zwenken meerdere malen.
- Verwijder de oplossing, plaats de Falcon buis met de capillairen in een aluminiumfolie en bak ze gedurende 3 uur bij 60 ° C. Bewaar bij kamertemperatuur.
1.2 Verkrijgen ~ 50-100 micrometer diameter microcapillaire tips
- Pull 1 mm diameter glazen capillairen handmatig over een bunsenbrander of met behulp van een commerciële trekker (verticale filament puller of micropipet trekker).
- Gebruik een diamant-tip pen of mes aan de punt van de getrokken capillaire gesneden om de gewenste opening te creëren. Selecteer de beste-vormige capillairen onder een stereomicroscoop. De opening moet 50-100 urn (figuur 2).
1.3 Slide voorbereiding
- Siliconize schoon dia's door die alle de putten met Sigmacote (~ 1 ml / glijbaan) gedurende 5 minuten, te verwijderen. Bak 3 uur in aluminiumfolie. Bewaar bij kamertemperatuur.
- Was de multi-well glazen microscoopglaasjes gedurende 10 min in 10% SDS, 2 x 2 min in nuclease-vrij water (geautoclaveerd DEPC-DDH 2 O), 2 min in 70% ethanol, 2 minuten in 100% ethanol, lucht- drogen. Alle stappen worden gedaan in geautoclaveerde Coplin potten. Slides kunnen worden hergebruikt meerdere keren verschaffen grondige reiniging tussen elk gebruik.
- Vlak voor embryo isolatie verspreid ~ 0,5 ui 10 mg / ml runderserumalbumine (BSA) met een pipet over het gehele oppervlak van elk putje en drogen.
1.4 Microscoop en capillaire setup
<ol>1.5 Buffers
Tabel 1 geeft de isolatie en de bestemming buffers afhankelijk van de downstream-toepassingen.
- Bereid ~ 1 ml isolatie buffer per monster vers vóór gebruik en bewaar deze op ijs.
- Bereid de bestemming buffer in een 0,5 ml Eppendorf buis met lage bindingsaffiniteit op ijs (moleculaire toepassingen) of op een objectglaasje (cytologische toepassingen) in een vochtige kamer.
2. Zaad Dissection en Embryo Extraction
2.1 Synchronisatie van Seed Development
- Ontmannen bloemen en houd ze 2 dagen in de groei kamer terwijl het vermijden van contact van de blootgestelde stampers met andere bloemen, dan bestuiven ze (bijv. 11).
- Test de fase van ontwikkeling onder je groeiomstandigheden door microscopisch onderzoek van gewist zaden. Met onze groei-omstandigheden (16 uur licht bij 21 ° C, 8 uur donker bij 18 ° C en 70% luchtvochtigheid) zaden verzameld 2,5 dagen na bestuiving (DAP) leverde voornamelijk 2-4 cel embryo's en zaden verzameld 3,5-4 DAP leverde bolvormige embryo.
2.2 Seed Dissection en Rupture
- Verwijder de sBehoeften 10-15 siliques (~ 2.5 DAP) onder een stereomicroscoop met een pincet en insuline naalden.
- Dompel de zaden in 20 gl isolatiebuffer in een 2 ml rondbodem Eppendorf buisje geplaatst op ijs.
- Voorzichtig verpletteren de zaden met een plastic stamper (vooraf gereinigd met 10% SDS, gespoeld met DEPC-DDH 2 O en gewassen met 70% ethanol) aan de embryo los wanneer het extract troebel. De kracht van toepassing is moet worden vastgesteld door elke gebruiker op proef.
- Spoel de stamper met 300 ul van isolatie buffer om de stamper te wassen en verdun het monster.
- Spin-down het extract bij 5000 xg gedurende 5 sec. Voorzichtig resuspendeer de pellet extract door pipetteren up-en-down 2-3 keer.
- Filtreer het extract met een 30 um nylon (gemonteerd op buis adapters, bv van PartecCelltricks). Spoel het gaas met een extra 200 ul isolatie buffer.
3. Embryo Isolatie
3.1 Slide voorbereiding
- <li> Plaats een schone, BSA-gecoate en gesiliconiseerde multi-well glijbaan op het podium van de omgekeerde microscoop, resuspendeer het gefilterde extract van de zaden door pipetteren zachtjes op en neer en pipet 2 druppels van 40-50 ul extract van de zaden in 1 of 2 waterputten . Screening slechts 1 of 2 druppels per keer voorkomt verdamping van het monster.
- Breng 50 pl vers isolatiebuffer (1 st wash druppel) in een putje van een andere dia bereid zoals voorheen. Bewaar deze dia in een overdekte, vochtige kamer om verdamping te voorkomen.
3.2 Scherm, schoon, verzamelen
- Screenen de druppeltjes extract van embryo's in het gewenste stadium met de 10x vergroting doelstelling. Indien nodig, bevestig het podium met de 20x vergroting. De embryo meestal naar de bodem van de schuif.
- Handmatig verwijderen van rommel rond het embryo met een wolfraam naald, een insuline naald of soortgelijke apparatuur.
- Verplaats de glazen capillaire nabij het embryo met behulp van de micromanipulator, take het embryo met zo weinig mogelijke oplossing.
- Verzamel een aantal embryo's (bv. al een druppel) en laat ze in de 1 e wassen druppel (moleculaire toepassing) of in de bestemming buffer (cytologische toepassingen). Elke verzameling ronde moet binnen 5-10 minuten en embryo's worden bewaard in een minimaal volume (het totale volume van alle verzamelen ronden moet <5 ul be) worden verzameld.
- Herhaal de screening en ophalen tot de gewenste hoeveelheid embryo wordt verzameld in de 1e wash druppel (centrale, indien mogelijk, herinnering vergemakkelijken).
- Herinneren alle embryo's in een keer uit het wassen druppel (als puin worden overgedragen, verwijder ze dan met een naald vóór herinnering).
- Laat de embryo's in een 2 e wassen daling van 50 pl. Herhalen 3.2.6.
- Laat de embryo's in de bestemming buffer. De overdracht mag slechts betrekking hebben op een contact, en niet onderdompeling, van de capillaire tip.
- Vervang de microcapilLary voor het volgende monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze embryo isolatieprocedure (figuur 1) maakt isolatie van maximaal 40 embryo's in 4 uur als wassingen worden uitgevoerd, bijvoorbeeld voor moleculaire toepassingen, of in minder dan een uur als wast zijn weggelaten, bijvoorbeeld voor cytologische toepassingen. Figuur 2 toont hoge en lage kwaliteit microcapillaire tips en Figuur 3 de inrichting van de embryo isolatie machine. Figuur 4 toont het proces van embryo isolatie op het omgekeerde microscoop.
Wij hebben met succes onze procedure toegepast voor diverse toepassingen gepubliceerd in diverse recente artikelen. De methode is oorspronkelijk ontwikkeld om de ouderbijdrage aan de vroege embryonale transcriptome analyseren. Hybride embryo's gegenereerd door middel van kruisingen tussen twee verschillende Arabidopsis toetredingen (Landsberg erecta (L er) en Columbia (Col-0)) werden geïsoleerd in de 2-4 cel stadium. Totaal RNA werd geëxtraheerd, cDNAbibliotheken werden geproduceerd met behulp van lineaire versterking en gesequenced op een solide platform. Het allel-specifieke transcriptomes werden gegenereerd op basis van SNP analyse 8. Om onze embryonale cDNA-bibliotheken te controleren voorafgaand aan de sequencing we versterkt embryo-specifieke transcripten, Wuschel-homeobox 2, 8 en 9 (WOX2, WOX8, WOX9) en ACTIN 11 (13,14, figuur 5A).
Bovendien is deze methode aan jonge embryo isoleren de embryonale DNA-methylatie te analyseren op specifieke loci in het genoom. Embryo's werden geïsoleerd en met 1 x TE-buffer gewassen. Kleinschalig bisulfiet sequencing werd uitgevoerd zoals beschreven 9,15.
Evenzo heeft embryo isolatie zeer nuttig gebleken in reportergen assays met lage embryonale meningsuiting, en waar de moederlijke zaadhuid verwart detectie of wordt gemaskeerd door reporter expressie in weefsels rond het embryo (endosperm, zaadhuid). Embryo's carr ying de verslaggever transgen zijn gekleurd (ß-glucuronidase, GUS) of direct geanalyseerd (Groen of Rood Fluorescent Protein, GFP, RFP) na isolatie. Een voorbeeld wordt gegeven in figuur 5B embryowasvloeistof expressie brengen van een GUS-reportergen onder controle van de promoter MEDEA (p MEA) 10. De relatief gemak waarmee veel embryo's kunnen worden geïsoleerd maakt het ook mogelijk voor kwantitatieve analyses (bv. aantal embryo's gekleurd in verschillende genetische achtergronden, Raissig, Grossniklaus et al.. In voorbereiding).
Tot slot hebben we met succes toegepast Fluorescent in situ hybridisatie (FISH) en immunokleuring technieken om de nucleaire architectuur in geïsoleerde embryo ingebed in acrylamide pads op dia's te bestuderen. Een voorbeeld van FISH met probes tegen centromeer herhalingen en nucleoli organiseren regio wordt getoond in figuur 5C.
1 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1.jpg "/>
Figuur 1. Stroomschema van het embryo isolatieprocedure Het protocol is verdeeld in drie delen: 1 - Materiaal voorbereiding; 2 - Zaad dissectie; 3 - Embryo isolement..
Figuur 2. Microcapillaire tips. A. Hoogwaardige microcapillaire tips met een goede opening van ongeveer 100 micrometer. B. Low-kwaliteit microcapillaire tips met grotere opening en onregelmatige contour (die tips zijn acceptabel voor slechts cytologische toepassingen). Schaalbalk: 2 mm.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig3.jpg "/>
Figuur 3. Het opzetten van het embryo isolement microscoop. A. en B. Screening wordt uitgevoerd op objectglaasjes onder een omgekeerde microscoop. Embryo's worden verzameld met een glazen microcapillair bevestigd op een micromanipulator om de positie nauwkeurig te regelen (zie ook figuur 4) en aangesloten op een microinjector (A) of standaard laboratoriumpipet (B). A. De glazen microcapillair wordt gelinkt aan een hydraulisch gestuurde microinjector (bijv. Eppendorf Cell Tram Vario) voor een nauwkeurige controle tijdens het embryo B. Het glas microcapillaire is een standaard P-200 pipet via een rubber flex buis bevestigd. Embryoteams en afgifte wordt gecontroleerd door het draaien van de calibratie wiel van de pipet. Cut-end pipet tips worden gebruikt als connectoren en de kruispunten worden afgedicht met parafilm. Het microcapillary wordt vastgesteld op de micromanipulator via polystyreen blokken, Falcon buizen en tape.
Figuur 4. Embryo isolatie proces. A. Een 2-4 cel embryo (pijl) werd geïdentificeerd in het extract (screening druppel) en wordt omringd door puin (zaadhuid fragmenten). B. De omliggende puin werd handmatig verwijderd met behulp van een naald. C. De glazen capillair werd verplaatst naast het embryo (pijl). D. Het embryo werd verzameld en is nu binnen het capillair (pijl). E. Verschillende embryo's in de laatste druppel na wasbeurten. Schaal = 50 urn.
F igure 5. Downstream toepassingen van embryo isolatie A. Genexpressie analyse:. PCR-amplificatie van WOX9, WOX2, WOX8 en ACTIN11 13,14 op cDNA-bibliotheken (gegenereerd zoals beschreven 8) 2-4 cel embryo's gewassen 1x keer (1 rijstrook) en op genomische . DNA (2 baans) B. Verslaggever test: Een 8-cell embryo geïsoleerd uit planten dragen ap MEA :: GUS construct werd gekleurd op een dia in een standaard GUS kleuring oplossing (overgenomen uit Raissig et al., 2011 na toestemming van de. Plant Cell, ASPB auteursrecht). C. Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH): een 8-cel embryo gehybridiseerd met probes tegen centromeer herhalingen (rood) en 45S rDNA herhalingen (groen) voor indirecte immunodetectie 16. De dual-color FISH beelden werden bedekt met de DAPI tegenkleuring en DIC beelden (DM6000B epifluorescentiemicroscoop, Leica, Duitsland).
| Toepassing | Isolatiebuffer | Doelbuffer |
| RNA-extractie (bv. voor versterking en transcriptomics) | 1x First-Strand buffer (Invitrogen), 1 mM DTT, 4% RNAseOUT | RNA extractiebuffer |
| DNA-extractie (bijv. voor bisulfiet sequencing) | 100 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 (TE) | DNA-extractie buffer of 1x TE buffer |
| GFP reporter analyse | 1 M glycine in 0,5 x MS 1 | 1 M glycine in 0,5 x MS |
| GUS-analyse | vlekken buffer 2 zonder X-Gluc (substraat) | buffer kleuring met X-Gluc (substraat) |
| FISH & Immunokleuring | 100 mM fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) | geactiveerd Acryl: Bisacryl mix (33:3) op een Superfrost Plus dia-polymeriseren gedurende 30 min |
Tabel 1. Isolatie en bestemming buffers voor verschillende stroomafwaartse toepassingen. Buffers kunnen worden aangepast aan de specifieke experimentele voorwaarden. 1 Murashig & Skoog-medium. Bijvoorbeeld 2 Jefferson et al.., EMBO J. 6 (13), 3901-3907 (1987).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We ontwikkelden een embryo isolatieprotocol dat snel doeltreffende en kan gemakkelijk worden overgedragen naar andere laboratoria.
De hier beschreven apparatuur bestaat uit een omgekeerde microscoop, een micromanipulator, glas microcapillairen, een verticale gloeidraad trekker en een microinjector (figuur 3A). De opstelling is vergelijkbaar met die beschreven voor de enkele dierlijke cel isolement transcriptomics analyses 17. We hebben ook met succes gewerkt met een meer fundamentele setup waar glas microcapillairen handmatig werden gespannen over een vlam (en gesneden met een diamant-blad) en bediend via een standaard laboratorium pipet (Pipetman P-200) in plaats van een microinjector (Figuur 3B). In dat geval microcapillaire toegevoegd aan de pipet via een rubberen slang. 10 ul filtertips werden gebruikt om de verbindingen, die zijn omwikkeld met parafilm ze luchtdicht te maken. De capillaire - gehouden door de pipet tip - is vastgesteld op micromanipulator arm met polystyreen blokken en tape (Figuur 3B). Deze basisconfiguratie bleek efficiënt en betrouwbaar 8. Toch een van de grootste problemen is de handhaving van air-tight junctions tussen de microcapillaire en de pipet, vooral bij het wisselen van de capillair. Controleren en aanpassen van de druk in de capillaire - een verfijnd embryo in een minimaal volume zorgen - kan tijdrovend zijn met behulp van deze eenvoudige setup. De verbeterde opstelling met een hydraulisch gestuurde micromanipulator en een verticale filament trekker is een aanzienlijke verbetering en bespaart tijd.
De vaardigheden die nodig zijn voor de succesvolle toepassing van deze methode zijn gemakkelijk overdraagbaar. Vijf gebruikers in ons laboratorium met succes geleerd de werkwijze in een relatief korte tijd. Enkele vereenvoudigingen van het protocol zijn mogelijk, afhankelijk van het gemak van de gebruiker in manipulatie. Zo is het mogelijk om de stappen overslaan 2.2.5 en 2.2.6, terwijlontleden slechts 5 siliques (in plaats van 15) en schoonmaken van het embryo omgeving grondig van puin met een wolfraam naald (deze procedure werd in 8 toegepast). Synchronisatie van zaadontwikkeling door castratie en vertraagde bestuiving facultatief maar aanbevolen om het aantal embryo's te verhogen op hetzelfde ontwikkelingsstadium, vooral in vroege stadia. Daarnaast kunnen embryo isolatie worden bespoedigd als wassen stappen worden weggelaten, bijvoorbeeld voor cytologische toepassingen. Bovendien slide silicium (stap 1.3.2) is niet van belang voor gebruikers snel werken, zodat de embryo's zich aan het glasoppervlak tijd is geen probleem.
Of het filtreren of handmatige reiniging wordt toegepast, is het uiterst belangrijk om versleping te voorkomen van weefsel puin dat potentiële verontreiniging voor downstream RNA of DNA-toepassingen creëert. Deze kwestie werd onlangs in een transcriptome profilering studie omhoog met behulp van een andere methode van embryo isolatie18. In tegenstelling tot het grootste deel embryo isolatie protocol hier beschreven, de auteurs ontleed Arabidopsis embryo handmatig vanuit individuele zaden met behulp van fijne naalden, een langdurige procedure vereist uitstekende dissectie vaardigheden. Deze procedure blijkbaar nodig 2 of meer wasbeurten om versleping te voorkomen van mogelijke besmetting van cellen uit de omliggende zaadweefsel, een situatie waarschijnlijk ondervonden bij het gebruik van deze methode, gezien de geringe omvang van het embryo, de moeilijkheden bij de toegang tot hen met dissectie naalden, en de hechting van de omliggende cellen. Daarentegen onze procedure kan (i) de verdunning van het embryo-geëxtrudeerd uit de zaden bij pletten en rond afval in een groot volume (500 pl) vóór embryo, (ii) de visuele selectie van embryo zonder lijm, verontreinigende puin, en (iii) het verdunnen van mogelijke contaminatie RNA-lekken van gescheurde cellen-de wasstappen. Hoewel het mogelijk slechts een wasstap wanneer het gebruikembryo's lijken erg schoon en worden opgevangen in minder dan 5 pl 8, een tweede wasstap is aanbevolen, vooral voor beginnende gebruikers die de embryo's kunnen verzamelen in verschillende rondes (dwz met additief volume). Embryo's in te halen zo weinig oplossing mogelijk, waardoor de maximale verwatering van potentiële contaminanten in elke wasstap. Elke verzamelen ronde moet kort worden gehouden (binnen 5-10 min) tot maximaal herstel bij het vrijgeven toe in de was daling (meer aanwezigheid in de capillaire neiging om de recovery rate te verlagen). Bovendien moet de overdracht van de verzamelde embryo's in het extractiemedium (volgens de wasstappen) slechts sprake van een contact met de opening van het microcapillaire tip en niet onderdompelen van de punt, omdat dit ook overbrengen vuil Opplakbare microcapillair muur boven de opening. Tenslotte, de capillaire worden gewijzigd tussen elke nieuwe extract.
Ons protocol maakt het mogelijk voor meerdere downstream toepassingen door simpelweg met behulp van een geschikte isolatie buffer die moleculaire integriteit van RNA, DNA, chromatine, enzym of fluorescerende reporter behouden. Wij hebben met succes geïsoleerd embryo in RNA-beschermende isolatie buffer voor RNA-extractie en transcriptomics analyses 8, 1x TE-buffer voor DNA methylatie analyse 9, 100 mM fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) voor FISH en immunostaining (Jaenisch, Grossniklaus en Baroux, ongepubliceerd, figuur 5C) en kleuroplossing zonder substraat GUS-assays (19, figuur 5B). De toepassing het meest gevoelig voor isolatie voorwaarden / embryo kwaliteit is zeker RNA extractie en amplificatie. De hoeveelheid geëxtraheerde RNA uit geïsoleerde embryo was vrij laag. Van ~ 30 embryo's in de 2-4 cel stadium (dus 60-120 cellen in totaal) hebben we een bedrag van ~ 1 ng totaal RNA gebaseerd op zowel Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) en qubit (Invitrogen) metingen geschat. Following RNA-extractie, RNA kwaliteit werd gecontroleerd op een Agilent RNA 6000 Pico Chip (Agilent Technologies). Echter, de kleine hoeveelheid RNA geëxtraheerd is niet altijd voldoende om een betrouwbare profiel produceren. Zo moet verder onderzoek worden gedaan op het versterkte materiaal (cDNA) (bijv. PCR detectie laag tot expressie, embryo-specifieke genen en / of een Bioanalyzer profiel).
Ten slotte is de mogelijkheid om embryo's te isoleren door middel van visuele criteria in ons protocol is een grote aanwinst. Embryo's van eenzelfde silique (Arabidopsis fruit) niet synchroon te ontwikkelen. Zo werken op geheel silique extracten (bijv. voor RT-PCR analyses of kwantitatief reporter assays) staat niet toe dat een perfecte correlatie met een bepaald ontwikkelingsstadium. Isoleren van embryo's in een bepaalde ontwikkelingsfase lost dit probleem op. Bovendien, een soortgelijk probleem doet bij het werken met heterozygote mutanten waarbij siliques embryo bevatten verschillende genotypen. Isoleren embryo basis van visuele criteria distinguish bijv. wild-type van mutant embryo fenotypes maakt correleren stroomafwaarts analyses met het genotype. We hebben dit gedaan met succes aan DNA-methylatie analyse op specifieke loci in verschillende genotypen 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij willen graag Tal Nawy en Martin Bayer bedanken voor hun advies over embryo isolement. MTR, VG, UG en CB bedacht het embryo isolatie materiaal. MTR, VG en CB ontwikkelde het embryo isolatie protocol. MTR, VG en CB gevestigde het protocol, die de embryo's, en de gegenereerde embryo cDNA, VG deed de PCR, MTR de GUS kleuring, JJ de FISH experimenten. MTR, VG, CG en UG schreef het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de Universiteit van Zürich, een Fellowship van de Roche Research Foundation (MTR), en subsidies van de Zwitserse Nationale Stichting (tot UG en CB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
References
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H.
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).
