Summary
Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem rapor
Abstract
Endosperm - - anne tohum integuments (ya da tohum kabuğu) ile çevrili çiçekli bitkiler olarak, embriyo besleyici bir doku içinde gelişir. Sonuç olarak, erken dönemde (küresel sahneye 1 hücre) de bitki embriyoların izolasyonu teknik göreli erişilememesi nedeniyle zordur. Erken aşamalarında Verimli manuel diseksiyon güçlü genç Arabidopsis tohumların küçük boyutlu ve çevre dokulara embriyonun yapışma tarafından bozulur. Burada, biz aşağı uygulamaya bağlı olarak, 1 saat ile 4 saat içinde 40 embriyolar kadar verimli, genç Arabidopsis embriyoların verimli izolasyon sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Embriyolar, hafif bir Eppendorf tüpü içinde plastik bir havan tokmağı ile 250-750 tohum ezilmesi izolasyon tampon salınır. Bir cam standart laboratuvar pipet ya bağlı microcapillary (bir lastik tüp ile) veya hidrolik kontrollü mikroenjektör damlacıkları yerden embriyo toplamak için kullanılırters ışık mikroskobu çok iyi slayt d. Gerekli teknik beceri basit ve kolay transfer edilebilir ve temel kurulum pahalı ekipman gerektirmez. Toplanan embriyolar gibi RT-PCR, RNA sekansları, DNA metilasyon analizleri, in situ hibridizasyon (FISH), floresan, immün ve haberci gen deneyleri gibi alt çeşitli uygulamalar için uygundur.
Introduction
Çiçekli bitkiler embriyo endosperm, ikinci bir gübreleme olay türetilen bir besleyici doku ile çevrilidir. Her ikisi de, embriyo ve endosperm çekirdek katının birkaç hücre tabakası ile çevrilidir. Toplu bu dokuların meyve içinde geliştirmek bir tohum, oluşturur. Böylece doku ve Arabidopsis embriyoların hücre spesifik analizleri güçlü bir şekilde erişilememesi nedeniyle bozulmaktadır. Bununla birlikte, geç-küresel ya da geç aşamalarında embriyo nispeten iyi stereomicroscope altında ince tungsten iğneler kullanarak manuel diseksiyon için uygun, ya da onları ayıklamak için forseps kullanarak tohum hafif baskı uygulayarak vardır. Bu tür teknikler, başarılı bir şekilde transkriptomunun veya mikrodizi hibridizasyon, bisülfit dizileme veya RNA sekansları (örneğin, 1-3) Epigenom profil analizleri için kullanıldı. Buna karşılık, erken küresel sahneye zigot de embriyoların çalışmalar teknik olarak zor kalır. Bugüne kadar, sadece birkaç çalışma temsilcisi varsabit tohum bölüm 4 veya ince araçlar 5 ile tohum içinde tek tek embriyo el çekiminden embriyonik dokuların ya lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak genç embriyolar üzerinde orted transcriptome analizleri. Ancak, LCM ekipman erken aşamalarında yaygın olarak bulunan ve manuel embriyo çıkarma değil zaman kolayca transfer edilemez mükemmel diseksiyonu becerileri tüketen ve gerektiren bir. Genom analizleri ek olarak, in situ gen ifade analizleri de Arabidopsis genç, tam monte edilen embriyoların gerçekleştirmek zordur. Bir dereceye kadar, genç embriyolar tohum hafif basınç ile mikroskop slaytlar yayınlanacak ve (örneğin 6,7 bakınız) immün tarafından bildirici gen deneylerinden veya protein tespiti için kullanılır. Bu teknik, ancak, bu nedenle kantitatif analizleri engelleyen, yüksek verimli embriyo izolasyon izin vermez.
Bu nedenle, etkin ve hızlı bir protokol geliştirdi, kolay transfer, ve alt çeşitli uygulamalar için uygun kurmak için basit Arabidopsis tohum erken embriyo izolasyonu için. Uygun bir izolasyon tampon plastik bir havan tokmağı kullanılarak bir Eppendorf tüpü içinde genç meyvalarda gelen parçalanmış - temel ilkesi, yavaşça tohum ezmek için. Tohum ekstresi, çok oyuklu slayt damlalar halinde yerleştirilir ve bir ters mikroskop kullanılarak istenen aşamada serbest embriyoların varlığı için taranır. Embriyolar bir cam mikroenjektör veya standart laboratuvar pipet bağlı microcapillary kullanılarak toplanır. Moleküler uygulamalar için, embriyo az hacimde hedef tampon aktarmadan önce yeni izolasyon tampon damla içine tekrarlanan serbest iki kez yıkanır. Sitolojik uygulamaları (muhabiri deneyleri, immün, FISH) için, yıkama adımları atlanabilir.
Bu yöntem çeşitli avantajlar sunmaktadır: (i) sitolojik uygulaması için ~ 45 dakika içinde 25-40 embriyolar üretirmoleküler uygulamaları (yıkama adımları dahil) Dokümanında veya 3-4 saat içinde, (ii) bu özel embriyonik aşamalarında izolasyonu, (iii) (iv), kolayca basit ayarları nedeniyle diğer kişi ve laboratuarlar için devredilemez sağlar , yükseltmeleri için uygun olan temel kurulum için uygun ekipman gerektirir, ve (v) başarıyla bu RNA sıralama 8, gen-spesifik DNA-metilasyon analizi 9, muhabiri testleri (10 ve Raissig ve ark. gibi çeşitli alt uygulamalar için kullanıldı olarak hazırlık.) ve FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux yayınlanmamış,) bkz. Şekil 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu prosedür, Şekil 1'de gösterilen akış şeması özetlenmiştir. Mikrokapilerler ve etkili kurulum Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterilmiştir, ve embriyo izolasyon tipik aşamalar, Şekil 4 'de gösterilmiştir.
1. Gereç ve Tampon Hazırlanması
Cam mikrokapilerler 1.1 silikon kaplama
- Sigmacote (Sigma) ~ 5 ml, 15 ml Falcon tüp mikrokapilerler yerleştirin ve birkaç kez ters çevirin.
- Çözüm çıkarın, 60 ° C de bir alüminyum folyo ile kılcal içeren Falcon tüp yerleştirin ve 3 saat için onları fırında Oda sıcaklığında saklayın.
1.2 ~ 50-100 mikron çaplı microcapillary ipuçları elde
- El ile bir Bunsen beki üzerinden veya ticari bir çektirmesi (dikey filament çektirmenin veya mikropipet çektirmenin) kullanarak ya 1 mm çaplı cam kılcal çekin.
- Bir elmas kullanınuçlu kalem veya istediğiniz açılış oluşturmak için çekti kılcal ucu kesmek için bıçak. , Bir stereo mikroskop altında iyi şeklinde kılcal seçin. Açılış 50-100 mikron (Şekil 2) olması gerekmektedir.
1.3 Slayt hazırlanması
- 5 dakika boyunca Sigmacote (~ 1 ml / slayt) ile tüm kuyuları kaplayarak temiz slaytlar Siliconize, kaldırın. Alüminyum folyo ile fırında, 3 saat. Oda sıcaklığında saklayın.
- % 10 SDS, nükleaz içermeyen su içinde 2 x 2 dakika (DEPC GKD 2 O otoklavlanmış),% 70 etanol içinde 2 dakika,% 100 etanol içinde 2 dakika, 10 dakika süreyle çok iyi bir cam mikroskop lamları yıkayın hava kurulayın. Tüm adımlar otoklavlanmış Coplin kavanoz içinde yapılır. Slaytlar her kullanımı arasında kapsamlı bir temizlik sağlayan birden çok kez yeniden kullanılabilir.
- Hemen önce embriyo izolasyon yayılmasına ~ 10 0.5 ul mg / ml sığır serum albümin (BSA) her iyi ve hava-kuru tüm yüzey üzerinde bir pipet ile.
1.4 Mikroskop ve kılcal kurulum
<ol>1.5 Tamponlar
Tablo 1, alt uygulamalara bağlı olarak izolasyon ve hedef tampon listeler.
- ~ Örnek başına 1 ml izolasyon tampon taze önce kullanmak ve buz üzerinde tutmak hazırlayın.
- Buz (moleküler uygulamaları) ya da bir nemli odasında bir mikroskop lamı (sitolojik uygulamaları) bir 0.5 ml Eppendorf düşük bağlayıcı tüp hedef tampon hazırlayın.
2. Tohum Diseksiyon ve Embriyo Ekstraksiyon
Tohum Geliştirme 2.1 Senkronizasyon
- Çiçek erkekleştirmek ve diğer çiçeklerle maruz pistils temas kaçınarak onları iklim odasında 2 gün tutmak, sonra onları (örneğin 11) tozlaşmak.
- Temizlenir tohumların mikroskobik inceleme ile sizin büyüme koşullarında geliştirme aşamasında test edin. 4 DAP küresel vermiştir - büyüme koşullarına tohumları (DAP) tozlaşma sonra 2.5 gün toplanan (21 16 saat ışık ° C, 18 karanlık 8 saat ° C ve% 70 nem) özellikle 2-4 hücreli embriyo ve tohum 3,5 toplanan vermiştir embriyolar.
2.2 Tohum Diseksiyon ve Kopma
- S çıkarınforseps ve insülin iğneleri ile bir stereo mikroskop altında 10-15 meyvaları (~ 2.5 DAP) den eeds.
- Buz üzerine yerleştirilir, 2 ml lik yuvarlak dipli Eppendorf tüp içinde 20 ul tampon içinde izolasyon tohum daldırın.
- Yavaşça çekirdeği özütü bulutlu hale gelene kadar embriyo serbest bırakmak için bir plastik havaneli (DEPC GKD 2 O ile çalkalandı,% 10 SDS ile önceden temizlenmiş ve% 70 etanol ile yıkanmış) ile tohum kırmaktadır. Uygulamak için kuvvet deneme üzerine her kullanıcı tarafından belirlenecektir.
- Havaneli yıkayın ve örnek sulandırmak için izolasyon tampon 300 ul ile havan eli durulayın.
- Spin-aşağı 5 saniye için 5000 xg özü. Yavaşça yukarı ve aşağı 2-3 kez pipetleme pelet özü tekrar süspansiyon.
- 30 mikron naylon örgü (PartecCelltricks gelen örneğin, tüp adaptörler monte) ile süzülür. Ek bir 200 ul izolasyon tamponu ile örgü durulayın.
3. Embriyo İzolasyon
3.1 Slayt hazırlanması
- <li> Yeri ters mikroskop sahnede temiz, BSA ile kaplanmış ve silikonlu çok iyi slayt, yukarı ve aşağı yavaşça pipetleme filtre çekirdeği ekstresi tekrar süspansiyon ve 1 veya 2 kuyulara 40-50 ul çekirdeği ekstresi 2 damlacıkları pipetle . Aynı anda sadece 1 veya 2 damla Eleme örnek buharlaşmasını önler.
- Daha önce olduğu gibi hazırlanan farklı bir slayt iyi taze izolasyon tampon Sıra 50 ul (1. yıkama damla). Buharlaşmasını önlemek için üstü kapalı, nemli odasında bu slayt tutun.
3.2 Ekran, temiz, toplamak
- 10x büyütme amacı ile istenilen aşamada embriyo için çekirdeği ekstresinin damlacıkları ekran. Gerekirse, 20x büyütme ile sahne onaylayın. Embriyolar genellikle slayt dibine çöker.
- Manuel bir tungsten iğne, bir insülin iğne veya benzeri ekipman ile embriyo etrafında pislikleri temizleyin.
- Mikromanipülatör, t kullanarak embriyo yakın kılcal cam taşıyınmümkün olduğu kadar az çözüm olarak ile embriyo kadar AKE.
- Birkaç embriyolar (örneğin tek bir damlacık) toplamak ve 1. yıkama damla (moleküler uygulama) veya hedef tamponu (sitolojik uygulamaları) bunları bırakın. Her toplama yuvarlak az hacmi (tüm toplama mermi toplam hacmi <5 ul olmalıdır) toplanmalıdır 5-10 dakika ve embriyoların içinde tutulmalıdır.
- Embriyoların istenilen miktarda (merkezi, mümkünse, hatırlama kolaylaştırmak için) 1. yıkama damla toplanan kadar tarama ve tahsilat tekrarlayın.
- Yıkama damla (enkaz üzerinden yapılmaktadır eğer, hatırlama önce iğne ile bunları kaldırmak) için aynı anda tüm embriyolar hatırlamak.
- 50 ul bir 2. yıkama damla içine embriyolar bırakın. 3.2.6 tekrarlayın.
- Hedef tampon içinde embriyoların bırakın. Transfer kılcal ucu sadece bir kişi değil, daldırma, içermelidir.
- Microcapil değiştirinBir sonraki örnek ları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Moleküler yıkama uygulamaları için, örneğin, gerçekleştirilmesi durumunda eden embriyo izolasyon prosedürü (Şekil 1), 4 saat içinde 40 embriyo kadar izolasyonu sağlayan ya da bir saatten daha kısa bir süre içinde yıkama, ihmal sitolojik uygulamalar için, örneğin eğer. Gösterir Şekil 2, yüksek ve alçak kalite mikrokılcal uçlarına ve Şekil 3, embriyo izolasyon makinenin bir yapıyı göstermektedir. Şekil 4, bu tersine mikroskobunda embriyo izolasyon işlemi gösterir.
Biz başarıyla birkaç yeni makaleler yayınlanan çeşitli uygulamalar için bizim prosedürü uygulanır. Bu yöntem aslında erken embriyonik transcriptome için ebeveyn katkı analiz için geliştirilmiştir. Iki farklı Arabidopsis katılmalar (Landsberg erecta (L er) ve Columbia (Col-0)) arasında haç ile üretilen hibrid embriyolar 2-4 hücreli aşamada izole edildi. Toplam RNA ekstre edildi, cDNAkütüphaneleri doğrusal amplifikasyon kullanılarak üretilen ve sağlam bir platform üzerinde sekanslandı. Alel-özel transcriptomes SNP analizi 8 dayalı oluşturulmuştur. Önce biz WUSCHEL-homeobox 2, 8 ve 9 (WOX2, WOX8, WOX9) ve ACTIN 11 (13,14, Şekil 5A) embriyo özgü transkript güçlendirilmiş sıralama için embriyonik cDNA kütüphaneleri kontrol etmek için.
Buna ek olarak, bu yöntem, genomun spesifik bölgelerinin embriyonik DNA metilasyonu analiz etmek için genç embriyoların izole etmek için kullanılmıştır. Embriyolar izole edilmiş ve 1x TE-tamponu içinde yıkandı. 9,15 anlatıldığı gibi küçük çaplı bisülfit dizileme uygulanmıştır.
Benzer şekilde, embriyo izolasyon düşük embriyonik ifade ile bildirici gen deneylerinden çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır ve anne tohum kabuğu algılama boşa veya embriyo (endosperm, tohum kabuğu) çevre dokularda muhabir ifade maskelenir burada. Embriyolar Carr (, GUS ß-glukuronidaz) veya doğrudan (yeşil veya kırmızı Floresan Protein, GFP, TTT) analiz muhabir transgen ying lekeli izolasyon takip. Bir örnek MEDEA promoteri (s MEA) 10 kontrolü altında bir GUS raportör genini embriyolar için Şekil 5B 'de verilmiştir. Nispeten birçok embriyolar, izole edilebildiği kolaylığı da kantitatif analiz (farklı genetik arka, Raissig, Grossniklaus diğ lekeli embriyo sayısı örneğin. Hazırlanmasında) sağlar.
Son olarak, başarılı Situ Hibridizasyon (FISH) ve slaytlar akrilamid yastıkları gömülü izole embriyolar nükleer mimarlık eğitimi için immün teknikleri Floresan uygulanır. Sentromer tekrarlar ve nükleoler organize bölgelerine karşı prob kullanılarak FISH bir örnek Şekil 5C de gösterilmiştir.
1 "fo: içerik-width =" 5in "fo: src =" / "src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1.jpg "/ files/ftp_upload/50371/50371fig1highres.jpg>
Şekil 1. Embriyo izolasyon prosedürü akış şeması protokolü üç bölüme ayrılır: 1 - Malzeme hazırlanması, 2 - Tohum diseksiyonu, 3 - Embriyo izolasyon..
Şekil 2. Microcapillary ipuçları. Yaklaşık 100 mikron düzgün bir açılış ile A. yüksek kaliteli microcapillary ipuçları. Daha geniş açılması ve düzensiz kontur B. Düşük kaliteli microcapillary ipuçları (bu ipuçları sitolojik uygulamalar sadece kabul edilebilir). Ölçek çubuğu: 2 mm.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig3.jpg "/>
Şekil 3,. Embriyo izolasyon mikroskop ayarlayın. A ve B Tarama ters bir mikroskop altında mikroskop lamları üzerinde gerçekleştirilir. Embriyolar mikrokılcal tam konumunu kontrol etmek için bir mikromanipülatör sabitlenir (Şekil 4 de bakınız) ve bir mikroenjektör (A) ya da standart laboratuar pipeti (B) 'ya bağlı olan bir cam kullanılarak toplanır. C. mikrokılcal cam hidrolik bir kontrol ile bağlantılıdır Embriyo toplama B. sırasında hassas kontrol microcapillary cam mikroenjektör (örneğin Eppendorf Hücre Tramvay Vario) bir lastik esnek tüp ile standart bir P-200 pipet eklenir. Embriyo toplama ve serbest pipet kalibrasyon tekerleği çevirerek kontrol edilir. Cut-end pipet uçları bağlantı olarak kullanılır ve kavşaklar parafilm ile mühürlenir. Microcapillary polyester bloklar, Falcon tüpler ve bant ile mikromanipülatör sabittir.
Şekil 4. Embriyo izolasyon süreci. A. 2-4 hücre embriyo (ok) çekirdeği ekstresi (tarama damlacık) tespit edildi ve enkaz (çiğit kırıkları) ile çevrilidir. Çevreleyen enkaz bir iğne kullanılarak elle B. kaldırıldı. C. kılcal cam sağ embriyo (ok) yanında taşındı. D. embriyo toplanır ve yıkama sonrasında son açılan kılcal (ok). E. Çeşitli embriyoların içinde gelinmiştir. Ölçek = 50 mikron.
F ŞEKIL 5. Embriyo izolasyon downstream uygulamalar A. Gen ekspresyon analizleri:. PCR WOX9, WOX2, WOX8 amplifikasyonu ve 2-4 hücreli embriyo cDNA kütüphaneleri ACTIN11 13,14 (8 açıklandığı gibi oluşturulan) 1x kez yıkanır (1 şerit) ve genomik üzerinde . DNA (2. şerit) B. Muhabir testi:. ap MEA :: GUS yapı standart bir GUS boyama çözüm bir slayt (izin sonra Raissig ve diğerleri, 2011: yeniden üzerine boyandı taşıyan bitkilerden izole bir 8 hücreli embriyo Bitki Hücre, ASPB telif hakkı). C. Floresan In-Situ Hibridizasyon (FISH): 8 hücreli embriyo sentromerik tekrar (kırmızı) ve dolaylı İmmuno 16 önce 45S rDNA tekrar (yeşil) karşı probları ile melez edildi. Çift renkli FISH görüntüler DAPI counterstaining ve DIC görüntüleri (DM6000B Epifloresans mikroskop, Leica, Almanya) ile kaplanmış edildi.
| Uygulama | İzolasyon tampon | Hedef tampon |
| RNA ekstraksiyon (amplifikasyon ve transkriptomik için örneğin) | 1x İlk Strand tamponu (Invitrogen), 1 mM DTT,% 4 RNAseOUT | RNA ekstraksiyon tamponu |
| DNA izolasyonu (bisülfit sıralama için) | 100 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 (TE) | DNA ekstraksiyon tamponu veya 1x TE tampon |
| GFP muhabiri analizi | 0.5x 1 M Glycin MS 1 | MS 0.5x içinde 1 M glisin |
| GUS raportör analizi | X-Gluc (substrat) olmadan tampon 2 boyama | X-Gluc (substrat) ile tampon boyama |
| BALIK ve immün | 100 mM fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) | aktif Akrilik: 30 dakika için bir SuperFrost Plus slayt-polimerize üzerine Bisacryl karışımı (33:3) |
Tablo 1. Farklı uygulamalar için alt izolasyonu ve hedef tamponlar içinde eritilir. Tamponlar spesifik deneysel gereksinimlerine adapte edilebilir. 1 Murashig ve Skoog ortamı. 2 örneğin Jefferson ve diğ., EMBO J. 6 (13), 3901-3907 (1987).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz etkili, hızlı bir embriyo izolasyon protokolü geliştirilmiş ve kolayca diğer laboratuarlara transfer edilebilir.
Burada tanımlanan cihaz, bir ters mikroskop, bir mikromanipülatör, cam mikrokapilerler, dikey bir filaman çektirme ve mikroenjektör (Şekil 3A) oluşur. Kurulum transkriptomik analizleri 17 için tek bir hayvan hücre izolasyonu için tarif edilen yönteme benzerdir. Biz de başarıyla cam mikrokapilerler elle bir alev gerilir (ve bir elmas bıçak ile kesilir) ve bunun yerine bir mikroenjektör standart bir laboratuvar pipet (Pipetman P-200) (Şekil 3B) ile ameliyat edildi, daha temel kurulum ile çalıştı. Bu durumda mikrokılcal bir tüp yoluyla lastik pipet bağlıydı. 10 ul filtertips onları hava geçirmez yapmak için parafilm sarılmış olan kavşaklar, yapmak için kullanıldı. Kılcal - pipet tarafından düzenlenen - MICR üzerinde tespit edildipolyester bloklar ve bant kullanarak omanipulator kolu (Şekil 3B). Bu temel kurulum 8 verimli ve güvenilir olduğunu kanıtladı. Bununla birlikte, ana zorluklar biri kılcal değişen özellikle, microcapillary ve pipet arasında hava-sıkı bağlantıları sürdürülmesi oldu. Doğrulama ve kılcal basınç ayarı - az hacimde bir ince ayar embriyo toplama sağlamak için - bu temel kurulumu kullanarak zaman alıcı olabilir. Bir hidrolik kontrollü mikromanipülatör ve dikey filaman çektirmesi ile gelişmiş kurulum önemli bir gelişme olduğunu ve zaman kazandırır.
Bu yöntemin başarılı bir uygulama için gerekli becerileri kolayca aktarılabilir. Laboratuvarımızda Beş kullanıcılar başarıyla nispeten kısa bir süre içinde yöntem öğrendim. Protokolün bazı sadeleştirmeler mümkün manipülasyon kullanım kolaylığını bağlı olarak vardır. Örneğin, bu adımları 2.2.5 ve 2.2.6 ise atlamak mümkündürsadece 5 meyvaları (15 yerine) diseksiyon ve bir tungsten iğne (bu prosedür 8'de uygulanmıştır) ile enkaz iyice embriyo çevre temizlik. Emasculation ve gecikmiş tozlaşma yoluyla tohum geliştirme Senkronizasyon fakültatif ama özellikle erken dönemde, aynı gelişim aşamasında embriyo sayısını artırmak için tavsiye. Yıkama adımları atlanır Buna ek olarak, embriyo izolasyon sitolojik uygulamalar için örneğin, hızlandırılmış olabilir. Ayrıca, slayt siliconization (adım 1.3.2), hızlı bir şekilde çalışan kullanıcılar için, zaman içinde cam yüzeyine yapışabilir bu embriyolar bir sorun değildir, gerekli değildir.
Filtreleme veya elle temizlik uygulanır olsun, aşağı RNA veya DNA uygulamalar için potansiyel kirlenme yaratan doku enkaz taşıma üzerinden önlemek için son derece önemlidir. Bu sorun embriyo izolasyonu için farklı bir yöntem kullanarak bir transcriptome profil çalışmada son zamanlarda büyüdü18. Burada açıklanan toplu embriyo izolasyon protokolüne aksine, yazarlar ince iğneler, mükemmel diseksiyon beceri gerektiren uzun bir prosedür kullanılarak elle tek tek tohum içinde Arabidopsis embriyolar disseke. Bu işlem görünüşte embriyolar, diseksiyon iğne ile erişimde zorluklar küçük boyutu göz önüne alındığında bu yöntemi kullanırken çevre tohum doku, olasılıkla karşılaşılan bir durum mümkün kirlenmesine neden olan hücreleri taşıma üzerinden önlemek için 2 veya daha fazla yıkama gerekli ve yapışkanlık çevreleyen hücreler. Buna karşılık, bizim işlem yapıştırıcı yoksun embriyo (ii) görsel seçimi ezme ve Embriyo toplanması önce büyük bir hacim (500 ul) artıkları çevreleyen üzerine tohum embriyolar-ekstrüzyon (i), seyreltme, kirlenmesine izin verir, enkaz ve olası RNA yıkama adımları hücreleri tarafından rüptüre bulaşma-sızıntı (iii) seyreltme. Sadece tek bir yıkama adımı halinde kullanmak mümkün olsa da,embriyoların çok temiz görünür ve daha az 5 ul 8 toplanır, ikinci bir yıkama adımı özellikle (katkı maddesi hacmi ile yani) birkaç tur içinde embriyolar toplayabilir ilk kez kullananlar için, tavsiye edilir. Embriyoların her bir yıkama aşamasında, potansiyel kirleticilerin maksimum seyreltme sağlayan, mümkün olduğu kadar küçük bir çözüm olarak alınmalıdır. Her toplama yuvarlak yıkama damla (kılcal uzun varlığı iyileşme oranı azaltma eğilimi) iade edildikten sonra maksimum iyileşme sağlamak için (5-10 dakika içinde) kısa tutulmalıdır. Bu da enkaz üzerinde microcapillary duvara yapışmasını aktarmak olabilir Dahası, ekstraksiyon orta (yıkama adımları izleyerek) içine toplanan embriyoların transferi sadece, microcapillary ucunun açılması ve ucu değil daldırma ile bir temas içermelidir Açılış. Son olarak, her bir kapiler yeni tohum ekstresi arasında değiştirilmelidir.
Bizim protokol birkaç çıkışlar sağlarsadece RNA, DNA, kromatin, enzim ya da floresan muhabiri moleküler bütünlüğünü korumak uygun bir izolasyon tampon kullanarak tream uygulamaları. Biz başarılı bir RNA ekstraksiyon ve transkriptomik analizleri 8, 1x DNA metilasyon analizleri için TE-tampon 9, 100 mM fosfat (Jaenisch, Grossniklaus ve Baroux, yayınlanmamış, Şekil FISH ve immün için tuzlu su (PBS) tamponlu için RNA-koruyucu izolasyon tampon embriyolar izole GUS raportör tahlilleri (19, Şekil 5B) Alt-tabaka olmadan 5C), ve boyama çözeltisi. Izolasyon koşulları / embriyo kalitesine en hassas uygulama kesinlikle çıkarma ve yükseltme RNA edilir. Izole edilmiş embriyolar, çıkarılan RNA miktarı oldukça düşüktü. ~ Itibaren 2-4 hücreli aşamada 30 embriyolar (toplam böylece 60-120 hücreleri) ikimiz de Agilent 2.100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) ve Qubit (Invitrogen) ölçümlerine göre toplam RNA ~ 1NG bir tutarı tahmin. Following RNA ekstraksiyon, RNA kalitesi Agilent RNA 6000 Pico Chip (Agilent Technologies) üzerinde doğrulandı. Bununla birlikte, çıkarılan RNA miktarı düşük olduğu zaman güvenilir bir profil üretmek için yeterli değildir. Böylece, daha fazla test güçlendirilmiş malzeme (cDNA) (örneğin PCR düşük dile getirilen, embriyo-spesifik genler ve / veya Bioanalyzer profil tespit) yapılması gerekir.
Son olarak, protokol görsel kriterlere göre embriyolar izole yeteneği bir büyük bir kazançtır. Aynı silique (Arabidopsis meyve) embriyolar eşzamanlı gelişmez. Böylece, bütün silique özleri (RT-PCR analizleri veya kantitatif muhabiri deneyleri için örneğin) üzerinde çalışan belirli bir gelişim aşaması ile mükemmel bir ilişki izin vermez. Belirli bir gelişim aşamasında embriyo izole bu sorunu çözer. Meyvaları farklı embriyo genotip içeren heterozigot mutant çalışırken Buna ek olarak, benzer bir sorun oluşturur. D görsel kriterlere göre embriyolar izolemutant embriyo fenotipleri gelen vahşi tip örneğin istinguish genotipi ile alt analizler ilişkilendirerek sağlar. Biz farklı genotip 20 belirli bölgelerinin DNA metilasyon analiz etmek için başarılı bir şekilde yapmış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz embriyo izolasyon tavsiyeleri için Tal Nawy ve Martin Bayer teşekkür etmek istiyorum. MTR, VG, UG ve CB embriyo izolasyon ekipman geliştirmiştir. MTR, VG ve CB embriyo izolasyon protokolü geliştirdi. MTR, VG ve CB, protokol kurulan embriyolar izole ve oluşturulan embriyo cDNA, VG PCR, MTR GUS boyama, JJ FISH deneyler yaptı. MTR, VG, CG ve UG el yazması yazdı. Bu çalışma Zürih Üniversitesi, Roche Araştırma Vakfı (mtr) bir Bursu ve İsviçre Ulusal Vakfı (UG ve CB) hibe tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
References
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H.
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).
