Anticorps coloration dans Published: October 14, 2013 doi: 10.3791/50664

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Janet S. Duerr¹

¹Department of Biological Sciences, Ohio University

Summary

"Freeze-fissuration," une méthode pour exposer les tissus internes du nématode C. elegans aux anticorps pour la localisation des protéines, est démontrée.

Abstract

Pour colorer C. elegans avec des anticorps, la cuticule relativement imperméable doivent être contournés par des méthodes chimiques ou mécaniques. "Freeze-craquage" est une méthode utilisée pour tirer physiquement la cuticule de nématodes en comprimant les nématodes entre deux lames adhérentes, les congeler, et en tirant les diapositives en dehors. Cryo-craquage fournit un moyen simple et rapide pour accéder à des tissus, sans traitement chimique et peut être utilisé avec une variété de fixateurs. Toutefois, elle conduit à la perte d'un grand nombre de spécimens et la compression requise déforme mécaniquement l'échantillon. La pratique est nécessaire pour maximiser la récupération d'échantillons avec une bonne morphologie. Cryo-craquage peut être optimisée pour les conditions spécifiques de fixation, la récupération d'échantillons, ou faible coloration non-spécifique, mais pas pour tous les paramètres à la fois. Pour les anticorps qui requièrent des conditions de fixation très durs et tolèrent les traitements chimiques nécessaires pour perméabiliser chimiquement la cuticule, traitement de nématodes intactes en solution peut être préférée. Si l'anticorps nécessite une solution claire ou plus si les conditions optimales de fixation ne sont pas connus, de gel-craquage est un moyen très utile pour doser rapidement l'anticorps et peuvent donner des informations spécifiques de localisation subcellulaire et cellulaire de l'antigène d'intérêt.

Introduction

Pour déterminer la localisation cellulaire et subcellulaire des protéines, les scientifiques ont toujours marqué les tissus avec des anticorps sélectionnés de reconnaître spécifiquement des protéines particulières ^1. Dans certains organismes modèles tels que C. elegans, la coloration des anticorps a souvent été remplacé par des techniques génétiques moléculaires, qui donnent des résultats plus rapidement. Ceux-ci comprennent les organismes transformants avec des constructions, comprenant des fusions de gène entre le promoteur et les régions codantes du gène d'intérêt et la protéine fluorescente verte. Cependant, les techniques moléculaires sont soumis à un certain nombre d'objets, y compris les problèmes de connaître le véritable promoteur et changements dans l'expression des constructions à grand nombre de copies (les techniques habituelles chez C. elegans) ^2,3. Par conséquent, la coloration avec des anticorps demeure un objectif pour de nombreux scientifiques étudient la fonction des protéines in vivo.

La coloration des tissus avec des anticorps peut être difficile, car untibodies ne peuvent reconnaître leur antigène dans une conformation particulière ^1. Par exemple, les anticorps peuvent reconnaître que l'antigène dénaturé ou intact fixe d'une manière particulière et peuvent ne pas reconnaître l'antigène in situ. Le problème de la coloration des anticorps chez les nématodes est exacerbé par le fait que la cuticule du nématode forme une barrière relativement imperméable, le blocage de l'accès des anticorps aux tissus.

Il existe plusieurs méthodes différentes utilisées pour la coloration des anticorps à C. elegans (revue dans nos travaux précédents ^4). Pour colorer intactes »vers,« méthodes ont été développées pour geler et dégeler dans un fixateur relativement dur (formaldéhyde ou glutaraldéhyde), les cycles de gel-dégel contribuent à fissurer la cuticule pour permettre la pénétration rapide du fixateur ^5. Après fixation, la cuticule a été perméabilisées pour permettre la pénétration de l'anticorps; méthodes comprenaient le traitement avec des agents, la collagénase, ou les deux ^5-7 réduire. Ces Treatments conservés morphologie, mais souvent réduites ou détruites reconnaissance d'anticorps. Méthodes alternatives incluent dissection ⁸ pour permettre la pénétration d'anticorps.

"Freeze-craquage" est un moyen d'accéder à l'intérieur de la semi-ver intact pour permettre anticorps coloration ^9-10. Cryo-craquage peut être effectuée avec une variété de conditions de fixation, tout en évitant des traitements de la collagénase et de réduction. Les nématodes sont placés entre deux lames d'adhésifs, congelés, puis les lames sont séparées, laissant la plupart des nématodes sur la lame de fond et beaucoup de la cuticule sur la lame supérieure. La glissière inférieure peut être placée dans un fixateur et le coulisseau avec l'ensemble de nématodes adhéré est transférée à travers la procédure de coloration à l'anticorps. La méthode ne présentent deux difficultés majeures. Premièrement, il est difficile d'appliquer la bonne quantité de pression nécessaire pour séparer les nématodes sans les déformer sérieusement. Deuxièmement, bon nombre des vers ne sera pas scocher soit diapositive, et sera perdu dans le fixateur ou rinçages. Cependant, avec les diapositives et les pratiques appropriées, la méthode donnera rapidement nématodes morphologie raisonnable qui peut être utilisé avec une grande variété de fixateurs et des anticorps.

Le procédé peut faire varier légèrement, en fonction de l'objectif de l'expérimentateur. Si la coloration des nématodes est désirée (par exemple, pour déterminer si un seul transformant a modifié la coloration des anticorps), puis glisse avec une adhérence maximale (mais supérieur coloration de fond) peut être utilisé, par exemple sous forme de diapositives préparés en laboratoire avec polylysine supplémentaire (voir ci-dessous). Pour le formaldéhyde ou le glutaraldéhyde fixation, les lames d'adhésion plus élevés (diapositives polylysine préparés en laboratoire) doivent être utilisés, car les nématodes adhèrent plus mal à la polylysine après ces fixations. Si les nématodes de type sauvage sont fixées avec du méthanol et / ou de l'acétone, puis glisse avec une adhérence plus en plus bas bruit de fond doit être utilisé (commercial ou ldiapositives aboratory préparé). Si une variété d'anticorps et fixateurs sont utilisés dans le laboratoire, une sélection de diapositives peut être préparé à l'avance et stocké jusqu'à son utilisation.

Après avoir accès au tissu de nématodes a été gagné, les procédures de coloration anticorps suivent des méthodes standard (avec de plus longues incubations caractéristiques des tissus plutôt que des cellules ^1,11).

Protocol

NOTE: Plusieurs étapes du protocole sont présentés avec des options pour l'installation et la préparation en fonction des conditions spécifiques de l'expérience. Pour ces cas, des mesures alternatives sont présentées comme A, B, C, etc Le protocole de mesures alternatives est présenté dans la figure 1.

Une. Préparation des lames Polylysine filmés

Trois types de lames différentes peuvent être utilisées, selon le compromis souhaité entre la facilité de préparation, l'adhérence relative, et la liaison non spécifique de l'anticorps. Les détails des variantes de préparation de glissement sont donnés ci-dessous dans les étapes 1A-1C en vue d'augmenter l'adhérence et de la complexité. Diapositives préparées par ces différentes méthodes peuvent être utilisées ensemble pour une expérience unique.

1A. Pas de préparation des lames

Diapositives de polylysine enduit disponibles dans le commerce offrent une faible adhérence et faible bruit de fond.

1B. Glisser pra séparation optimale pour un mélange méthanol-acétone fixation

Adhérence moyen et faible bruit de fond.

1. Préparer une solution de polylysine pour tremper les diapositives: Ajouter 400 mg de poids moléculaire très élevé (150 000 - 300 000 D) poly-L-lysine pour 200 ml double eau distillée. Ajouter 2 ml 10% d'azoture de sodium stock (concentration finale de 0,1%) comme conservateur. ATTENTION: sec azoture de sodium est réactif et toutes les formes sont toxiques. Porter un masque et des gants lors de pesage de poudre pour faire 10% stock dans de l'eau distillée deux fois.
2. Essuyez les lames de verre dépoli de gamme unique avec des lingettes non pelucheux, en supprimant les taches et les particules. Cela devrait être fait même sur des lames achetés avec la désignation "préalablement nettoyé."
3. Placer les lames dos à dos dans un support de diapositives, pot de coplin ou autre récipient à coloration, en gardant les bords givrés et pas tout à fait parfaitement alignés (pour faire la séparation plus tard plus facile). Placez support de tranche dans le bécher avec 70% d'éthanol (alcool de qualité réactif n'est pas nécessaire) avec HCl 1% en dicalmé eau ou remplir pot coloration à niveau de givrage. Basculer les lames dans une solution pendant au moins 5 min. ATTENTION: Cette solution est corrosive, porter des gants. NOTE: Cette solution peut être réutilisée plusieurs fois (jusqu'à plusieurs mois).
4. Rincer les lames dans la gestion de l'eau distillée pendant 1 min.
5. Diapositives sécher complètement dans un environnement exempt de poussière, soit en plaçant dans une étuve à 40-60 ° C pendant 30-60 min ou en gardant une nuit à température ambiante.
6. Incuber les lames dans une solution de polylysine (couvrant une partie non glacés) sur rocker pendant 15 min.
7. Répétez le séchage de diapositives.
8. Répétez polylysine solution incubation et des étapes de séchage.
9. Séparez les lames à l'aide d'un objet métallique mince comme une spatule de pesée mince. Si elles sont correctement respectées, elles sont difficiles à séparer. Porter un équipement de sécurité approprié (lunettes de sécurité) et de travailler sur papier de banc (à être jetés après utilisation), car les petits morceaux de verre peuvent voler lâche quand les lames sont séparées.
10. Stocker les lames en propre(Sans poussière) boîte à lames à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.

1C. Faites glisser une préparation optimale pour le formaldéhyde fixation

Meilleure adhérence mais bruit de fond élevé.

1. Placer les lames préparées avec la méthode 1B plat dans un plat allant au four sans poussière (pour le séchage au four) ou sur une surface libre de poussière plat (pour le séchage de l'air).
2. Placer une goutte de 20 à 60 ul de la solution de polylysine sur le milieu de chaque lame.
3. Diapositives sécher complètement dans le four ou à la température ambiante. La polylysine laissera derrière ovales pâles comme elle s'évapore. Ces ovales sont très adhésif. Malheureusement, ils se lient également à des anticorps primaires et secondaires, même après blocage.
4. Stocker les lames en propre boîte de glissement (sans poussière) à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.

2. Préparation de Frozen nématode Diapositives

Préparer nématodes pour la coloration par rinçage complètement exempte de bactéries en utilisant la méthode 2A (pour les plaques de nématodes) ou2B (pour les nématodes individuels).

2A. Préparation des lames à partir de plaques de nématodes

1. Placez un morceau de métal plat sur la glace sèche pour prérefroidissement.
2. Utilisez de l'eau distillée et une pipette en verre (diminue la perte de vers) ou micropipette pour rincer les vers de plaque NGM avec des bactéries dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml. Les plaques peuvent être synchronisés ou mélangés âges, ne pas utiliser des plaques avec de nombreux dauers (difficiles à craquer) ou vers affamés (augmentation autofluorescence), sauf si nécessaire.
3. Rincer les vers 3-4x avec de l'eau distillée jusqu'à exempte de bactéries. (Pour diminuer la perte de vers utiliser la même pipette en verre.) Pour un culot vers, soit les laisser s'asseoir sur le banc pendant 3-5 min (pour recueillir la plupart des adultes au fond du tube) ou tourner 30 secondes à ~ 1000 rpm (~ 500 g) dans une centrifugeuse de paillasse (pour collecter les adultes, les larves et les embryons).
4. Éliminer la majeure partie de l'eau provenant du tube par des vers, en laissant environ deux fois le volume d'eau en tant que vis sans fin (mais au moins 25 pl de volume total).
5. Un nombre égal de diapositives réguliers "top" (nettoyé mais pas polylysine traités) disponibles.
6. Lieu ~ 25 vers ul dans l'eau sur le "fond" slide adhérent et répandre le liquide contenant les vers sur la partie centrale de la lame à l'aide du côté de la pointe de la pipette.
7. Laissez les vers se contenter de 30 secondes à 2 minutes. Si la lame est correctement collant, les extrémités des vers se collent comme ils contactent la diapositive.
8. Maintenez la lame de fond dans une main et placer la lame supérieure sur la lame de fond de sorte que tous, mais les parties gelées se chevauchent. Le liquide doit garder les lames légèrement écartés, de sorte que les vers se déplacent encore légèrement Ne laissez pas les lames glissent sur ​​l'autre -. Cette tord les vers.
9. Appuyez avec précaution vers le bas slégèrement sur ​​la lame supérieure, en utilisant les pouces et les index de chaque main. Avec la quantité idéale de la pression, quelques-uns des plus grands hermaphrodites sur le bord des lames se rompt, alors que la plupart des adultes et des larves prendra contact avec chaque diapositive mais restera intact.
10. Immédiatement et soigneusement (sans glissement) Mettre les lames sur la pièce de métal sur la glace sèche. Les lames doivent semblent gelés dans une minute. Garder sur la glace sèche pendant 5 min jusqu'à ce que complètement gelé.
11. A ce stade, les lames peuvent être stockées dans une case à -80 ° C pendant plusieurs jours. (Si elles sont conservées semaines à -80 ° C, l'eau commence à se sublimer loin et les vers ne tache pas ainsi). Si les lames sont conservées à -80 ° C, laisser «réchauffer» sur la glace sèche pendant 10 minutes avant de craquer.
12. Passez à l'étape 3 (fixation).

2B. Préparation des lames de nématodes individuels

1. Placez un morceau de métal plat sur la glace sèche pour preccolline.
2. Utiliser un pic de ver de transférer les nématodes individuels à une goutte d'eau sur une plaque NGM pour les libérer de bactéries. Nématode (s) doit être bien nourri pour diminuer autofluorescence, si possible. Répétez le transfert de nouvelles taches d'eau que nécessaire jusqu'à ce ver (s) sont exempts de bactéries.
3. Étiqueter côté givré des diapositives de polylysine «bas» avec encre et placer les lames indélébiles sur le comptoir à côté de récipient avec de la glace sèche, étiquette vers le haut. Un nombre égal de "top" moins adhérente de diapositives (non traités) disponibles.
4. Placez une goutte d'eau pi 5-10 sur la région de la lame à double fond traités avec de la polylysine. Utiliser le plus grand volume, si le transfert vers d'autres, pour empêcher l'eau de s'évaporer avant son achèvement.
5. Transférer le ver (s) à la goutte d'eau à la reprise de ver, à l'aide du microscope pour voir que les vers s'enfoncent de toucher la surface de glissement collant. Transférer aussi peu que un ver à un maximum de 20 + vers par goutte.
6. Tenez les s de fondlide dans une main et placer la lame supérieure sur la lame de fond de sorte que toutes les parties gelées mais se chevauchent.
7. Immédiatement et soigneusement (sans glisser ou de compression) mettre les lames sur la pièce de métal sur la glace sèche. Garder sur la glace sèche pour 5-30 min. (Ne pas stocker ces diapositives à long terme, comme les lames sécher facilement sur.)
8. Passez à l'étape 3 (fixation).

3. Fixation

Fixateurs sont nécessaires pour «réparer» l'antigène en place dans la cellule, soit par précipitation ("fixation lumière") ou de réticulation («fixation dur") l'antigène. Fixation peut perturber antigénicité; anticorps les plus connus fonctionnent mieux avec une condition de fixation particulier. Pour les nouveaux anticorps, une gamme de conditions de fixation doit être testé.

Pour toute fixation, la première étape consiste à faire une solution saline tamponnée au phosphate. Fixer les lames Suivant les nématodes pour la coloration des anticorps en utilisant la méthode A (lumièrefixer à l'aide de méthanol et d'acétone) ou B (de correctifs plus difficile en utilisant du formaldéhyde ou du glutaraldéhyde).

1. Préparer une solution 10x PBS (tampon phosphate salin) stock stérile, en ajoutant 80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 27,2 g de Na ₂ HPO ₄ • H ₂ 0, 2,4 g de KH ₂ PO _4, 20 ml 10% azoture de sodium actions. Pour rendre cette solution mère, peser azoture de sodium en poudre pour obtenir une solution à 10% dans de l'eau distillée deux fois. Remuer avec une solution saline à feu doux jusqu'à dissolution. ATTENTION: sec azoture de sodium est réactif et toutes les formes sont toxiques. Porter un masque et des gants pour travailler avec de l'azoture de sodium sec ou solutions.
2. Laissez refroidir saline (Tris pH est sensible à la température), puis le pH à 7,2 avec du NaOH 1-10. Top à 1 L avec de l'eau distillée deux fois et autoclave pour stériliser. Conserver à température ambiante et diluer à 1x au besoin avec de l'eau distillée stérile doublement. ATTENTION: NaOH est corrosif - porter des gants lors de l'utilisation.

3A. Fix lumière en utilisant du méthanol et d'acétone

1. Mettre methanol à 100%, 100% d'acétone, et 1x solution saline tamponnée phosphate (PBS) dans les cuves de coloration sur la glace de prérefroidissement pendant au moins 10 min. ATTENTION: Le méthanol et l'acétone sont toxiques, gants portent.
2. Prenez une paire de bas et haut diapositives de la glace sèche, rapidement tordre part, et plonger immédiatement le "fond" slide dans la glace méthanol froid pendant 2 min. La diapositive "top" peut être jeté.
3. Transfert diapositives à partir de méthanol à la glace de l'acétone froid pendant 4 min. Si les diapositives ont beaucoup de vers, la plupart (90%) va tomber dans le correctif, même avec les lames les mieux préparés. Si les lames de vers simples ont été bien préparés, les vers devraient rester collé.
4. Placez ou tremper les lames dans le bocal avec du PBS (à rincer fixateur) et passez à l'étape 4 (coloration).

3B. Disque correctifs à l'aide de formaldéhyde ou du glutaraldéhyde

1. Diluer réactif formaldéhyde de qualité ou une solution de glutaraldéhyde dans PBS 1x à 0,5-4% concentration finale. Des aliquotes (1,5 ml) may être stockés hermétiquement fermé à -20 à -30 ° C; décongeler échantillons sur la glace juste avant de l'utiliser. REMARQUE: Les solutions de formaldéhyde se dégradent au fil du temps et à l'exposition à l'air. ATTENTION: le formaldéhyde et le glutaraldéhyde sont toxiques, porter des gants et de travailler dans la hotte.
2. Prenez une paire de bas et haut diapositives de la glace sèche, rapidement tordre part, et placer immédiatement le "fond" slide avec des vers dans le plat à plat avec couvercle. (La lame supérieure peut être écartée).
3. Pipeter immédiatement 200 ul fixateur toxique sur le centre de la zone de la glissière par des vers. Le fixateur sera partiellement geler en place, puis fondre pour couvrir une plus grande région de la diapositive.
4. Si les vers ne sont pas totalement couverts avec un fixateur, ajouter immédiatement et soigneusement plus fixateur aide d'une micropipette. Ne pas laisser le fixateur de s'écouler sur le bord de la glissière.
5. Couvrir le plat avec un couvercle et laisser reposer 10 minutes à une nuit à température ambiante. Assurez-vous que le plat est humidifié si longues incubations are utilisée - ce qui peut être fait en ajoutant lingettes non pelucheux humides pliés à plat. Ne laissez pas les lingettes touchent les diapositives.
6. Après fixation est complète, la pipette soigneusement le fixateur de vers libres dans un tube de 1,5 ml et plonger la lame dans un pot de coloration avec du PBS.
7. Spin le tube avec des vers qui sont venus en vrac à grande vitesse pendant 30 secondes pour obtenir un culot. Rincer les vers deux fois avec du PBS, puis de traiter en parallèle avec les vers sur les lames (faisant des étapes dans des tubes à centrifuger, plutôt que sur des lames).
8. Passez à l'étape 4 (coloration).

4. Anticorps Coloration

Le protocole anticorps de coloration est similaire à des protocoles standard pour tous les tissus sur les lames. Ce protocole est le même pour toutes les lames indépendamment de la préparation dans les étapes 1 à 3.

1. Préparer le tampon d'anticorps par mélange de 700 ml d'eau doublement distillée, 100 ml de 10x PBS, 5 ml de Triton X-100 (0,5% final), 2 ml d'EDTA 0,5 M pH 8 (1 mM final), 1 g de BSA (0,1% final), az de sodium à 5 ml à 10%solution ide (0,05% final). pH à 7,2 avec HCl, puis ajouter de l'eau distillée deux fois à 1 L; conserver à 4 ° C.
2. Préparer Bloc en reconstituant le sérum d'âne avec de l'eau bidistillée, puis en ajoutant 5 ml de sérum de 45 ml de tampon d'anticorps (sérum finale de 10%).
3. Préparer Solutions d'anticorps primaires et secondaires en diluant l'anticorps dans un tampon d'anticorps plus 1% de BSA. Dilutions recommandées sont 1:50-1:2,000 pour les anticorps primaires et 1:1,000-1:5,000 des anticorps secondaires (Cy3or OG488 des anticorps d'âne conjugués contre les espèces utilisées pour soulever anticorps primaire).
4. Préparer DAPI en mélangeant 2,5 mg / ml dans de l'eau distillée deux fois, conserver dans 8 aliquotes congelées à -30 ° C. ATTENTION: DAPI est un colorant liaison à l'ADN toxique, porter des gants au moment du pesage et de distribution en aliquotes.
5. Préparer 10 ml de milieu de montage en mélangeant 200 mg de gallate de n-propyle, 0,3 ml Tris 1 M pH 9, 2,7 ml d'eau bidistillée dans un tube conique de 15 ml. On chauffe à 65 ° C pendant environ 10 minutes jusqu'à dissolution.Ajouter 7 ml de glycérol et une aliquote de 8 pi de DAPI et vortex bien. moyen aliquote en tubes de 1,5 ml, envelopper dans du papier, et de stocker dans l'obscurité à 4 ° C (à la fois l'air et de la lumière dégrade le milieu - si elle devient plus jaune, jeter dans les déchets Biohazard). ATTENTION: n-propyle gallate est un anti-oxydant réactif, porter des gants pendant la pesée.
6. Transfert de diapositives à un pot de coloration avec bloc pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 ° C (la nuit préférable correctif dur). Évitez de secouer pour éviter de perdre des vers.
7. Transfert glisse à coloration pot avec anticorps primaire ou placer les lames à plat dans un plat humidifié et garnir d'100-500 anticorps primaire ul. Incuber les lames pendant une nuit à 4 ° C sans agitation.
8. Après anticorps primaire incubation, le transfert se glisse à coloration pot de PBS.
9. Filtrer par bloc entonnoir recouverte de papier filtre et conserver à 4 ° C, si stériles filtrés tous les 1-2 semaines, l'édifice peut être réutilisé pour une ou plusieurs mois. De même, filtrer et enregistreranticorps primaire à 4 ° C pour la réutilisation (jusqu'à 10 tours ou plus de coloration).
10. Rincer les lames trois fois (~ 20 min chacun) dans un tampon d'anticorps.
11. Placer les lames dans un anticorps secondaire dans un récipient de coloration étanche à la lumière et incuber 4 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
12. Transfert glisse à coloration pot de PBS. Filtre et sauver anticorps secondaire à 4 ° C pour la réutilisation (jusqu'à 10 tours ou plus de coloration).
13. Rincer les lames trois fois (~ 20 min chacun) dans un tampon d'anticorps.
14. Transfert de glisse PBS et laisser dans du PBS (minutes à une nuit à 4 ° C) avant d'être prêt à monter.
15. Travailler rapidement sur des diapositives individuelles, de sorte que les vers sur l'avant de la glissière restent humides. Retirer les lames du PBS, sécher dos de la lame avec un chiffon non pelucheux, et placer sur une serviette de papier.
16. Lieu ~ 20 pi de milieu de montage sur les vers de sorte qu'il n'y parties approximativement égales moyennes et PBS sur la glissière et l'inclinaison coulissant doucement pour mélanger les deux solutions. ACPPUION: Milieu de montage est toxique.
17. Tilt Slide bord afin dépoli est plus faible et rassemble près de glaçage solution, puis placez un bord de 24 x 60 mm lamelle sur la solution.
18. Abaissez doucement la lamelle de minimiser les bulles d'air (qui augmentent le blanchiment et perturbent l'affichage). Si des bulles se forment, soulever le bord de la lamelle lentement, puis relower sans glisser la lamelle à travers les vers.
19. Sécher délicatement le bord de la diapositive sans bouger la lamelle, en comprimant les bords avec un chiffon non pelucheux. Le bord relativement sec de la diapositive doit être visible tout autour du bord de la lamelle
20. Sceller la lamelle avec 2-3 couches de vernis à ongles. Diapositives peuvent être placés dans un support de diapositives à plat pendant la préparation et le stockage à l'abri de la lumière. Une fois diapositive est bien scellé et sec, nettoyer la lamelle et le dos de la lame.
21. Diapositives bien fermés peuvent être maintenus dans l'obscurité pendant des jours à 4 ° C ou semaines à -20 ° C. Sur de longues périodes, DAPI staining de l'ADN et la plupart des colorants verts (par exemple 488 nm excitation) fondu. Refermer la lamelle avec plus de vernis à ongles que nécessaire, par exemple, après avoir utilisé une lentille à immersion d'huile.

Representative Results

Lorsque les vers sont bien compressés, fissuré, et légèrement fixés, la quasi-totalité ver peut être accessible à la coloration des anticorps (voir la figure 2). La localisation des noyaux, comme indiqué par la coloration DAPI indique quelles parties de la vis sans fin sont intacts Lorsque les vers sont soumis à un fixateur plus dur, tel que le formaldehyde, la morphologie de la vis sans fin peut être déformée (comme montré par l'apparition anormalement ondulé de l' muscles dans les figures 3A-D). Un autre problème commun est inégale fixation ou la pénétration de tissus particuliers. Un exemple de ceci est illustré sur les figures 3E-H, lorsque le muscle est coloré seulement dans une partie de la vis sans fin, en dépit du fait que la présence d'autres taches, y compris coloration de l'ADN, indique qu'au moins une partie du corps était présent ( c'est à dire, pas éliminée lors de congélation-fissuration). Le motif résultant de la coloration partielle peut être aisément identifiée à la pratique, de sorte que l'ensemble du DISTRIBUTIsur la coloration peut être déterminé même si un seul ver montre une coloration inégale.

Problèmes fréquemment rencontrés avec le gel de craquage en utilisant n'importe quel état ​​de fixation sont illustrés dans la figure finale (figure 4). Le problème le plus fréquent est la torsion de l'échantillon en raison du mouvement relatif des deux lames lors de la compression. Le fait que le corps de la vis sans fin est tordu juste en arrière du pharynx peut être vu par la morphologie des tissus colorés. Cette image montre également le problème de coloration de fond, en raison de l'anticorps coller à la poly-lysine revêtement de la diapositive. Notez, cependant, que toutes ces images ont été recueillies à l'aide de diapositives réalisées au cours des premières tentatives anticorps de coloration de premier cycle dans un cours de laboratoire de biologie cellulaire. Même avec la pratique, beaucoup de vers individuels montrer les problèmes rencontrés dans la figure 4. Cependant, sur une diapositive, vers comme ceux vus sur les figures 2 et 3 peuvent être fond et examiné.

Figure 1. Description des procédures. Diagramme indiquant les étapes à effectuer la procédure complète de gel-fissuration. Alternatives pour les conditions et les numéros de vers fixation variées sont indiqués.

Figure 2. Légèrement fixes, vers le bien-colorées chefs de deux hermaphrodites adultes fixes avec du méthanol et d'acétone et étiquetés avec plusieurs anticorps et colorants:. A) anticorps primaire de Chat (choline acétyltransférase) et anticorps secondaire conjugué à Cy3, B) DAPI (ADN bleu) , C) Mineraigon Green 488 anti-GFP (protéine fluorescente verte), D) montre la superposition (avec deux marqueurs cholinergiques, Cy3 anti-Chat et Cy5-anti-VAChT (de transporteur vésiculaire de l'acétylcholine) représenté en rouge). Cette souche transgénique (PS4657) exprime une fusion de traduction entre la GFP et AJM-1, qui se trouve au pharynx jonctions apicales. Les images sont des projections maximales de série d'images confocale; barre d'échelle est de 50 um.

Figure 3. images distorsions de formaldéhyde associée. formaldéhyde adultes fixes colorées avec Cy3 phalloidin (lie l'actine filamenteuse), DAPI (ADN bleu), et de l'Oregon Green 488 anti-GFP. J.-C.) Fours du corps juste en arrière de la vulve (à gauche) dans le même nématode, montrant une morphologie anormalement ondulé en raison de la distorsion dansproduit par fixation. A) Red-phalloidin montre légèrement irrégulière morphologie musculaire. B) Les noyaux (bleu) sont bien réparties sur le ver. C) vert montre la distribution d'un DEC-1 protéine :: GFP de fusion dans la membrane plasmique de la cellule de gaine gonadique, entraîné par le lim-7 promoteur (souche MD701). D) Affiche la superposition de ces trois colorants. EH) étiquetage peut varier avec différents colorants sur le même nématode. E) phalloïdine (rouge) étiquettes seulement une partie de le muscle d'un côté de la vis sans fin. F) des noyaux (bleu) sont présents tout au long de la vis sans fin (bien que teinté avec une intensité inégale). G) La OG488-anti-GFP étiquettes de collagène-19 :: GFP dans la cuticule d'un côté de la vis sans fin qui manque de coloration du tissu musculaire plus central, indiquant que le muscle est présente, mais pas de coloration sur une surface. H) Cela montre la superposition des trois colorants. Les images sont maxprojections de iMAL de série d'images confocale; barres d'échelle sont de 50 um.

Figure 4. larve distorsions de compression associée. formaldéhyde fixe colorées avec A) Cy3-phalloïdine (lie l'actine filamenteuse), B) au DAPI (bleu de l'ADN), C), Oregon-Green-488 anti-GFP, D) superposition. La torsion du corps juste en arrière du pharynx est évident, que la cellule d'excrétion vert et chaîne nerveuse ventrale croix sur le reste du corps. Coloration de fond élevée est également apparente avec Cy3 phallodin. Cette souche exprime un VHA-8 :: protéine de fusion GFP, situés principalement dans la cellule excréteur. Les images sont des projections maximales de série d'images confocale qui s'étendait à la surface de la lame (conduisant à coloration de fond élevée); barre d'échelle est de 50 um.

Discussion

Le protocole de congélation-craquage est l'un de plusieurs procédés pour la coloration des anticorps pour C. elegans. C'est un moyen relativement simple pour colorer les vers, mais ne nécessite réactifs spécifiques et pratique pour des résultats optimaux. Les étapes critiques (décrites dans la figure 1): 1) la préparation des lames (voir les étapes 1 et 2) la compression manuelle des nématodes (voir les étapes 2 et 3) la fixation rapide (voir l'étape 3). Tout d'abord, afin de maximiser l'adhérence des nématodes sur les lames, il est préférable de préparer des diapositives avec un poids moléculaire élevé (long de polymère) de la polylysine, au lieu de s'appuyer sur des lames préparés commercialement. Diapositives commerciales sont revêtues de polylysine pour permettre aux cellules d'adhérer, tandis que les diapositives de gel-fissuration sont conçus pour coller à la cuticule des nématodes entiers. En second lieu, la procédure de compression correcte des vers de terre entre les lames avant la congélation est critique. Il nécessite des mains et de la pratique régulière d'appuyer sur les lames ensemble en utilisant la bonne quantité depression de sorte que chaque ver contact avec les deux lames sans détruire leur morphologie. Trop ou trop peu de compression conduit à une perte accrue des vers lors de la fixation. D'autres soins est nécessaire pour déplacer les diapositives sur la surface glacée de la glace sèche pour la congélation sans déplacer les diapositives rapport à l'autre. Toute motion fera les vers de déchirer ou se tordent. Troisièmement, comme avec n'importe quelle technique de fixation, les vers congelés doivent être placés directement dans le fixateur avant la décongélation. Sinon, l'antigène peut diffuser, fournissant des informations trompeuses sur la localisation subcellulaire. Si ces étapes critiques sont tout fait correctement, pour obtenir les meilleurs résultats, il est toujours nécessaire de numériser plusieurs lames colorées pour trouver des vers avec la meilleure morphologie.

Un aspect inévitable de cette technique est que les vers sont compressés dans une dimension. La compression est plus visible chez les adultes, où le diamètre apparent de la ronde du corps dans l'axe z peut être seulement une à quatree que vu dans les x et y axes. Cette compression a tendance à diminuer dans les larves plus petites, et peut être négligeable dans les embryons. En raison de la façon dont les nématodes vivants se déplacent pendant la préparation des lames, les vers sont souvent colorées sur les côtés. Cela imite l'orientation des vers plats sur gélose, avec la ligne médiane latérale allongée s'étendant vers le bas au milieu de la vis sans fin souillé (voir les figures 2-4). Ainsi, la compression est en général dans la dimension latérale. Même si cela rend effectivement la microscopie à fluorescence norme plus facile (plus de l'échantillon seront simultanément mis au point), cela signifie que les reconstructions 3-D ne seront pas précis.

Comme avec n'importe quelle coloration d'anticorps, il est important de vérifier la spécificité de la liaison. Dans la plupart des espèces, ceci est réalisé par des commandes telles que l'affinité appauvrissant votre anticorps ou n'utilisant pas de primaire. Dans C. elegans, un moyen plus précis de la vérification de la spécificité sont souvent disponibles. Mutants nuls pour le gène et la protéine d'intérêt fournissentun excellent contrôle de la spécificité de la coloration. Les deux souches doivent être fixés dans des conditions identiques avant la comparaison, car la coloration est généralement fixation dépend. Si aucun mutant nul n'est disponible, il est relativement facile de C. elegans de diminuer les niveaux de protéines avec l'ARNi (ARN de l'inhibition de la ¹²⁾ et rechercher diminué coloration dans ARNi vers traités.

Des anticorps polyclonaux présentent souvent une coloration non-spécifique, même si l'affinité avec l'antigène purifié. Souvent, la fixation de lumière en utilisant du methanol et de l'acétone (qui fixent les protéines en les précipitant au lieu de les réticuler) donne une coloration non spécifique plus faible que le formaldehyde ou le glutaraldéhyde (qui génèrent plusieurs variantes dues à divers épitopes de reticulation) ^1,11. Cependant, dans C. elegans coloration non-spécifique est très commun dans toutes les conditions de fixation, en particulier dans l'intestin. Si votre antigène est exprimé dans l'intestin, cette coloration non spécifique peut masquer votre staini spécifiqueng. Si mutants nuls sont disponibles pour votre protéine, puis vers fixes avec cette méthode peuvent être utilisés pour affinité épuiser votre sérum. Depuis antigénicité dépend des conditions de fixation, les vers que vous utilisez pour épuiser votre anticorps doivent être préparés de la même manière que les vers de type sauvage vous coloration. Après un tour de l'épuisement de la coloration non-spécifique, et les vers mutant de type sauvage peut être teinté en parallèle avec le sérum appauvri pour un bon contrôle. Série supplémentaire de l'épuisement avec des mutants peut être fait tant que de besoin.

Cette technique est très utile pour tester de nouveaux anticorps pour la coloration spécifique et sous une variété de conditions. Ceux-ci peuvent être des anticorps générés contre C. elegans des protéines ou des anticorps générés contre les protéines conservées provenant d'autres espèces. Bien que cette méthode donne la meilleure morphologie des nématodes légèrement fixes, il est relativement simple d'essayer une gamme de fixateurs pour déterminer quelles conditions, le cas échéant, donner des résultats spécifiquess. Contrairement à d'autres méthodes de fixation disque utilisant le formaldéhyde ou le glutaraldéhyde, enzymatique ou réduire les traitements ne sont pas nécessaires pour la préparation des échantillons. Étant donné que ces traitements peuvent diminuer l'antigénicité, ce qui augmente la capacité d'identifier des anticorps spécifiques et de leurs conditions de fixation optimums. Si les conditions de fixation des disques qui fonctionnent le mieux, l'expérimentateur peut alors se tourner vers des méthodes effectuées sur des vers intacts pour obtenir une meilleure morphologie (résumées dans nos travaux précédents ^4). Si la fixation lumière préserve l 'antigénicité, cette technique peut être utilisée pour tous renseignements coloration pour la microscopie optique.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable