Summary
"Freeze-cracking", um método para expor os tecidos internos do nemátodo C. elegans para anticorpos para localização de proteínas, é demonstrada.
Abstract
Para manchar C. elegans com anticorpos, a cutícula relativamente impermeável deve ser contornado por métodos químicos ou mecânicos. "Freeze-cracking" é um método usado para puxar fisicamente a cutícula de nematóides comprimindo nematóides entre duas lâminas de aderentes, congelá-los, e puxando os slides separados. Congela-craqueamento proporciona uma maneira simples e rápida para obter acesso aos tecidos sem tratamento químico e pode ser utilizado com uma variedade de fixadores. No entanto, isso conduz a uma perda de muitas das amostras e a compressão necessária distorce mecanicamente a amostra. Prática é necessária para maximizar a recuperação de amostras com boa morfologia. Congela-craqueamento pode ser optimizado para as condições específicas de fixação, a recuperação de amostras, ou a coloração não específica baixos, mas não para todos os parâmetros de uma vez. Para anticorpos que requerem condições de fixação muito rígidos e tolerar os tratamentos químicos necessários para permeabilizar quimicamente a cutícula, tratamentt de nemátodos intactas em solução pode ser preferida. Se o anticorpo requer uma posição mais clara ou se as condições de fixação ideais são desconhecidas, congelar-cracking fornece uma maneira muito útil para analisar rapidamente o anticorpo e pode render informações específicas localização subcelular e celular para o antígeno de interesse.
Introduction
Para determinar a localização celular e subcelular de proteínas, os cientistas têm tradicionalmente marcado tecidos com anticorpos seleccionadas para reconhecer especificamente um especial proteínas. Em alguns organismos modelo, como C. elegans, coloração do anticorpo foi frequentemente substituído por técnicas de genética molecular, que produzem resultados mais rapidamente. Estes incluem a transformação de organismos com construções que consistem de fusões de genes entre as regiões de codificação do gene de interesse e proteína fluorescente verde e promotor. No entanto, as técnicas moleculares estão sujeitas a um número de artefactos, incluindo problemas com a saber o verdadeiro promotor e alterações na expressão de construções no número de cópias alto (as técnicas usuais em C. elegans) 2,3. Portanto, a coloração com anticorpos continua a ser uma meta para muitos cientistas que estudam a função da proteína in vivo.
A coloração de tecidos com anticorpos pode ser difícil, uma vez que umtibodies só pode reconhecer o seu antígeno em uma determinada conformação 1. Por exemplo, os anticorpos podem reconhecer apenas antígeno desnaturado ou intacto fixo de uma maneira particular e pode não reconhecer o antígeno in situ. O problema de coloração do anticorpo em nemátodos é exacerbado pelo facto de a cutícula do nemátodo forma uma barreira relativamente impermeável, impedindo o acesso dos anticorpos aos tecidos.
Existem vários métodos diferentes usados para a coloração do anticorpo em C. elegans (revisado em nosso trabalho anterior 4). Para manchar intactas 'vermes', métodos foram desenvolvidos para congelar e descongelar em um fixador relativamente duro (formaldeído ou glutaraldeído), os ciclos de congelamento e descongelamento ajudar a quebrar a cutícula para permitir a rápida penetração do fixador 5. Após a fixação, a cutícula foi permeabilizadas para permitir a penetração do anticorpo; métodos incluído o tratamento com agentes, colagenase, ou ambos 5-7 redução. Estes treatments preservada morfologia, mas o reconhecimento de anticorpos frequentemente reduzido ou destruído. Os métodos alternativos incluem a dissecção 8 para permitir a penetração do anticorpo.
"Freeze-cracking" é um meio de ganhar acesso ao interior do semi-sem-fim para permitir que o anticorpo intacto de coloração 9-10. Congela-craqueamento pode ser realizada com uma variedade de condições de fixação, evitando tratamentos de colagenase e de redução. Os nemátodos são colocados entre duas lâminas de adesivos, congelado, e, em seguida, as lâminas são separadas, deixando a maior parte do nemátodo na lâmina inferior e a maior parte da cutícula na corrediça superior. A corrediça inferior pode ser colocado em fixador e toda a lâmina com nemátodos aderidas é transferida através do procedimento de coloração do anticorpo. O método não apresenta duas grandes dificuldades. Primeiro, é difícil de aplicar a quantidade correcta de pressão necessária para dividir os nematóides, sem comprometer seriamente deformando-as. Em segundo lugar, muitos dos vermes não vai sassinale a qualquer slide, e serão perdidas no fixador ou lavagens. No entanto, com as lâminas e práticas adequadas, o método irá produzir rapidamente os nemátodos com morfologia razoável que pode ser usado com uma grande variedade de fixadores e anticorpos.
O método pode ser ligeiramente variada, dependendo do objetivo do experimentador. Se a coloração de nemátodos individuais se desejado (por exemplo, para determinar se um único transformante alterou coloração do anticorpo) e, em seguida desliza com adesão máxima (mas maior fundo de coloração) pode ser utilizado, tais como lâminas, obtidos em laboratório com polilisina adicional (ver abaixo). Para formaldeído ou glutaraldeído fixação, lâminas de adesão mais elevados (slides de polilisina preparado em laboratório) devem ser utilizados, uma vez que nematóides aderir mais mal ao polilisina depois dessas fixações. Se tipo selvagem nemátodos estão fixadas com metanol e / ou de acetona, em seguida desliza para baixo com a adesão e menor coloração de fundo deve ser utilizada (comercial ou llâminas aboratory preparado). Se uma variedade de anticorpos e fixadores estão a ser utilizados em laboratório, uma variedade de lâminas podem ser preparadas com antecedência e guardadas até serem necessários.
Após o acesso ao tecido nematóide foi adquirida, procedimentos de coloração de anticorpos seguir métodos padrão (com incubações mais característicos de tecidos em vez de células 1,11).
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Protocol
NOTA: Várias etapas do protocolo são apresentados com opções para set-up e preparação, dependendo das condições específicas de cada ensaio. Para estes casos, as etapas alternativas são apresentados como A, B, C, etc O protocolo com passos alternativos é descrito na Figura 1.
1. Preparação de Slides Polilisina revestidos
Podem ser utilizados três tipos diferentes de lâminas, dependendo da troca desejada entre a facilidade de preparação, a adesão relativa, e a ligação não específica do anticorpo. Detalhes das alternativas de preparação de diapositivos são apresentados abaixo nas etapas 1A-1C, a fim de aumentar a aderência e complexidade. Lâminas preparadas por estes métodos diferentes podem ser usados em conjunto para uma única experiência.
1A. Sem preparação da lâmina
Polilisina revestido lâminas comercialmente disponíveis fornecem baixa adesão e baixo de fundo.
1B. Deslize preparation óptima para a fixação de metanol-acetona
Adesão médio e baixo de fundo.
- Prepara-se uma solução de polilisina por imersão das lâminas: Adicionar 400 mg de peso molecular muito elevado (150.000 - 300.000 D) poli-L-lisina a 200 ml de água bidestilada. Adicionar 2 ml de 10% de estoque de azida de sódio (concentração final 0,1%) como conservante. CUIDADO: seca azida de sódio é reativo e todas as formas são tóxicas. Usar máscara e luvas ao pó de pesagem para fazer 10% de ações em água bidestilada.
- Limpe finais único lâminas de vidro fosco com toalhetes sem fiapos, removendo manchas e partículas. Isto deve ser feito mesmo em lâminas comprados com a designação "previamente limpas."
- Colocar as lâminas back-to-back em um suporte de slide, jar coplin ou outro recipiente coloração slide, mantendo bordas foscas e não muito perfeitamente alinhados (para fazer a separação depois mais fácil). Colocar o suporte fatia na proveta com 70% de etanol (álcool de grau de reagente não é necessário) com HCl a 1% em diágua acalmou ou preencher tina de coloração para o nível de cobertura. Rocha lâminas em solução de um mínimo de 5 minutos. ATENÇÃO: Esta solução é corrosiva, usar luvas. NOTA: Esta solução pode ser reutilizado várias vezes (até vários meses).
- Lavar as lâminas em água corrente destilada por 1 min.
- Lâminas secar completamente em um ambiente livre de poeira ou por colocação em um forno de 40-60 ° C durante 30-60 min ou por se manter durante a noite à temperatura ambiente.
- Incubar as lâminas em solução polilisina (cobrindo partes unfrosted) no balancim para 15 min.
- Repetir a secagem das lâminas.
- Repita polilisina solução de incubação e as etapas de secagem.
- Separe os slides usando um objeto de metal fino, como uma espátula fina de peso. Se forem devidamente respeitados, eles são difíceis de separar. Usar equipamento de segurança adequado (óculos de segurança) e trabalhar no banco de papel superior (para ser descartado após o uso), desde pequenos pedaços de vidro pode voar solta quando lâminas são separadas.
- Armazenar slides em limpoCaixa (livre de poeira) slides a 4 ° C até ser necessário.
1C. Deslize a preparação ideal para a fixação em formol
Maior adesão, mas de alta fundo.
- Colocar as lâminas preparadas com método 1B plana e em um forno-safe livre de poeira (para a secagem no forno) ou em uma superfície plana livre de poeira (para secagem do ar).
- Colocar uma gota de 20-60 ul da solução de polilisina no meio de cada lâmina.
- Lâminas secar completamente em forno ou em temperatura ambiente. A polilisina vai deixar para trás ovais pálidos como se evapora. Estes ovais são muito adesivas. Infelizmente, eles também se ligam aos anticorpos primário e secundário, até mesmo após o bloqueio.
- Armazenar slides em limpar caixa de slides (livre de poeira) a 4 ° C até ser necessário.
2. Preparação de congelados Nematode Slides
Prepare nematóides para coloração por enxaguar completamente livre de bactérias através do método 2A (para placas de nematóides) ou2B (para nemátodos individuais).
2A. Preparação de slides de placas de nematóides
- Coloque uma peça plana de metal em gelo seco para prechill.
- Use água destilada e uma pipeta de vidro (diminui a perda de vermes) ou micropipeta para enxaguar worms de placa NGM com bactérias em um microtubo de 1,5 ml. As placas podem ser sincronizados ou misturado as idades, não use placas com muitos dauers (difíceis de roer) ou vermes esfomeados (aumento da autofluorescência) a menos que necessário.
- Lave os vermes 3-4x com água destilada até livre de bactérias. (Para diminuir a perda de vermes usar a mesma pipeta de vidro.) Para agregar vermes, ou deixá-los sentar-se no banco para 3-5 min (para coletar principalmente adultos do fundo do tubo) ou spin 30 segundos a ~ 1.000 rpm (~ 500 g) em uma centrífuga de mesa (para coletar adultos, larva e embriões).
- Remover a maior parte da água do tubo de vermes, deixando cerca de duas vezes o volume de água como vermes (mas o volume total de, pelo menos, 25 ul).
- Tenha um número igual de regulares (limpo, mas não tratados polilisina) slides "top" disponíveis.
- Lugar ~ 25 ul vermes na água no "fundo" de slides aderente e espalham o líquido contendo os vermes sobre a parte central do slide usando o lado do ponta da pipeta.
- Deixe que os vermes se contentar com 30 seg a 2 min. Se o slide é adequadamente pegajoso, as extremidades dos vermes vai ficar como eles em contato com o slide.
- Segure a lâmina inferior em uma mão e coloque a parte superior de slides sobre a lâmina inferior de modo que todos, mas as áreas congeladas são sobrepostos. O líquido deve manter as lâminas ligeiramente afastadas, de modo que os vermes ainda mover-se ligeiramente Não deixe que as lâminas deslizam uns sobre os outros -. Este torce os vermes.
- Cuidadosamente pressione para baixo slevemente no topo slide, usando os polegares e indicadores de cada mão. Com a quantidade ideal de pressão, alguns dos maiores hermafroditas na borda dos slides irá romper, enquanto a maioria dos adultos e larvas entrará em contato com cada slide, mas vai permanecer intacta.
- Imediatamente e com cuidado (sem escorregar) colocar os slides sobre o pedaço de metal em gelo seco. Os slides devem aparecer congelado dentro de um minuto. Manter em gelo seco por 5 minutos até ficar bem gelado.
- Neste ponto, as lâminas podem ser armazenadas numa caixa marcado a -80 ° C durante vários dias. (Se forem mantidos semanas a -80 ° C, a água começa a sublimar distância e os vermes não mancha bem). Se as lâminas são armazenadas a -80 ° C, deixe-os 'aquecer' em gelo seco por 10 min antes de rachar.
- Vá para a etapa 3 (fixação).
2B. Preparação de lâminas de nematóides individuais
- Coloque uma peça plana de metal em gelo seco para PRECcolina.
- Use uma pick verme para transferir nematóides individuais para uma gota de água sobre uma placa NGM para libertá-los a partir de bactérias. Nematóide (s) deve ser bem alimentado para diminuir autofluorescência, se possível. Repita a transferência para novos pontos de água, conforme necessário, até verme (s) estão livres de bactérias.
- Rotular lado fosco dos "de baixo" slides de polilisina com tinta e colocar as lâminas indeléveis no contador ao lado de recipiente com gelo seco, com a etiqueta para cima. Ter um número igual de menos aderente "top" (não tratadas) desliza disponíveis.
- Coloque uma gota mL 5-10 de água na região da lâmina inferior tratado duplo com polilisina. Use o volume maior se transferir mais vermes, para evitar que a água evapore antes da conclusão.
- Transfira o worm (s) para a gota de água com a pick verme, usando o microscópio para ver como os vermes afundar para tocar a superfície da lâmina pegajosa. Transferir tão poucos como um verme para até 20 + vermes por gota.
- Segure o S fundolide com uma mão e coloque o topo deslizar sobre a lâmina inferior de modo que todos, mas as áreas congeladas são sobrepostos.
- Imediatamente e com cuidado (sem escorregar ou comprimir) colocar os slides sobre o pedaço de metal em gelo seco. Manter em gelo seco para 5-30 min. (Não guarde esses slides longo prazo, como os slides seca facilmente para fora.)
- Vá para a etapa 3 (fixação).
3. Fixação
Fixadores são necessárias para "consertar" o antígeno no local na célula, por um ou outro precipitante ("fixação de luz") ou de ligação cruzada ("fixação duro") o antígeno. Fixação pode perturbar antigenicidade; anticorpos mais conhecidas funcionam melhor com uma condição fixação particular. Para os novos anticorpos, uma gama de condições de fixação deve ser testado.
Para qualquer mecanismo de fixação, o primeiro passo é o de preparar uma solução salina tamponada com fosfato. Próxima dose slides com nematóides para coloração de anticorpos usando o método A (luzcorrigir usando metanol e acetona) ou B (correção mais difícil usando formaldeído ou glutaraldeído).
- Prepara-se uma solução 10x PBS (tampão fosfato salino) estoque estéril por adição de 80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 27,2 g de Na 2 HPO 4 • H 2 0, 2,4 g de KH 2 PO 4, estoque de azida de sódio a 20 ml de 10%. Para fazer com que esta solução de estoque, pesam-se azida de sódio em pó para fazer uma solução a 10% em água destilada duas vezes. Mexa salina com calor suave até dissolver. CUIDADO: seca azida de sódio é reativo e todas as formas são tóxicas. Usar máscara e luvas ao trabalhar com azida de sódio seco ou soluções.
- Deixe arrefecer salino (Tris pH é sensível à temperatura), em seguida o pH para 7,2 com NaOH 1-10 H. Top para 1 L com água bidestilada e autoclave para esterilizar. Conservar à temperatura ambiente e diluir a 1x, conforme necessário, com água duplamente destilada estéril. CUIDADO: NaOH é cáustico - use luvas durante o uso.
3A. Correção de luz usando metanol-acetona
- Coloque 100% de metanol, 100% de acetona, e 1 x tampão fosfato salino (PBS), em frascos de coloração em gelo para prechill durante pelo menos 10 min. CUIDADO: O metanol e acetona são tóxicos, use luvas.
- Pegue um par de lâminas inferior e superior do gelo seco, rapidamente torcê-los à parte, e imediatamente mergulhe o slide "fundo" no gelo metanol frio por 2 min. O slide "top" pode ser descartado.
- Transferência de slides de metanol para acetona gelada por 4 min. Se os slides tinha muitos vermes, a maioria (90%) vai cair na correção, mesmo com os slides melhor preparados. Se desliza sem-fim único foram devidamente preparados, os vermes deve ficar aderido.
- Coloque ou mergulhar as lâminas na jarra com PBS (para enxaguar fixador) e vá para a etapa 4 (coloração).
3B. Correção rígido usando formaldeído ou glutaraldeído
- Diluir reagente formaldeído grau ou solução de glutaraldeído em 1x PBS para 0,5-4% de concentração final. Alíquotas (1,5 ml) may ser armazenados bem tapado a -20 a -30 ° C; descongelar alíquotas em gelo imediatamente antes da utilização. NOTA: As soluções de formaldeído degradar ao longo do tempo e com a exposição ao ar. CUIDADO: formol e glutaraldeído são tóxicos, usar luvas e trabalhar no bairro.
- Pegue um par de lâminas inferior e superior do gelo seco, rapidamente torcê-los à parte, e colocar imediatamente o slide "fundo" com vermes no prato raso com tampa. (A corrediça de topo pode ser descartado).
- Imediatamente pipeta 200 uL fixador tóxico sobre o centro da área da corrediça com vermes. O fixador será parcialmente congelar no lugar, então derreter para cobrir uma região maior do slide.
- Se os vermes não são totalmente cobertos com fixador, adicione imediatamente e com cuidado mais fixador usando uma micropipeta. Não permita que o fixador para fluir ao longo da borda do slide.
- Cobrir a placa com uma tampa e deixar durante 10 minutos a durante a noite à temperatura ambiente. Certifique-se o prato é umidificado se incubações mais are usado - isso pode ser feito através da adição de toalhetes sem fiapos molhadas dobradas para o prato. Não deixe que os toalhetes tocar nos slides.
- Após a fixação estiver concluída, pipetar cuidadosamente o fixador com vermes soltas em um tubo de 1,5 ml e mergulhar o slide em uma tina de coloração com PBS.
- Gire o tubo com vermes que vieram soltos em alta velocidade por 30 segundos para sedimentar. Lave os vermes duas vezes com PBS, em seguida, processar em paralelo com os vermes nos slides (fazendo passos em tubos de microcentrífuga, em vez de em lâminas).
- Vá para a etapa 4 (coloração).
4. Anticorpo de coloração
O protocolo de coloração de anticorpo é semelhante para os protocolos padrão para qualquer tecido em lâminas. Este protocolo é o mesmo para todas as lâminas, independentemente de a preparação em passos 1-3.
- Preparar tampão de anticorpo através da mistura de 700 ml de água destilada duas vezes, com 100 ml de PBS 10x, 5 mL de Triton X-100 (0,5% final), 2 ml de EDTA 0,5 M pH 8 (1 mM final), 1 g de BSA (0,1% final), az sódio 5 ml de 10%solução ide (0,05% final). pH para 7,2 com HCl, em seguida, adicione água bidestilada para 1 L; armazenar a 4 ° C.
- Prepare bloco por soro de burro a reconstituição com água bidestilada, em seguida, a adição de 5 ml de soro de 45 ml de tampão de anticorpo (soro final de 10%).
- Preparar soluções de anticorpos primários e secundários diluindo anticorpo em tampão anticorpo mais 1% BSA. Diluições recomendadas são 1:50-1:2,000 de anticorpos primários e 1:1,000-1:5,000 para anticorpos secundários (anticorpos de burro conjugado Cy3or OG488 contra as espécies usadas para aumentar o anticorpo primário).
- Prepare estoque DAPI misturando 2,5 mg / ml em água bidestilada; loja em 8 mL alíquotas congeladas a -30 ° C. CUIDADO: DAPI é um corante de ligação DNA tóxico, usar luvas durante a pesagem e distribuição em alíquotas.
- Preparar 10 ml de Meio de Montagem, misturando 200 mg de galato de n-propilo, 0,3 ml de Tris 1 M pH 9, 2,7 mL de água bi-destilada num tubo de 15 ml. Aquece-se a 65 ° C durante cerca de 10 minutos até dissolver.Adicionar 7 ml de glicerol e uma alíquota de 8 mL de DAPI e vórtice bem. Médio Alíquota em tubos de 1,5 ml, embrulhe em papel alumínio, e guarde em luz, a 4 ° C (ar e luz degradar o meio - se torna-se mais amarela, descarte no lixo Biohazard). CUIDADO: n-propil galato é um anti-oxidante reativo, usar luvas durante a pesagem.
- Transferir as lâminas para uma tina de coloração com o Bloco por 1 hora em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C (overnight preferível para correção difícil). Evite agitação para evitar a perda de worms.
- Transferir as lâminas para coloração frasco com anticorpo primário ou colocar as lâminas planas em um prato umedecido e cubra cada uma com 100-500 anticorpo primário mL. Incubar as lâminas durante a noite a 4 ° C sem agitação.
- Depois de anticorpo primário incubação, transferência desliza a manchas frasco de PBS.
- Filtro de bloco através de funil forrado com papel de filtro e armazenar a 4 ° C; se estéreis filtradas cada 1-2 semanas, Bloco pode ser reutilizado para um ou mais meses. Da mesma forma, filtrar e salvaranticorpo primário a 4 ° C para reutilização (para até 10 ou mais rodadas de coloração).
- Lavar as lâminas três vezes (~ 20 min cada) em tampão de anticorpo.
- Colocar as lâminas em anticorpo secundário de coloração num recipiente à prova de luz e incubar 4 horas a temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Transferir as lâminas para coloração frasco de PBS. Filtro e salvar anticorpo secundário a 4 ° C para reutilização (para até 10 ou mais rodadas de coloração).
- Lavar as lâminas três vezes (~ 20 min cada) em tampão de anticorpo.
- Transferir as lâminas para PBS e deixar em PBS (minutos a durante a noite a 4 ° C) até que esteja pronto para montagem.
- Trabalhar rapidamente em slides individuais, de modo que os vermes na frente de slides ficar molhado. Remover uma lâmina da PBS, secar parte de trás da lâmina com uma limpeza sem fiapos, e coloque sobre toalha de papel.
- Lugar ~ 20 l de meio de montagem sobre vermes para que não haja partes aproximadamente iguais médio e PBS em slides e inclinação deslize suavemente para misturar as duas soluções. CAUTION: Meio de montagem é tóxico.
- Tilt slides borda assim fosco é mais baixo e solução reúne perto de geada, em seguida, coloque uma borda de 24 x 60 mm lamela em solução.
- Abaixe cuidadosamente a lamela para minimizar bolhas de ar (que aumentam branqueamento e atrapalhar a visualização). Se formar bolhas, levantar a extremidade da lamela lentamente, em seguida, relower sem deslizamento da lamela entre os vermes.
- Secar cuidadosamente a borda do slide sem mover a lamela, comprimindo as bordas com uma limpeza sem fiapos. A vantagem relativamente seco da lâmina tem de ser visível ao redor da extremidade da lamela
- Selar a lamela com 2-3 camadas de unha polonês. Slides podem ser colocados em um suporte de slides plana durante a preparação e armazenamento para proteger da luz. Uma vez slide é bem fechado e seco, limpe a lamela e de trás do slide.
- Desliza bem fechados podem ser mantidos no escuro durante dias a 4 ° C ou semanas à temperatura de -20 ° C. Durante longos períodos, DAPI staining de DNA ea maioria dos corantes verdes (por exemplo, 488 nm de excitação) fade. Selar a lamela com mais unha polonês, conforme necessário, por exemplo, após o uso de qualquer lente de imersão em óleo.
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Representative Results
Quando worms são devidamente compactado, rachado, e levemente fixo, praticamente todo o worm pode ser acessível a coloração de anticorpos (ver Figura 2). A localização dos núcleos, tal como indicado por coloração com DAPI indica quais as partes do sem-fim está intacto Quando os vermes são submetidos a um fixador mais difícil, tal como o formaldeído, a morfologia do verme pode ficar distorcida (como pode ser visto pela aparência não natural ondulada do músculos nas Figuras 3A-D). Um outro problema comum é a fixação irregular ou a penetração de tecidos particulares. Um exemplo disto é mostrado nas Figuras 3E-H, em que o músculo é corado apenas em uma parte da lagarta, apesar do facto de que a presença de outras marcações, incluindo coloração de ADN, indica que, pelo menos, parte do corpo estava presente ( isto é, não removidos durante congelamento e rachaduras). O padrão resultante de coloração parcial pode ser prontamente identificado com a prática, de modo que toda a distrno de coloração pode ser determinado, mesmo que um único verme mostra coloração desigual.
Os problemas mais comuns encontrados com o uso de qualquer condição de fixação de quebra de congelamento são ilustrados na figura final (Figura 4). O problema mais comum é de torção da amostra, devido ao movimento relativo das duas lâminas durante a compressão. O facto de o corpo do sem-fim é torcido apenas posterior da faringe pode ser visto pela morfologia dos tecidos corados. Esta imagem mostra ainda o problema com a coloração de fundo, devido ao anticorpo que adere ao revestimento de poli-lisina a corrediça. Note-se, no entanto, que todas essas imagens foram coletadas usando slides feitos durante as primeiras tentativas de coloração de anticorpos de graduação em um curso de laboratório de biologia celular. Mesmo com prática, muitos vermes individuais irão mostrar os problemas apresentados na Figura 4. No entanto, em qualquer uma corrediça, vermes como aquelas vistas nas Figuras 2 e 3 pode ser fundaçõesd e examinado.
Figura 1. Esboço de procedimentos. Fluxograma indicando etapas para executar o procedimento de quebra de congelamento completo. São indicadas alternativas para as condições de fixação variadas e número de vermes.
Figura 2. Levemente fixos, worms bem corados Chefes de duas hermafroditas adultos fixos com metanol-acetona e rotulados com múltiplos anticorpos e corantes: a.) Anticorpo primário para conversar (colina acetiltransferase) e anticorpo secundário conjugado com Cy3, B) DAPI (ADN azul) , C) Minériogon Verde 488-anti-GFP (proteína fluorescente verde), D) mostra a sobreposição (com dois marcadores colinérgicos, Cy3 anti-chat e Cy5-anti-VAChT (transportador vesicular de acetilcolina) como vermelho). Esta linhagem transgênica (PS4657) expressa uma fusão tradução entre GFP e AJM-1, encontrada em faringe junções apicais. As imagens são projeções máximas de série de imagens confocal; barra de escala é de 50 m.
Figura 3. Imagens fixas adultos distorções associadas ao formaldeído. Formaldeído coradas com Cy3-phalloidin (liga actina filamentosa), DAPI (DNA azul) e Oregon Verde 488-anti-GFP. DC) Fours do corpo apenas posterior da vulva (extrema esquerda) no mesmo nematóide, mostrando uma morfologia ondulada anormalmente devido à distorção emduzido por fixação. UM) Vermelho-faloidina mostra morfologia músculo ligeiramente irregular. B) Núcleos (azul) são uniformemente espalhados ao longo do sem fim. C) Verde mostra a distribuição de um CED-1 da proteína de fusão :: GFP na membrana plasmática da célula bainha gonadal, conduzido pelo promotor de lim-7 (estirpe MD701). D) mostra a sobreposição destes três corantes EH) Etiquetagem. pode variar com diferentes corantes sobre a mesma nemátodo. E) faloidina (vermelho) rotula apenas uma porção de o músculo de um lado do sem-fim. F) Núcleos (azul) estão presentes ao longo do sem-fim (embora coradas com intensidade desigual). G) O OG488-anti-GFP etiquetas colagénio-19 :: GFP na cutícula num lado o verme que não tem a coloração do tecido muscular mais central, indicando que o músculo está presente, mas não mancha em uma superfície. H) Mostra a sobreposição dos três corantes. As imagens são maxprojeções imal de série de imagens confocal; barras de escala são 50 mm.
Figura 4. Larva distorções associadas à compressão. Formaldeído fixo corados com A) Cy3-phalloidin (liga actina filamentosa), B) DAPI (DNA azul), C) Oregon-Green 488-anti-GFP, D) de sobreposição. A torção no corpo apenas posterior da faringe é aparente, como a célula excretor verde e ventral do nervo espinhal cruz sobre o resto do corpo. Alta coloração de fundo é também evidente com Cy3-phallodin. Esta estirpe expressa uma VHA-8 :: proteína de fusão GFP, localizada predominantemente na célula excretor. As imagens são projeções máximas de série de imagens confocal que se estendiam até a superfície da lâmina (levando a alta coloração de fundo); barra de escala é de 50 m.
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Discussion
O protocolo de congelamento de craqueamento é um dos vários métodos para a coloração do anticorpo em C. elegans. Ele fornece uma maneira relativamente simples de manchar vermes, mas exige reagentes específicos e prática para os melhores resultados. As etapas críticas (esboçado na Figura 1) incluem: 1) preparação de slides (consulte as etapas 1 e 2) de compressão manual dos nematóides (veja as etapas 2 e 3) de fixação rápida (ver passo 3). Em primeiro lugar, para maximizar a adesão dos nemátodos para as lâminas, é melhor preparar as lâminas de alto peso molecular (de longo polímero) polilisina, em vez de confiar em lâminas comercialmente preparados. Lâminas comerciais são revestidas com polilisina para permitir que as células a aderir, enquanto lâminas de quebra de congelamento são projetados para manter a cutícula dos nematóides inteiras. Em segundo lugar, o processo para a compressão correcta dos vermes entre as lâminas antes da congelação é crítica. Ele requer mãos e prática constante para pressionar os slides em conjunto, utilizando a quantidade correta depressão para que os vermes individuais em contato com ambas as lâminas, sem destruir a sua morfologia. Demasiado ou muito pouco de compressão conduz a um aumento da perda de minhocas durante a fixação. Além disso é necessário cuidado para mover as lâminas na superfície de gelo seco para congelar refrigerada sem mover as lâminas em relação umas às outras. Qualquer movimento fará com que os vermes de rasgar ou torcer. Em terceiro lugar, como acontece com qualquer técnica de fixação, os vermes congelados devem ser colocados diretamente no fixador antes de descongelar. Caso contrário, o antígeno pode difundir, fornecendo informações enganosas sobre localização subcelular. Se estes passos críticos são todos feitos corretamente, para obter melhores resultados, ainda é necessário verificar vários slides manchadas de encontrar vermes com o melhor morfologia.
Um aspecto inevitável desta técnica é que os vermes será comprimido a uma dimensão. A compressão é mais visível nos adultos, em que o diâmetro aparente do corpo redondo no eixo z podem ser apenas um-quatropo que se verificou em x e y-eixos. Esta compressão tende a diminuir em larvas de menor, e pode ser insignificante em embriões. Devido à forma como os nematóides vivem mover durante a preparação de slides, os vermes manchadas são muitas vezes em seus lados. Este simula a orientação de vermes em pratos de agar, com a linha média lateral, encontrando-se que se estende para baixo do meio do sem-fim corados (ver Figuras 2-4). Assim, a compressão é, em geral, a dimensão lateral. Enquanto isso realmente faz a microscopia fluorescente padrão mais fácil (mais do espécime vai estar em foco ao mesmo tempo), isso significa que as reconstruções 3-D não serão precisos.
Tal como acontece com qualquer coloração do anticorpo, que é importante para verificar a especificidade da ligação. Na maioria das espécies, isto é feito por controles, tais como afinidade esgotando o anticorpo ou usando qualquer primário. Em C. elegans, os meios mais específicos para a detecção de especificidade estão frequentemente disponíveis. Mutantes nulos para o gene e proteína de interesse fornecerum excelente controle para a coloração de especificidade. Ambas as cepas deve ser fixado em condições idênticas antes de comparação, já que a coloração é geralmente fixação dependente. Se nenhum mutante nula estiver disponível, então é relativamente fácil em C. elegans para diminuir os níveis de proteína com RNAi (RNA inibição 12) e procurar diminuiu coloração em RNAi vermes tratados.
Os anticorpos policlonais apresentam frequentemente a coloração não específica, mesmo se a afinidade-purificada com o antigénio. Muitas vezes, a fixação de luz, utilizando metanol e acetona (que fixam proteínas precipitando-os, em vez de lhes reticulação) dá a coloração não específica menor do que o formaldeído ou o glutaraldeído (que geram mais epitopos de variantes devido à variada cross-linking) 1,11. No entanto, em C. elegans coloração não específica é muito comum em qualquer condição de fixação, especialmente no intestino. Se o antigénio é expresso no intestino, em seguida, esta coloração não específica podem mascarar a sua staini específicong. Se mutantes nulos estão disponíveis para sua proteína, então vermes fixos com este método pode ser usado para afinidade esgotar o seu soro. Desde antigenicidade depende das condições de fixação, os vermes que você usa para esgotar o seu anticorpo deve ser preparado da mesma maneira que os vermes de tipo selvagem que está a coloração. Após uma ronda de depleção de coloração não específica, mutante e do tipo selvagem vermes podem ser marcadas em paralelo com o soro empobrecido para um excelente controlo. Ronda adicional de depleção com mutantes pode ser feito, se necessário.
Esta técnica é muito útil para testar novos anticorpos para a coloração específica sob uma variedade de condições. Estes podem ser anticorpos gerados contra C. elegans proteínas ou anticorpos gerados contra as proteínas conservadas a partir de outras espécies. Enquanto este método dá a melhor morfologia com nematóides levemente fixos, é relativamente simples de experimentar uma variedade de fixadores para determinar que condições, se houver, dar resultado específicos. Ao contrário de outros métodos de fixação do disco utilizando formaldeído ou glutaraldeído, enzimática ou reduzir os tratamentos não são necessários para a preparação da amostra. Uma vez que estes tratamentos podem diminuir a antigenicidade, isto aumenta a capacidade de identificar anticorpos específicos e as suas condições de fixação óptimas. Se as condições de fixação rígidos funcionam melhor, o experimentador pode, então, voltar-se para métodos realizados em vermes intactos para obter uma melhor morfologia (resumido em nosso trabalho anterior 4). Se a fixação de luz preserva antigenicidade, em seguida, esta técnica pode ser usado para todos as manchas por microscopia de luz.
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Disclosures
O autor declara que não tem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O financiamento foi fornecido pela NSF CCLI # 0633618 e da Universidade de Ohio. Algumas cepas foram fornecidos pelo Caenorhabditis Genetics Center. Pós-graduanda Reetobrata Basu aparece no vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine slide (ESCO brand) | Fisher | 12-545-78 | Sigma brand slides also suitable |
| poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P1524 | IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical |
| single frosted edge slides | Fisher | 48312-002 | Other brands are suitable |
| sodium azide | Sigma | S2002-25G | TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution |
| coplin staining jar | VWR | 47751-792 | Other brands are suitable |
| 5-slide mailer | Electron Microscopy Science | 71549-01 | One of many different brands of small slide holder, suitable for staining |
| Paraformaldehyde | VWR | MK262159 | IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Glutaraldehyde solution, 25% in water | Sigma | G 5882 | IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Other brands are suitable |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | ICN820451 | Other brands are suitable |
| Donkey Serum, lyophilized | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Other brands are suitable |
| Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). |
| n-propyl gallate | Fisher | ICN10274750 | Other brands are suitable |
| DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | D 9542 | TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| Whatman #1 15 cm diameter filters | Fisher | 09805G | |
| Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 thickness is optically best |
| Microscope slide folder | VWR | 48429-092 | Other brands are suitable |
References
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- Mello, C., Fire, A.
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- Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans. Development. 117, 1071-1087 (1993).
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