Summary
يوضح هذه الورقة استخدام المجهر متحد البؤر المسح السريع إلى سلوك الخلية صورة مباشرة من خلال puparium. من خلال ترك حالة العذراء سليمة، وهذا الأسلوب يسمح للمراقبة وقياس العمليات الحيوية في الخلية مرحلة من مراحل التنمية ذبابة الفاكهة التي يصعب دراسة مباشرة.
Abstract
استخدام منذ فترة طويلة من ذبابة الفاكهة نموذجا لخلية والبيولوجيا التطورية قد حقق مجموعة من الأدوات. معا، وقد مكنت هذه التقنيات تحليل الخلية والبيولوجيا التطورية من مجموعة متنوعة من الزوايا المنهجية. التصوير الحي هو أسلوب الناشئة لمراقبة عمليات الخلية الحيوية، مثل انقسام الخلية أو الخلايا المنوية على الحركة. بعد أن الطفرات معزولة في uncharacterized المفترضة البروتينات دورة الخلية أصبح من الضروري أن نلاحظ الانقسام في الموقع باستخدام التصوير الحي. وقد ركزت معظم الدراسات التصوير الحي في ذبابة الفاكهة على المراحل الجنينية التي يمكن الوصول إليها للتلاعب والمراقبة بسبب صغر حجمها وضوح بصري. ومع ذلك، في هذه المراحل دورة الخلية غير عادي من حيث أنه يفتقر إلى واحدة من مراحل الفجوة أو كليهما. على النقيض من ذلك، خلايا الجناح العذراء ذبابة الفاكهة لديها دورة الخلية النموذجية والخضوع لفترة من الانقسام السريع الذي يمتد حوالي 20 ساعة للتنمية العذراء. فمن السهل أن طdentify وعزل الشرانق من المرحلة المناسبة للقبض على الانقسام في الموقع. قدمت تصاعد الشرانق سليمة أفضل مزيج من معرفة منشأ والمتانة أثناء التصوير، مما يسمح للتجارب لتشغيل لعدة ساعات مع تأثير ضئيل على الخلايا الحيوانية وقدرتها على البقاء. الأسلوب يسمح للمراقبة من الميزات صغيرة مثل، أو أصغر من، ويطير الكروموسومات. تعديل إعدادات المجهر وتفاصيل تصاعد مستمر، ويسمح بتمديد إعداد تصور ديناميات غشاء الخلايا المجاورة والبروتينات fluorescently المسمى مثل تويولين. يعمل هذا الأسلوب لجميع البروتينات الفلورية اختبارها ويمكن التقاط ملامح نطاق submicron على مجموعة متنوعة من النطاقات الزمنية. بينما تقتصر على 20 ميكرومتر الخارجي للخادرة مع المجهر متحد البؤر التقليدية، قد يكون هذا النهج لمراقبة البروتين وديناميات الخلوية في أنسجة العذراء في الجسم الحي مفيدة عموما في دراسة الخلية والبيولوجيا التطورية في هذه الأنسجة.
Introduction
ذبابة الخل، ذبابة الفاكهة السوداء البطن، هو نموذج راسخة لدراسة جوانب كثيرة من علم الأحياء. البحوث ذبابة الفاكهة لديها تاريخ غني من التجارب الجينية التي تسمح أشكال متطورة من التلاعب الجيني بما في ذلك التعبير، ضربة قاضية والطفرة. مع ظهور علامات بروتين فلوري، وسعت هذه الدراسات لتشمل ذخيرة من الخلايا والبروتينات في الحيوانات الحية. الجنين ذبابة هو نظام ممتاز لمثل هذه الدراسات كما هو واضح بصريا الصغيرة والسماح العميق، وارتفاع القرار التصوير في الجسم الحي 1-3. وقد أثبتت المراحل الأخرى للتنمية ذبابة إلى أن تكون أقل لين العريكة، والتي تتطلب تخدير 4، تشريح والثقافة على المدى القصير 5،6، أو إنشاء النوافذ في إهاب للتصوير 7،8. هذه المناورات عادة تنازلات التنمية الحيوانية على المدى الطويل أو تؤثر على الحيوانات في الطرق التي تحد من التصوير لفترات قصيرة.
الأنف والحنجرة "> دراسة الطفرات في الجينات الرواية التي تشبه المنظمين دورة الخلية، كان من الضروري العثور على إعداد المناسب لدراسة توقيت والإخلاص من دورة الخلية. منذ يتم اقتطاع معظم دورات الخلايا الجنينية (SM أو S-G2-M) والمسوخ قيد الدراسة لا تظهر العيوب حتى مراحل لاحقة، كان من المهم أن نلاحظ دورة الخلية في الأنسجة مرحلة العذراء. الخلايا الظهارية في خادرة لها دورة الخلية G1-S-G2-M أكثر نموذجية والشرانق من هذه المرحلة هي غير قادرة على حركات العضلات 9. تضمنت نقطة الانطلاق الأولي للتلاعب الشرانق كلها سليمة معربا عن Histone2AV-GFP. وعلى الرغم من التعتيم على ما يبدو من حالة العذراء، وثبت هذا التحضير سليمة لتكون ممتازة على المدى الطويل في مجال التصوير الجسم الحي. هذه التقنية بسيطة يكفي أن الباحثين الجامعيين بشكل روتيني استخدامها لدراسة جوانب الخلية والبيولوجيا التطورية في ذبابة الفاكهة وبعد هذا القرار على ما يرام بما يكفي للسماح التمييز من الميزات مقياس ميكرومتر. مع هذا الأسلوب، والملاحظات من الأحداث على مدى الساعات والدقائق أو الثواني من الممكن ببساطة من خلال تعديل معايير السلاسل الزمنية. أشرطة الفيديو باستخدام الأزرق والأخضر والأصفر والبرتقالي، والأحمر البروتينات الفلورية، أو مزيج من هذه، بذلت. الأهم من ذلك، إذا أخذ الرعاية للحد من كثافة الليزر، حتى التصوير على المدى الطويل ليس له تأثير على التنمية أو بقاء الحيوانات.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. يطير العمل
- الحفاظ على الذباب على مستوى متوسطة دقيق الذرة، دبس أجار الخميرة في درجة حرارة الغرفة 10.
- لالصلبان، وعزل العذارى في غضون 6 ساعة من eclosion. بعد عبور إلى الذكور من النمط الجيني المطلوب، والذباب تغيير في قارورة جديدة كل 3-4 أيام.
ملاحظة: للحصول على هذه التجارب، تم استخدام خط GAL4 A9 لدفع التعبير عن الجينات المحورة في الجناح. ويمكن الحصول على الأسهم تطير من مركز الأسهم في بلومنجتون. الأسهم المستخدمة في هذه التجارب تشمل A9-GAL4 (أز # 8761)، His2Av-GFP (أز # 5941)، اسكتلندا / CYO HsCre (أز # 1092)، UAS-ChRFP-حوض (أز # 25773)، lollibow 11.
2. اختيار وتركيب شرانق
- مرحلة الشرانق إما عن طريق جمعها كما prepupae الأبيض (WPP) وابقائها عند 25 درجة مئوية حتى بلوغهم سن مناسبة أو باستخدام معايير مورفولوجية 12.
- لمراقبة انقسامات الخلية، حدد خادرة التي خضعت مؤخرا رئيس انقلاب للخارج.من هذا الوقت حتى قبل eclosion (في> 96 ساعة)، الشرانق يتم السماح متحرك المراقبة الموسعة مرور الزمن.
- إزالة الشرانق من القنينات عن طريق لمس الأولى لهم مع الفرشاة مبللة بالماء، والانتظار لمدة دقيقة للسماح للمياه لتخفيف لاصقة ثم بلطف والحث لهم على الفرشاة.
- غسل بلطف الشرانق التي اختارتها والحث عليها مع الفرشاة في الماء لإزالة اللاصق الغدة اللعابية والغذاء الجسيمات.
- نقل الشرانق نظيفة إلى طبق بتري 25 ملم مع قاع ساترة (رقم 1 ½ coverslips).
- باستخدام شرائح رقيقة إما الصلصال أو الشمع الأسنان كوسيلة لدعم، جبل الشرانق بحيث الأنسجة من الاهتمام هو الأقرب إلى ساترة.
ملاحظة: في الدراسات وصفها هنا، وقد لوحظ أجنحة العذراء والساقين والبطن histoblasts أو الظهرية notum. في الممارسة العملية، أي نوع من الأنسجة في غضون 20 ميكرون من سطح حالة العذراء هو ملاحظتها. - الشرانق توجيه بعناية بحيث TISSU(ه) من الفائدة موازية لسطح الزجاج ساترة.
- مرة واحدة هي التي شنت الشرانق، واستخدام الفرشاة لنقل طبقة رقيقة من thiodiethylene غليكول (المعنية بنقل البضائع الخطرة) إلى الفضاء بين خادرة وساترة.
ملاحظة: TDG يقلل نثر السطح، يطابق معامل الانكسار من النفط، ويسمح الأكسجين إلى أنسجة تتخلل 13. لا ينصح استخدام الزيوت، كما أنها تميل إلى حرمان الأنسجة من الأوكسجين، مما تسبب في وقف السريع للسلوكيات الخلية.
3. التصوير
ملاحظة: للحصول على التصوير، ومن المرجح أن يكون أساسيا كما confocality يزيل معظم خلفية التعتيم الناجمة عن الإضاءة الشديدة من حالة العذراء المجهر متحد البؤر.
- ضبط الإعدادات على متحد البؤر للحد من تأثير الإضاءة على التنمية العذراء وقدرتها على البقاء. للقيام بذلك، تحقق التوازن بين شدة الإثارة وحساسية المجموعة. تكوين نموذجي للواي التصويرال لايكا SP5 استخدام الماسح الضوئي الرنانة (8،000 هرتز)، قوة الليزر لتعيين 2٪ (10٪ النفاذية للسلطة 20٪)، ومجموعة ذات الثقب إلى 120 ميكرون، وتعيين خط المتوسط إلى 8. سوف تختلف اعتمادا على إعدادات الظروف التجريبية.
ملاحظة: لحل يتميز نطاق وغرامة 40X 63X العدسات والغمر النفط (0.1 ملم مسافة العمل) كما استخدمت بنجاح في هذه الطريقة، على الرغم من أنها تحد من عمق التركيز.
4. تحليل
لتحليل الأطر، ض المداخن أو الأفلام استيراد ملفات البيانات إلى فيجي، والتي لديها أدوات فعالة للعرض، وقياس، وتعديل ملفات للعرض 14. على سبيل المثال تم قياس الوقت لاستكمال الانقسام باستخدام الفاصل الزمني أخذ العينات ومتعددة الأبعاد ومتصفح الصور إلى الخطوة من خلال الأطر بينما يراقب خلية من الطور الأول إلى الطور النهائي. س، ويمكن قياس أبعاد ض ص، وباستخدام أداة القياس. للحصول على تعليمات مفصلة عن البرنامج واستخدامهانظر: http://fiji.sc/Fiji.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلايا في ظهائر كاذب، مثل ذبابة الفاكهة النامية العين، أو طبقة البطين للنظام العصبي المركزي الفقاريات النامية، الخضوع الحركات النووية، ووصف الهجرة النووية interkinetic، في الوقت المناسب مع دورة الخلية. يحدث تكرار الحمض النووي عندما نوى هي عند أو بالقرب من سطح الخلايا القاعدية وأدخل الانقسام عندما تصل نوى السطح القمي 15،16. الخلايا الجناح العذراء تشكيل تقسيم بسرعة أحادي الطبقة ظهارة خلال أول عدة ساعات بعد انقلاب للخارج الرأس. وقد تم جمع البيانات في وضع xyzt من الجناح العذراء في وقت مبكر، مع أقسام كل 2 ميكرومتر في 1 دقيقة فترات. في الناتج 3D الأفلام الانقسام كان ينظر فقط على السطح القمي (الشكل 1A). وأظهرت المقاطع التي اتخذت في أكثر المواقع القاعدية أي علامات على الانقسام (الشكل 1B) ولكن حدثت حركات النووية كما عاد نواة مقسمة حديثا من السطح القمي.
ضمن صفحة = "دائما"> 
الشكل 1. نوى الانتقال إلى الجزء العلوي من ظهارة للقسمة. أقسام الممثل من صورة xyzt متحد البؤر البرية من نوع ذبابة الفاكهة العذراء الجناح معربا عن His2AvGFP. في أعلى معظم أقسام ويمكن رؤية (A) نوى في مراحل مختلفة من دورة الخلية. نوى في الطورية (الأسهم) وفيرة في هذا مجهرية كما هي نواة في الطور النهائي (السهام). في الطائرات أقل من القسم (B) أي دليل على الانقسام الواضح الرغم من وجود تباين في القطر النووية، مما يدل على حالة تكرار الحمض النووي. مقياس بار 10 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لتصور، وقياس، وتحديد ملامح تقسيم الخلايا، والتنمية المطلوبة لإعداد بسيطة لمراقبة الانقسام في الجناح العذراء تعيش ذبابة الفاكهة عن طريق تحليل متحد البؤر من His2AvGFP معربا عن الخلايا. وقد استخدم هذا الأسلوب لتوثيق أن دورة الخلية في الجناح العذراء تحمل أوجه التشابه القوية إلى الخلية دورات في ظهائر كاذب في ذلك نواة التحرك إلى السطح القمي من ظهارة حيث يدخلون الانقسام. بعد الطور النهائي، وانخفاض نوى الظهر في الطبقة الظهارية. وبالتالي، فإن خلايا هذا أحادي الطبقة، على ما يبدو ظهارة الغير منضدة، وتظهر تقتصر interkinetic الهجرة النووية.
التصوير من أسهم وخطوط لخلق brainbow 17 نوع التصوير الحي في ذبابة الفاكهة 11 متاحة للجمهور، أثبتت أن هذا الأسلوب هو تعميم لدراسة الظواهر البيولوجية الأخرى. تم استخدام تقنية الموضحة هنا في إنتاج بنصيحةالسراج على أوقات تتراوح ما بين دقيقة إلى 10 ساعة. إلى حد ما، المعلمات المجهر تختلف مع التجربة. على سبيل المثال، فإن معدل أخذ العينات من الوقت الفاصل بين التصوير يجب أن تتوافق مع طبيعة هذه الظاهرة البيولوجية تحت الملاحظة: لمراقبة انقسامات الخلية، والتي تأخذ عادة حوالي 12 دقيقة من الطور الأول إلى الطور النهائي، وجمع كومة من الصور كل دقيقة هي المناسبة. لمراقبة سلوك أرجل كاذبة خيطية في الخلايا نفسها، أقسام أو مداخن يجب جمعها في فاينر (3 ثانية) فترات.
في ظل ظروف وصفها، لم يلاحظ أي تأثير على البقاء على قيد الحياة أو التشكل من البالغين eclosing بغض النظر عن فترة المراقبة. عندما علامة فلوري هو وفرة منخفضة، وعادة زيادة قوة الليزر. في هذه الحالات، وتقصير مدة الفيلم أو الحد من عدد الأقسام أو ض المداخن، والتعرض أدنى حد ممكن. في ضوابط لتجارب أخرى، وتعريض الأنسجة إلى أقصى كثافة لمدة 5 دقائق لم يالحظر على التشكل أو البقاء على قيد الحياة من الكبار. مددت التصور لتشمل البروتينات الفلورية المفتاحية لمجموعة متنوعة من البروتينات المختلفة الأحمر والأخضر والأصفر والبرتقالي والأزرق والمترجمة إلى غشاء، و / أو ملء السيتوبلازم. وقد لوحظت الميزات في مجموعة submicron على فترات زمنية من ثانية لساعات. وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع لمراقبة وقياس توقيت والإخلاص من الانقسام في نوع والمسوخ البرية (قيد الإعداد).
مرحلة العذراء التنمية ذبابة الفاكهة هي فترة اللدونة الرائعة التي يتم التخلص من شكل اليرقات إلى حد كبير في حين تطور شكل الكبار على منصة الاعدام من الجسم اليرقات. على الرغم من التاريخ الغني، وقد أعاق دراسة التحول منهجيا. على سبيل المثال، استخدام الملاحظة المباشرة لدراسة عمليات التحول الأساسية كانت محدودة بسبب عدم وجود موثوق بها في الجسم الحي الوصول إلى الخلايا والأنسجة أثناء إعادة عرض. والمثير للدهشةمقاربة بسيطة المقدمة هنا يسمح بالوصول إلى هذه الفترة خفي التنمية في ذبابة الفاكهة. هذا النهج هو بسيط يكفي أن الطلاب الجامعيين يمكن أن تتعلم بسهولة واستخدامه وقوية بما فيه الكفاية للسماح الملاحظات من الأنسجة، والخلايا وتنظيم التحت خلوية. لم يتم تحسين المجهر المستخدمة في هذه التجارب لتصوير الأنسجة العميقة، وهكذا مقيدة ملاحظاتنا إلى حد كبير إلى 20 ميكرون الخارجي للخادرة. فمن المرجح أن التقنيات التي تسمح اختراق الأنسجة العميقة، مثل متعدد الفوتون المجهري، من شأنه أن يسمح عمق أكبر بكثير من التصوير وتسمح الدراسة لإعادة ترتيب الهيكلية الداخلية الكامنة التحول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
الكتاب نود أن نعترف أكيرا تشيبا للحصول على الدعم الفكري والدعم المادي، والمخزونات. بفضل جوليا Dallman للتعليق عليه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M.
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C.
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
