Summary
Questo documento dimostra l'uso di una scansione rapida microscopio confocale a comportamenti cella di immagine direttamente attraverso il puparium. Lasciando il bozzolo intatto, questo metodo permette l'osservazione e la misurazione dei processi cellulari dinamiche in una fase di sviluppo Drosophila che è difficile da studiare direttamente.
Abstract
L'uso di lunga data di Drosophila come modello per la biologia cellulare e dello sviluppo ha prodotto una serie di strumenti. Insieme, queste tecniche hanno permesso l'analisi di biologia cellulare e dello sviluppo da diverse angolazioni metodologiche. L'imaging dal vivo è un metodo emergente per osservare processi cellulari dinamici, come la divisione cellulare e la motilità cellulare. Avendo mutazioni isolato in non caratterizzate proteine del ciclo cellulare putative divenne essenziale osservare mitosi in situ utilizzando l'imaging dal vivo. La maggior parte degli studi di imaging dal vivo in Drosophila sono concentrati sulle fasi embrionali che sono accessibili alla manipolazione e l'osservazione a causa delle loro piccole dimensioni e chiarezza ottica. Tuttavia, in queste fasi del ciclo cellulare è insolito in quanto manca di una o entrambe le fasi gap. Per contro, le cellule dell'ala pupa di Drosophila hanno un ciclo tipica cellula e sottoposti ad un periodo di rapida mitosi attraversa circa 20 ore di sviluppo pupa. È facile identify e isolare pupe della fase di catturare mitosi in situ. Montaggio pupe intatta disponibile la migliore combinazione di trattabilità e durata durante l'imaging, consentendo di eseguire esperimenti per diverse ore con un impatto minimo sulla vitalità cellulare e animale. Il metodo permette l'osservazione di caratteristiche più piccolo, o minore di, volare cromosomi. Regolazione delle impostazioni del microscopio e dei dettagli del montaggio, ha consentito l'estensione della preparazione per la visualizzazione dinamica della membrana delle cellule adiacenti e proteine fluorescente come la tubulina. Questo metodo funziona per tutte le proteine fluorescenti testate e in grado di catturare le caratteristiche di scala inferiori al micron su una varietà di scale temporali. Mentre limitato al esterno 20 micron della pupa con un microscopio confocale convenzionale, questo approccio all'osservazione proteine e dinamiche cellulari nei tessuti pupa in vivo può essere generalmente utile nello studio della biologia cellulare e dello sviluppo in questi tessuti.
Introduction
La mosca dell'aceto, Drosophila melanogaster, è un modello affermato per studiare molti aspetti della biologia. Ricerca Drosophila ha una storia ricca di sperimentazione genetica che permette forme sofisticate di manipolazione genetica, tra cui l'espressione, l'abbattimento e la mutazione. Con l'avvento delle etichette proteine fluorescenti, questo repertorio si è ampliato per includere studi sulle cellule e proteine in animali vivi. L'embrione mosca è un ottimo sistema per tali studi è piccolo e otticamente trasparente permettendo profondo, immagini ad alta risoluzione in vivo 1-3. Altri stadi di sviluppo mosca hanno dimostrato di essere meno trattabili, che richiedono l'anestesia 4, la dissezione e la cultura a breve termine 5,6, o la creazione di finestre nella cuticola per l'imaging 7,8. Queste manipolazioni solito compromettono sviluppo animale a lungo termine o influenzano l'animale in modo che limitano imaging per brevi periodi.
ent "> Per studiare nuove mutazioni in geni che assomigliano regolatori del ciclo cellulare, era essenziale trovare un'adeguata preparazione per studiare la sincronizzazione e la fedeltà del ciclo cellulare. Poiché la maggior parte cicli cellulari embrionali sono troncati (SM o S-G2-M) e mutanti in studio non mostrano difetti fino fasi successive, era importante osservare il ciclo cellulare nei tessuti stadio di pupa. delle cellule epiteliali della pupa hanno un più tipico ciclo cellulare G1-S-G2-M e pupe di questa fase sono non capace di movimenti muscolari 9. Il punto di partenza iniziale per manipolazioni inclusa intatta tutta pupe esprimere Histone2AV-GFP. Nonostante l'apparente opacità del bozzolo, questa preparazione intatta rivelata eccellente per lungo termine imaging in vivo. Questa tecnica è semplice basta che i ricercatori universitari abitualmente usano per studiare gli aspetti di biologia cellulare e dello sviluppo in Drosophila, eppure la risoluzione è abbastanza fine per consentire la discriminazione delle caratteristiche scala micrometrica. Con questo metodo, le osservazioni degli eventi più ore, minuti o secondi sono possibili semplicemente regolando i parametri di serie temporali. Video che utilizzano proteine, verde, giallo, arancio, rosso e blu fluorescenti, o combinazioni di questi, sono stati fatti. È importante sottolineare che, se si fa attenzione a ridurre al minimo l'intensità del laser, anche di imaging a lungo termine non ha alcun effetto sullo sviluppo o la vitalità degli animali.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vola lavoro
- Mantenere mosche sul medio farina di mais-agar-melassa, lievito normale a temperatura ambiente 10.
- Per croci, isolare vergini entro 6 ore di eclosion. Dopo aver attraversato ai maschi del genotipo desiderato, il cambiamento vola a nuovi flaconi ogni 3-4 giorni.
Nota: Per questi esperimenti, la linea Gal4 A9 è stato usato per guidare l'espressione dei transgeni nell'ala. Fly azioni possono essere ottenute presso il centro stock a Bloomington. Azioni utilizzati in questi esperimenti includono A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / cyo HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), lollibow 11.
2. Selezione e Montaggio di Pupae
- Fase pupe avviene mediante la raccolta come prepupae bianco (WPP) e tenerli a 25 ° C fino a raggiungere l'età appropriata o utilizzando criteri morfologici 12.
- Per osservare divisioni cellulari, selezionare pupa che hanno recentemente subito la testa eversione.Da questo momento fino a poco prima eclosion (a> 96 ore), pupe vengono immobile permettendo di osservazione prolungato time-lapse.
- Rimuovere pupe dai flaconi per primo toccandoli con un pennello inumidito con acqua, in attesa di un minuto per permettere all'acqua di allentare l'adesivo e poi delicatamente sollecitazione sul pennello.
- Lavare delicatamente pupe scelto da loro incitando con un pennello in acqua per eliminare i di adesivi e prodotti alimentari ghiandole salivari particelle.
- Trasferimento pupe pulito per un piatto 25 millimetri Petri con un fondo coprioggetto (numero 1 ½ lamelle).
- Utilizzando sottili strisce di plastilina sia o cera dentale come supporto, montare pupe modo che il tessuto di interesse è più vicino al coprioggetto.
Nota: Negli studi qui descritti, sono stati osservati ali pupa, gambe, addominali o histoblasts Notum dorsale. In pratica, qualsiasi tessuto entro 20 micron della superficie del bozzolo è osservabile. - Pupe Orient attenzione in modo che il Tissue di interesse è parallela alla superficie coprioggetto di vetro.
- Una volta pupe sono montati, utilizzare un pennello per trasferire un sottile strato di thiodiethylene glicole (TDG) allo spazio tra la pupa e il coprioggetto.
Nota: TDG riduce la dispersione delle superfici, corrisponde l'indice di rifrazione di olio, e permette all'ossigeno di permeare il tessuto 13. L'uso di oli non è consigliato, in quanto tendono a privare i tessuti di ossigeno, causando la rapida cessazione dei comportamenti cellulari.
3. Imaging
Nota: Per l'imaging, un microscopio confocale è probabile che sia essenziale come parafocalità rimuove la maggior parte dello sfondo oscuramento causato da intensa illuminazione del bozzolo.
- Regolare le impostazioni sulla confocale per minimizzare l'impatto dell'illuminazione sullo sviluppo pupa e la redditività. Per fare questo, trovare un equilibrio tra l'intensità dell'eccitazione e della sensibilità della raccolta. Una configurazione tipica per l'imaging with Leica SP5 utilizzato lo scanner risonante (8,000 Hz), potenza del laser impostato a 2% (10% di trasmissione di potenza 20%), insieme pinhole a 120 micron, e la linea medie impostato a 8. Impostazioni variano a seconda delle condizioni sperimentali.
Nota: Per risolvere scala multa offre 40X e 63X lenti ad immersione ad olio (0,1 millimetri distanza di lavoro) sono stati anche utilizzati con successo in questo metodo, anche se limitano la profondità di fuoco.
4. Analisi
Per analizzare i frame, z-stack o film importare i file di dati FIJI, che dispone di strumenti efficaci per la visualizzazione, la misurazione e la modifica di file per la presentazione 14. Ad esempio, il tempo di completare la mitosi è stata misurata utilizzando l'intervallo di campionamento e browser di immagine multidimensionale per scorrere fotogrammi durante la visione di una cellula da prophase a telofase. x, y, z-dimensioni può essere misurata utilizzando lo strumento di misura. Per le istruzioni dettagliate sul software e il suo utilizzovedi: http://fiji.sc/Fiji.
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Representative Results
Cellule in epiteli pseudostratificato, come la sviluppo occhio Drosophila, o lo strato ventricolare del sistema nervoso centrale dei vertebrati sviluppo, subiscono movimenti nucleari, definito migrazione nucleare interkinetic, in fase con il ciclo cellulare. La replicazione del DNA avviene quando i nuclei sono o vicino alla superficie basale e cellule entrano mitosi quando i nuclei raggiungono la superficie apicale 15,16. Le cellule ala pupa formano un monostrato in rapida divisione epitelio durante le prime ore dopo la testa di eversione. I dati sono stati raccolti in modo xyzt da un'ala pupa precoce, tenendo sezioni ogni 2 micron ad intervalli di 1 min. Nella risultante film mitosi 3D è stato visto solo in superficie apicale (Figura 1A). Sezioni adottate a più riprese basali non ha mostrato segni di mitosi (Figura 1B) ma movimenti nucleare si è verificato come i nuclei giudicato divisi restituiti dalla superficie apicale.
Figura 1. Nuclei spostare nella parte superiore dell'epitelio per dividere. Sezioni rappresentative da un'immagine xyzt confocale di wild-type Drosophila pupa ala esprimere His2AvGFP. Al top più sezioni (A) nuclei possono essere visti in diverse fasi del ciclo cellulare. Nuclei in metafase (frecce) sono abbondanti in questa microfotografia come sono nuclei in telofase (punte di freccia). A bassi piani di sezione (B) senza evidenza di mitosi risulta anche se c'è variazione del diametro nucleare, che è indicativo dello stato della replicazione del DNA. Scale Bar 10 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
Per visualizzare, misurare e quantificare le caratteristiche delle cellule in divisione, lo sviluppo necessario di una semplice preparazione per osservare mitosi nell'ala pupa vivente di Drosophila mediante analisi confocale di His2AvGFP cellule che esprimono. Questo metodo è stato usato per documentare che il ciclo cellulare nell'ala pupa somiglianze forti alla cella cicli in epiteli pseudostratificato dal fatto che nuclei mossa alla superficie apicale dell'epitelio cui entrano mitosi. Dopo telofase, nuclei cadere di nuovo nello strato epiteliale. Quindi, le cellule di questo monostrato, a quanto pare non stratificato epitelio, spettacolo limitati interkinetic migrazione nucleare.
Imaging delle scorte e linee create per Brainbow 17 tipo di immagini dal vivo in Drosophila 11 accessibili al pubblico, ha dimostrato che questa tecnica è generalizzabile allo studio di altri fenomeni biologici. La tecnica qui descritta è stata usata nella produzione di videos su tempi che vanno da minuti a 10 ore. In una certa misura, i parametri microscopio variano con l'esperimento. Ad esempio, la frequenza di campionamento di immagini temporizzato deve essere conforme alla natura del fenomeno biologico sotto osservazione: per osservare divisioni cellulari, che tipicamente intorno 12 min da profase a Telofase, raccogliendo una pila di immagini ogni minuto è appropriato. Per osservare il comportamento delle filopodia nelle stesse cellule, sezioni o pile devono essere raccolti a intervalli più fine (3 sec).
Nelle condizioni descritte, nessun effetto sulla sopravvivenza o la morfologia di adulti eclosing stato osservato indipendentemente dal periodo di osservazione. Quando il marcatore fluorescente è di bassa abbondanza, potenza del laser era tipicamente aumentata. In queste situazioni, accorciando la durata del film o riducendo il numero di sezioni o Z-stack, esposizione minimizzato. In controlli per altri esperimenti, esposizione del tessuto di massima intensità per 5 minuti non aveva efficaciat sulla morfologia o sopravvivenza dell'adulto. Visualizzazione stato esteso per includere rosso, verde, giallo, arancione e blu proteine fluorescenti contrassegnate per una varietà di diverse proteine, localizzata alla membrana, e / o il riempimento citoplasma. Caratteristiche della gamma submicronica sono stati osservati su scale temporali da secondi a ore. Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per osservare e misurare la tempistica e la fedeltà della mitosi tipo e mutanti selvatico (in preparazione).
La fase di pupa di sviluppo Drosophila è un periodo di notevole plasticità in cui la forma larvale viene sostanzialmente eliminata mentre la forma adulta sviluppa sull'impalcatura del corpo larvale. Nonostante una ricca storia, lo studio della metamorfosi è stata metodologicamente ostacolato. Ad esempio, l'uso di osservazione diretta per studiare processi metamorfosi sottostante è stato limitato dalla mancanza di accesso affidabile e in vivo alle cellule e tessuti durante rimodellamento. Il sorprendentesemplice approccio qui presentato consente l'accesso a questo periodo criptica dello sviluppo in Drosophila. L'approccio è abbastanza semplice che gli studenti universitari possono facilmente imparare e da usare e abbastanza robusto da consentire osservazioni di tessuti, cellule e organizzazione subcellulare. Il microscopio utilizzato per questi esperimenti non è ottimizzato per l'imaging dei tessuti profondi, e così le nostre osservazioni sono largamente vincolato al esterno 20 micron di pupa. È probabile che le tecniche che consentono la penetrazione nei tessuti più profondi, come la microscopia multi-fotone, permetterebbero una maggiore profondità di imaging e permettere studio dei riarrangiamenti strutturali interni sottostanti metamorfosi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Akira Chiba per il sostegno intellettuale, supporto materiale, e le scorte. Grazie a Julia Dallman per i commenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
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