Summary
Este trabalho demonstra o uso de um microscópio confocal de varredura rápida para o comportamento das células de imagem diretamente através do pupário. Ao deixar o caso de pupa intacto, este método permite a observação e medição de processos celulares dinâmicos numa fase de desenvolvimento de Drosophila que é difícil de estudar directamente.
Abstract
A utilização prolongada de Drosophila como modelo para a biologia celular e de desenvolvimento produziu um conjunto de ferramentas. Em conjunto, estas técnicas têm permitido a análise de células e biologia do desenvolvimento de uma variedade de ângulos metodológicas. Imagens ao vivo é um método emergente para a observação de processos celulares dinâmicos, como a divisão celular ou motilidade celular. Tendo mutações em proteínas isoladas do ciclo celular putativos descaracterizados se tornou essencial para observar a mitose in situ usando imagens ao vivo. A maioria dos estudos de imagem ao vivo em Drosophila têm-se centrado sobre os estágios embrionários que são acessíveis à manipulação e observação por causa de seu pequeno tamanho e claridade óptica. No entanto, nestas fases do ciclo celular é incomum em que falta uma ou ambas as fases gap. Em contraste, as células da asa pupal de Drosophila têm um ciclo celular comum e passam por um período de mitose rápido que mede cerca de 20 horas de desenvolvimento de pupas. É fácil de identify e isolar pupas do palco apropriado para pegar mitose in situ. Montagem pupas intactas a melhor combinação de tratabilidade e durabilidade durante o exame, permitindo experiências de correr por várias horas com um impacto mínimo sobre a viabilidade celular e animal. O método permite a observação de estruturas tão pequenas quanto, ou menor do que, cromossomas voar. Ajuste das definições de microscópio e os detalhes de montagem, permitiu extensão da preparação para visualizar a dinâmica da membrana de células adjacentes e as proteínas marcadas com fluorescência, tais como a tubulina. Este método funciona para todas as proteínas fluorescentes testados e podem captar recursos escala submicrométricas sobre uma variedade de escalas de tempo. Embora limitado ao exterior 20 mM de pupa com um microscópio confocal convencional, esta abordagem para observar proteína e dinâmica celular em tecidos pupa in vivo podem ser geralmente úteis para o estudo da biologia celular e de desenvolvimento nestes tecidos.
Introduction
A mosca do vinagre, Drosophila melanogaster, é um modelo bem estabelecido para o estudo de vários aspectos da biologia. Pesquisa Drosophila tem uma história rica de experiências genéticas que permite formas sofisticadas de manipulação genética, incluindo expressão, knockdown e mutação. Com o advento de rótulos de proteína fluorescente, este repertório foi expandido para incluir estudos de células e proteínas em animais vivos. O embrião da mosca é um excelente sistema para tais estudos, pois é pequeno e opticamente clara permitindo profunda, de alta resolução de imagem in vivo 1-3. Outros estágios de desenvolvimento da mosca provaram ser menos tratável, exigindo anestesia 4, dissecção e cultura de curto prazo de 5,6, ou a criação de janelas na cutícula para imagens 7,8. Estas manipulações geralmente comprometer o desenvolvimento dos animais no longo prazo ou afectar o animal de modo a limitar de imagem para períodos curtos.
ent "> Para estudar novas mutações em genes que se assemelham a reguladores do ciclo celular, é essencial para encontrar uma preparação adequada para estudar o tempo e a fidelidade do ciclo celular. Como a maioria dos ciclos de células embrionárias são truncados (SM ou S-G2-M) e os mutantes em estudo não apresentam defeitos, até estágios mais avançados, foi importante para observar o ciclo celular em tecidos fase de pupa. células epiteliais na pupa tem um ciclo mais típico celular G1-S-G2-M e pupas desta fase são não é capaz de movimentos musculares 9. O ponto de partida inicial para manipulações incluído todo intacta pupas expressando Histone2AV-GFP. Apesar da opacidade aparente do processo de pupa, esta preparação intacta mostrou ser excelente para a longo prazo in vivo de imagens. Essa técnica é simples o suficiente para que pesquisadores de graduação rotineiramente usá-lo para estudar aspectos da biologia celular e de desenvolvimento em Drosophila e ainda a resolução é bom o suficiente para permitir a discriminação de recursos em escala micrométrica. Com este método, as observações dos eventos mais horas, minutos ou segundos são possíveis simplesmente ajustando os parâmetros de séries temporais. Vídeos usando o azul, proteínas fluorescentes verde, amarelo, laranja e vermelho, ou combinações destes, foram feitas. Mais importante, se o cuidado de minimizar a intensidade do laser, mesmo a longo prazo de imagem não tem nenhum efeito sobre o desenvolvimento ou a viabilidade dos animais.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voar Trabalho
- Manter moscas em meio padrão fubá-ágar-melaço de levedura à temperatura ambiente 10.
- Para cruzes, isolar virgens dentro de 6 horas de eclosão. Depois de atravessar a machos do genótipo desejado, mudança voa para novos frascos a cada 3-4 dias.
Nota: Para estas experiências, linha Gal4 A9 foi usado para conduzir a expressão de transgenes na asa. Fly ações podem ser obtidos a partir do centro de estoque em Bloomington. Ações usadas nestes experimentos incluem A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / cyo HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), lollibow 11.
2. Seleção e montagem de pupas
- Estágio de pupa, quer por coletá-los como prepupas branco (WPP) e mantê-los a 25 ° C até atingirem a idade apropriada ou usando critérios morfológicos 12.
- Para observar divisões celulares, selecione pupa que passaram recentemente por cabeça eversão.A partir deste momento até pouco antes da eclosão (em> 96 h), pupas são imóveis permitindo a observação prolongada de lapso de tempo.
- Remover pupas dos frascos pelo primeiro tocá-los com um pincel umedecido em água, à espera de um minuto para permitir que a água para soltar o adesivo e em seguida, delicadamente estimulando-os para o pincel.
- Delicadamente, lave pupas selecionados por cutucando-os com um pincel em água para remover as salivares adesivas glândula e partículas de alimento.
- Transferir pupas limpa para um prato de 25 milímetros Petri com um fundo de lamela (número 1 ½ lamelas).
- Usando tiras finas de massa de modelar ou cera dental ou como um suporte, montar pupas de modo que o tecido de interesse está mais próximo da lamela.
Nota: Nos estudos aqui descritos, foram observados asas, pernas, pupa histoblasts abdominais ou notum dorsal. Na prática, todo o tecido dentro de 20 mM da superfície da caixa de pupa é observável. - Pupas Oriente com cuidado para que o tissue de interesse é paralela à superfície da lamela de vidro.
- Uma vez pupas são montados, usar um pincel para transferir uma camada fina de tiodietilenoglicol (TDG) para o espaço entre a pupa e a lamela.
Nota: TDG reduz a dispersão de superfície, corresponde ao índice de refração do óleo, e permite que o oxigênio a permear o tecido 13. O uso de óleos não é recomendado, já que tendem a privar os tecidos de oxigênio, causando a cessação rápida de comportamentos celulares.
3. Imagem
Nota: Para imagens, um microscópio confocal é provável que seja essencial que o confocalidade remove a maior parte do fundo obscurecimento causada por iluminação intensa do processo de pupas.
- Ajuste as configurações do confocal para minimizar o impacto da iluminação no desenvolvimento de pupas e viabilidade. Para isso, encontrar um equilíbrio entre a intensidade da excitação e da sensibilidade da coleta. Uma configuração típica para wi imagiologiaª a Leica SP5 utilizado o scanner de ressonância (8.000 Hz), potência do laser ajustado para 2% (10% de transmitância de 20% de energia), conjunto de pinhole a 120 micrômetros, linha Média definida a 8. Definições irá variar, dependendo das condições experimentais.
Nota: Para resolver escala fina apresenta 40X e 63X lentes de imersão em óleo (até 0,1 mm de distância de trabalho) também têm sido utilizados com sucesso neste método, apesar de limitar a profundidade de foco.
4. Análise
Para analisar quadros, z-pilhas ou filmes importar os arquivos de dados para FIJI, que tem ferramentas eficazes para a visualização, medição e modificar arquivos para apresentação 14. Por exemplo tempo para concluir a mitose foi medido utilizando o intervalo de amostragem e navegador de imagem multidimensional para percorrer quadros, enquanto observa uma célula de prófase para telophase. x, y, e z, as dimensões podem ser medidos utilizando a ferramenta de medição. Para instruções detalhadas sobre o software e seu usover: http://fiji.sc/Fiji.
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Representative Results
As células em epitélio pseudo, tais como o olho de Drosophila em desenvolvimento, ou a camada do ventrículo do sistema nervoso central em desenvolvimento de vertebrados, são submetidos a movimentos nucleares, denominado migração nuclear interkinetic, no tempo, com o ciclo celular. A replicação do ADN ocorre quando os núcleos são em ou perto da superfície da célula basal e introduzir a mitose quando os núcleos de atingir a superfície apical 15,16. As células asa pupa formar um epitélio monocamada divisão rápida durante as primeiras horas após o chefe eversão. Os dados foram coletados no modo xyzt de uma asa de pupa cedo, tendo seções cada 2 m em intervalos de 1 min. Na mitose filmes 3D resultando só foi visto na superfície apical (Figura 1A). As secções tiradas em locais mais basais não mostrou sinais de mitose (Figura 1B), mas os movimentos nucleares ocorreu como os núcleos recém-divididas devolvido a partir da superfície apical.
Figura 1. Núcleos de se deslocar para a parte superior do epitélio de dividir. Secções representativas de imagem confocal xyzt de tipo selvagem asa pupa Drosophila expressando His2AvGFP de. Na parte superior a maioria das seções (A) núcleos pode ser visto em diferentes fases do ciclo celular. Núcleos em metáfase (setas) são abundantes nesta micrografia como são núcleos em telófase (setas). No planos inferiores da secção (B) sem evidência de mitose é aparente que não haja variação de diâmetro nuclear, o que é indicativo do estado de replicação do ADN. Escala Bar 10 m. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
Para visualizar, medir e quantificar características de células em divisão, necessário o desenvolvimento de uma preparação simples para a observação de mitose na ala de pupa vivo de Drosophila por meio de análise confocal de His2AvGFP expressando células. Este método foi utilizado para demonstrar que o ciclo celular na asa de pupa tem semelhanças fortes para célula no epitélio pseudo ciclos em que se movem os núcleos para a superfície apical do epitélio, onde eles entram em mitose. Após telófase, núcleos cair de volta para a camada epitelial. Assim, as células da presente monocamada, epitélio aparentemente estratificada, mostra limitado interkinetic migração nuclear.
Imagem de ações e linhas criadas para brainbow 17 Tipo de imagens ao vivo em Drosophila 11 disponíveis publicamente, demonstrou que esta técnica é generalizável para o estudo de outros fenômenos biológicos. A técnica aqui descrita foi usada na produção de videOS durante tempos que variam de minutos a 10 horas. Em certa medida, os parâmetros de microscópio variar com o experimento. Por exemplo, a taxa de amostragem de imagens de lapso de tempo deve estar de acordo com a natureza do fenômeno biológico sob observação: para a observação de divisões celulares, que geralmente levam cerca de 12 minutos da prófase para telophase, a coleta de uma pilha de imagens a cada minuto é apropriado. Para observar o comportamento de filopodia nas mesmas celas, seções ou pilhas devem ser recolhidos a mais fina intervalos (3 seg.)
Sob as condições descritas, qualquer efeito sobre a sobrevivência ou a morfologia dos adultos eclosing foi observado independente do período de observação. Quando o marcador fluorescente é de baixa abundância, potência do laser foi tipicamente aumentado. Nestas situações, encurtando a duração do filme ou reduzir o número de seções ou z-stacks, a exposição minimizado. Em controlos para outras experiências, expondo o tecido a intensidade máxima durante 5 minutos não teve eficáciat em morfologia ou a sobrevivência do adulto. A visualização foi alargado para incluir o vermelho, verde, amarelo, laranja e azul proteínas fluorescentes marcadas para uma variedade de proteínas diferentes, localizada na membrana, e / ou preenchendo o citoplasma. Características na faixa submicron foram observadas em escalas de tempo de segundos a horas. Este método tem sido amplamente utilizado para observar e medir o tempo ea fidelidade da mitose no tipo selvagem e mutantes (em preparação).
A fase de pupa de desenvolvimento de Drosophila é um período de plasticidade notável, em que a forma larval é substancialmente eliminado enquanto a forma adulta desenvolve no andaime do corpo larval. Apesar de uma história rica, o estudo da metamorfose foi metodologicamente prejudicada. Por exemplo, o uso da observação directa para estudar o processo de metamorfose subjacente tem sido limitada pela falta de confiança no acesso in vivo para as células e tecidos durante a remodelação. A surpreendentementeabordagem simples aqui apresentado permite o acesso a este período enigmática de desenvolvimento em Drosophila. A abordagem é simples o suficiente para que alunos de graduação pode facilmente aprender e usá-lo e robusto o suficiente para permitir observações de tecidos, células e organização subcelular. O microscópio utilizado para estas experiências não é otimizada para imagens de tecidos profundos, e assim nossas observações são em grande parte restrito ao exterior 20 mM da pupa. É provável que as técnicas que permitem a penetração de tecidos mais profundos, tais como microscopia multi-fotão, permitiria uma maior profundidade de imagem e permitem o estudo dos rearranjos estruturais internas subjacentes metamorfose.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Akira Chiba para apoio intelectual, apoio material, e ações. Graças à Julia Dallman para comentários.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
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