Summary
本文演示了如何使用直接通过蛹壳快速扫描共聚焦显微镜对细胞图像的行为。将其留在蛹壳完好无损，此方法允许观察和动态细胞过程的测量在果蝇发育的阶段，是很难直接学习。
Abstract
长期以来利用果蝇作为模型细胞和发育生物学取得了一系列工具。总之，这些技术已成功地从各种方法论的角度细胞和发育生物学的分析。实时成像是动态观察细胞过程，如细胞分裂或细胞运动的一个新兴的方法。经分离的突变未知推测细胞周期蛋白成为必不可少使用实时成像，观察有丝分裂原位 。在果蝇中最实时成像研究都集中在那些由于它们的小尺寸和光学清晰度访问操作和观察的萌芽阶段。然而，在这些阶段的细胞周期是不寻常的，因为它缺少一个间隙阶段或两者。相比之下， 果蝇蛹翼的细胞具有典型的细胞周期并经过一段快速的有丝分裂横跨约20小时，蛹的发展。很容易我找出并隔离适当阶段蛹赶在有丝分裂原 。安装完好蛹成像过程中提供易处理性和耐用性的最佳组合，使实验来进行数小时对细胞和动物存活率的影响降至最低。该方法允许观测的特征一样小，或小于飞染色体。的显微镜设置和安装的细节调整，允许延长制剂的可视化相邻小区的膜动力学和荧光标记的蛋白，如微管蛋白。此方法适用于所有测试的荧光蛋白，可以在各种时间尺度的把握亚微米尺度特征。虽然仅限于外20微米的蛹与传统的共聚焦显微镜，这种方法观察蛋白质和细胞动力学在蛹体内的组织一般可有用细胞和发育生物学在这些组织的研究。
Introduction
醋蝇， 果蝇 ，是一种行之有效的模型用于研究生物学的许多方面。 果蝇的研究具有遗传实验的丰富的历史，使基因操作的复杂形式，包括表达，敲除和基因突变。同的荧光蛋白标记的出现，这个曲目已经扩大到包括细胞和蛋白质的研究在活的动物。在果蝇胚胎是一个很好的系统，这样的研究，因为它是小，光学透明的，允许深，高分辨率成像在体内 1-3。飞发展的其他阶段已被证明是易于处理的少，需要麻醉4，解剖和短期培养5,6或增设在角质层成像7,8窗口。这些操作通常是妥协的动物发展的长期或影响动物的方式，限制了成像时间很短。
ENT“>为了研究新的突变基因中像细胞周期调控，有必要找到一个适当的准备，以研究细胞周期的时序和保真度。由于大多数胚胎细胞周期截断（SM或S-G2-M）和所研究的突变体没有表现出缺陷，直到后期，观察细胞周期中蛹期的组织是很重要的。上皮细胞在蛹有一个更典型的G1-S-G2-M期细胞周期和现阶段的蛹是不能够肌肉运动9。初始起点操作包含完整的整体蛹表达Histone2AV-GFP。尽管蛹壳的表观不透明度，这完好制剂被证明是优良的长期的体内成像，这种技术是简单以至于本科生科研人员经常使用它来 研究细胞和发育生物学果蝇的方面，但分辨率是好的足以让的微米尺度特征歧视。用这种方法，过小时，分钟或秒事件的观察是可能简单地通过调节时间序列的参数。使用蓝色，绿色，黄色，橙色，和红色荧光蛋白，或这些的组合的视频，已经作出。重要的是，如果小心，尽量减少激光强度，甚至长期成像对发展的动物或生存没有影响。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。飞工作
- 保持苍蝇在室温下10个标准玉米面-琼脂糖蜜酵母培养基。
- 对于十字架，隔离在6小时羽化的处女。穿越到所需基因型的男性后，改变飞行到新瓶每3-4天。
注：对于这些实验，Gal4的线A9被用来驱动转基因的表达在边路。飞股份与股票中心布卢明顿获得。在这些实验中使用的股票包括A9-GAL4（BL＃8761），His2Av-GFP（BL＃5941），在sco / CYO HsCre（BL＃1092），UAS-ChRFP-浴池（BL＃25773），lollibow 11。
2。选择和蛹的安装
- 蛹阶段无论是通过收集它们作为白色预蛹（WPP），保证它们在25℃，直至达到适当的年龄或使用形态学标准12。
- 观察细胞分裂，选择蛹最近经历头外翻。从这时起，直到刚刚羽化（在> 96小时）之前，蛹是不动的，允许延长时间推移观察。
- 先接触他们用沾有水的画笔，等待一分钟，让水松粘合，然后轻轻地督促他们到画笔从瓶中取出蛹。
- 轻轻地用刺戳它们与在水中的画笔除去唾液腺粘合剂和食物颗粒洗选定蛹。
- 转让清洁蛹到25毫米培养皿盖玻片底（数量1个半盖玻片）。
- 采用细条或者橡皮泥或牙科用蜡作为支撑的，安装蛹，让感兴趣的组织是最接近盖玻片。
注意：在这里描述的研究，蛹翅膀，脚，腹部histoblasts或背侧notum已经观察到。在实践中，在20微米蛹壳的表面上的任何组织的观察。 - 东方蛹小心，这样的布甲电子商务的兴趣是平行于玻璃盖玻片表面。
- 一旦蛹安装，使用画笔来一层薄薄的硫代二甘醇（TDG）的转移到蛹和盖玻片之间的空间。
注意：TDG减少表面散射，石油的折射率相匹配，并允许氧气渗入组织13。使用油不建议，因为他们往往剥夺氧气的组织，引起细胞行为的迅速停止。
3。成像
注意：对于成像，共焦显微镜很可能是必要的，因为在共焦除去大部分遮蔽背景所造成的蛹壳的强烈照明。
- 调整的共聚焦设置以最小化照明对蛹发育和存活的影响。要做到这一点，罢工的激励强度和收集的敏感性之间的平衡。成像无线的典型配置第徕卡SP5中使用的共振扫描器（8000赫兹），激光功率设定为2％（20％的功率的10％透射率），针孔设定为120微米，行平均设置为8。设置将取决于实验条件而变化。
注意：要解决精细尺度特征40X和63X油浸镜头（0.1毫米的工作距离）也已成功应用于这种方法，虽然他们限制焦深。
4。分析
为了分析框架，Z-堆栈或电影导入数据文件到斐济，其中有有效的工具来查看，测量和修改文件简报14。例如时间完成有丝分裂使用采样间隔和多维图像浏览器来浏览帧一边看从前期的细胞，以末期进行测定。 x轴，y-和z-维度可使用测量工具来测量。有关软件及其使用的详细说明见：http://fiji.sc/Fiji。
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Representative Results
细胞的假复层上皮，如显影果蝇眼睛，或显影脊椎动物中枢神经系统的心室层，经历核运动，称为interkinetic核迁移，在时间上与细胞周期。当核是在或接近基底表面和细胞进入有丝分裂时细胞核到达顶端面15,16发生DNA的复制。在头外翻后的前几个小时，蛹翼细胞形成一个快速分裂的单层上皮。收集在XYZT模式的数据从早期蛹翼，采取每节2微米以1分钟的间隔。在所得到的3D电影有丝分裂只看到在顶端面（ 图1A）。在更基础的位置采取切片显示有丝分裂的迹象（ 图1B），但发生核运动的新分裂原子核从根尖表面返回。
图1。核移动到上皮细胞分化的顶部。从表达His2AvGFP野生型果蝇蛹机翼XYZT共聚焦图像代表部分。在最上面的部分（A） 的核可以看出，在细胞周期的不同阶段。在中期（箭头）原子核是丰富的在这个显微照片是在核末期（箭头）。在部分（B）的下平面没有证据的有丝分裂是显而易见虽然有变化核直径，这指示DNA复制的状态。比例尺为10μm。 点击这里查看大图 。
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Discussion
可视化，测量和量化分裂细胞的功能，用于通过His2AvGFP表达细胞共聚焦分析的方法观察有丝分裂的果蝇蛹生活机翼的简单准备所需的开发。这种方法被用来记录该细胞周期中的蛹翼熊强的相似性对细胞周期的假复层上皮细胞中的细胞核转移到他们进入有丝分裂的上皮细胞的顶面。以下末期，核回落到上皮细胞层。因此，这种单层，显然不分层上皮细胞，显示的单元格的限制interkinetic核迁移。
可公开获得的股票和brainbow 17型实时成像果蝇 11创建线成像，证明了这种技术推广到其他生物现象的研究。这里所描述的技术是在制作随所用OS超过时间从几分钟至10小时。在一定程度上，在显微镜参数随试验。例如，时间推移成像采样率必须符合的生物现象的本质下观察：观察细胞分裂，这通常需要大约12分钟从前期到末期，收集一堆图像的每一分钟为宜。观察丝状伪足在同一细胞中的行为，部分或堆栈必须在更细的（3秒）的时间间隔来收集。
根据所描述的条件下，观察到不论观察期间对eclosing成人的生存或形态没有影响。当荧光标记物是低丰度的，激光功率通常增加。在这些情况下，缩短了的电影的持续时间或减少部分或z栈，最小曝光的数目。在其他实验中的控件，露出组织，以最大强度5分钟没有EFFECt关于形态的成人或生存。可视化被扩展为包括红色，绿色，黄色，橙色和蓝色标记以各种不同的蛋白质的荧光蛋白，定位于细胞膜，和/或填充的细胞质中。在亚微米范围的功能，观察以上的时间尺度从几秒钟到几小时。该方法已广泛用于观察和测量有丝分裂的时机和保真度的野生型和突变体（筹备中）。
果蝇发育的蛹期是一段非凡的可塑性在其中的幼虫形态基本上被消除，而成人形的幼虫体内的支架的发展。尽管有丰富的历史，变态的研究已经在方法论上受到阻碍。例如，使用直接观察来研究过程底层变态已经通过体内获得重塑过程中的细胞和组织中缺乏可靠的限制。令人惊讶的这里介绍简单的方法使获得发展果蝇的这种神秘的时期。这种方法非常简单，本科生可以轻松地学习和使用它，强大到足以允许组织，细胞和亚细胞组织的意见。用于这些实验的显微镜是不为深层组织成像优化，所以我们的观察结果在很大程度上受限于外20μm的蛹。这是可能的，允许更深的组织穿透，例如多光子显微技术，将允许更大的深度成像和允许相关变态的内部结构重排的研究。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢晃千叶的智力支持，物质支持和股票。感谢朱莉娅Dallman征求意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
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