Summary
Эта статья демонстрирует использование быстро сканирующей конфокальной микроскопии с поведением изображений клеток непосредственно через пупария. Задержите куколки дело нетронутыми, этот метод позволяет наблюдения и измерения динамических процессов клеточных на стадии разработки Drosophila, которые трудно изучать непосредственно.
Abstract
Давние использование дрозофилы в качестве модели для клеточной и эволюционной биологии дало широкий спектр инструментов. Вместе эти методы позволили анализ клеточной и эволюционной биологии из различных методологических углами. Онлайн изображений является новым методом наблюдения динамических процессов клеток, такие как деление клеток или клеточной подвижности. Выделив мутации в неохарактеризованных предполагаемых белков клеточного цикла это стало необходимо соблюдать митоза на месте с помощью живого изображения. Большинство живых изображений исследования у дрозофилы были сосредоточены на эмбриональной стадии, которые доступны для манипуляций и наблюдения из-за их небольшого размера и оптической прозрачности. Тем не менее, в этих стадий клеточного цикла необычен тем, что в нем отсутствует один или оба из фаз разрыв. В противоположность этому, клетки куколки крыла дрозофилы имеют типичный клеточный цикл и пройти период бурного митоза, охватывающую около 20 час из куколки развития. Легко Identify и изолировать куколок соответствующем этапе поймать митоза на месте. Монтаж нетронутыми куколки условии наилучшее сочетание сговорчивости и долговечность во время съемки, позволяя эксперименты для запуска в течение нескольких часов с минимальным воздействием на клетки и животных жизнеспособности. Метод позволяет наблюдать особенности как малые, как, или меньше, чем, летать хромосомы. Регулировка настроек микроскопа и детали крепления, позволило расширение подготовки визуализировать мембранные динамику соседних клеток и флуоресцентно меченных белков, таких как тубулина. Этот метод работает для всех тестируемых флуоресцентных белков и может захватить масштабные особенности субмикронных по множеству временных масштабах. В то время как ограничен наружной 20 мкм куколки с обычным конфокального микроскопа, этот подход к соблюдению белка и клеточных динамику в куколки тканей в естественных условиях в целом могут быть полезны при исследовании клеток и биологии развития в этих тканях.
Introduction
Уксус муха, дрозофилы, является устоявшейся моделью для изучения многих аспектов биологии. Исследования дрозофилы имеет богатую историю генетического эксперимента, который позволяет изощренные формы генных манипуляций в том числе слова, нокдаун и мутации. С появлением флуоресцентный белок этикеток, это репертуар расширилась и теперь включает изучение клеток и белков в живых животных. Муха эмбрион является отличной системой для таких исследований, поскольку это маленькое и оптически ясно позволяя глубоко, с высоким разрешением изображения в естественных условиях 1-3. Другие этапы развития лету оказались менее сговорчивыми, требуя Наркоз 4, вскрытие и краткосрочный культуру 5,6, или создание окон в кутикулу для работы с изображениями 7,8. Эти манипуляции, как правило, компромисс развития животных в долгосрочной перспективе и не влияет на животное таким образом, чтобы ограничить изображений на короткие периоды.
ЛОР "> Для изучения новых мутаций в генах, которые напоминают регуляторов клеточного цикла, необходимо было найти подходящую подготовку для изучения сроков и верность клеточного цикла. Поскольку обрезаются большинство эмбриональных клеточных циклов (SM или S-G2-M) и мутанты изучаемые не обнаруживают дефекты до более поздних стадиях, это не было важно соблюдать клеточный цикл в стадии куколки тканей. эпителиальных клеток в куколки имеют более типичный G1-S-G2-M клеточного цикла и куколки этой стадии не способны мышечных движений 9. Первоначальный отправной точкой для манипуляций включены нетронутыми все куколки, выразив Histone2AV-GFP. Несмотря на кажущуюся непрозрачности куколки случае это нетронутыми подготовка оказалась отлично подходит для долгосрочных в естественных изображений. Эта техника проста Достаточно того, что студенческие исследователи обычно используют его для изучения аспектов клеточной и эволюционной биологии у дрозофилы и все же разрешение является достаточно тонкой, чтобы позволить дискриминацию микрометр масштабных функций. С помощью этого метода, наблюдения событий более часов, минут или секунд возможны просто, регулируя параметры временных рядов. Видео с помощью синих, зеленых, желтых, оранжевых и красных флуоресцентных белков, или их комбинации, были сделаны. Важно отметить, что, если приняты меры, чтобы минимизировать интенсивность лазера, даже долгосрочная изображений не имеет никакого влияния на развитие или жизнеспособности животных.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fly Работа
- Поддерживать мух на стандартной фуражное зерно-агар-патока-дрожжевой среде при комнатной температуре 10.
- Для крестов, изолировать девственниц в пределах 6 часов от вылупления. После пересечения с мужчинами желаемого генотипа, изменение летит к новым флаконах каждые 3-4 дня.
Примечание: Для этих экспериментов Gal4 линии A9 был использован для управления экспрессией трансгенов в крыле. Fly запасы могут быть получены из фондового центра в Блумингтон. Акции, используемые в этих экспериментах, включают A9-Gal4 (BL # 8761), His2Av-GFP (BL # 5941), ШОС / суо HsCre (BL # 1092), UAS-ChRFP-ванна (BL # 25773), lollibow 11.
2. Выбор и монтаж Куколки
- Стадия куколки либо путем сбора их в виде белого предкуколок (WPP) и держать их при 25 ° С, пока не достигнут соответствующего возраста или с помощью морфологических критериев 12.
- Для наблюдения деления клеток, выберите куколки, которые недавно подверглись головы выворачивание.С этого времени, пока непосредственно перед вылупления (в> 96 часов), куколки не неподвижны позволяя расширенный покадровой наблюдение.
- Удалить куколок из флаконов, сначала касаясь их с кистью, смоченной в воде, ожидая в течение минуты, чтобы позволить воде, чтобы ослабить клей, а затем аккуратно подталкивая их на кисти.
- Осторожно промыть выбранный куколок по подталкивая их с кистью в воде, чтобы удалить слюнные железы клейкие и частиц пищи.
- Трансфер чистую куколки, чтобы блюдо 25 мм чашки с покровного нижней (число 1 ½ покровные).
- Использование тонких полосок либо формовочной глины или зубной воск в качестве опоры, крепление куколок так, что ткань представляет интерес находится ближе всего к покровное.
Примечание: В исследованиях, описанных здесь, были обнаружены куколки крылья, ноги, брюшной histoblasts или спинной Notum. На практике любой ткани в 20 мкм от поверхности куколки случае наблюдается. - Ориент куколки так тщательно, что Тканье интерес параллельна поверхности покровного стекла.
- После того, как куколки установлены с помощью кисти для передачи тонкий слой тиодиэтиленгликол (TDG) в пространство между куколки и покровного стекла.
Примечание: TDG уменьшает поверхностное рассеяние, соответствует показатель преломления масла, а также позволяет кислороду проникать в ткань 13. Использование масел не рекомендуется, так как они, как правило, лишает ткани кислорода, вызывая быстрое прекращение клеточных поведения.
3. Изображений
Примечание: Для изображений, конфокальный микроскоп может иметь важное значение, поскольку confocality удалить большую часть затемн фоне вызванного интенсивной освещенности куколки случае.
- Настройка параметров на конфокальной чтобы свести к минимуму воздействие освещения на куколки развития и жизнеспособности. Чтобы сделать это, найти баланс между интенсивностью возбуждения и чувствительности коллекции. Типичная конфигурация для визуализации Wiй Leica SP5 использовал резонансную сканер (8000 Гц), мощность лазера установлен в 2% (10% пропускания от 20% мощности), пинхол набор до 120 мкм, и линия усреднения установлен до 8. Параметры будут меняться в зависимости от условий эксперимента.
Примечание: Для решения прекрасно шкала имеет 40X и 63X Нефть погружения линз (0,1 мм рабочее расстояние) также успешно используемый в этом методе, хотя они ограничивают глубину резкости.
4. Анализ
Для анализа кадров, Z-стеки или фильмы импортировать файлы данных на Фиджи, который имеет эффективные инструменты для просмотра, измерения и изменения файлов для презентации 14. Например время для завершения митоза была измерена с помощью интервал выборки и многомерный браузер изображений пошагово кадров во время просмотра клетку от профазы к телофазе. X-, Y-и Z-размеры можно измерить с помощью измерительного инструмента. Подробные инструкции по программному обеспечению и его использованиесм.: http://fiji.sc/Fiji.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клетки эпителия псевдомногослойного, такие как развивающегося Drosophila глаз, или желудочковой слоя проявляющего позвоночных центральной нервной системы, претерпевают ядерного движений, называемых интеркинетической ядерного миграции во времени с клеточного цикла. Репликация ДНК происходит, когда ядра на поверхности базальной или вблизи и клетки вступают в митоз, когда ядра достичь апикальной поверхности 15,16. Куколки крыло клетки образуют быстро делящиеся монослоя эпителий в течение первых нескольких часов после головы выворачивания. Данные были собраны в режиме xyzt с раннего куколки крыла, принимая разделы каждые 2 мкм на минутные интервалы 1. В результате 3D-фильмов митоза только был замечен на апикальной поверхности (рис. 1А). Разделы, принятые на более базальных местах не было никаких признаков митоза (рис. 1б), но ядерные движения произошло в недавно разделенных ядер вернулся из апикальной поверхности.
Рисунок 1. Ядра перейти к верхней части эпителия разделить. Представительства разделы из xyzt конфокальной образ дикого типа Drosophila куколки крыла, выражающей His2AvGFP. В самой верхней секции (A) ядра можно увидеть в разных фазах клеточного цикла. Ядра в метафазе (стрелки) в изобилии в этой микрофотографии как и ядер в телофазных (наконечники стрел). В низших планах разделе (B) никаких доказательств митоза не видно, хотя есть различия в ядерной диаметра, что свидетельствует о состоянии репликации ДНК. Масштабная линейка 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для визуализации, измерения и количественной характеристики делящихся клеток, необходимый разработки простого подготовки к наблюдая митоза в живом куколки крыла дрозофилы с помощью конфокальной анализа His2AvGFP экспрессирующих клеток. Этот метод был использован для документирования, что цикл клеток в куколки крыла несет сильное сходство с клеточными циклов в псевдомногослойного эпителия в этом ядер переезда в апикальной поверхности эпителия, где они вступают в митоз. После телофазе, ядра упасть обратно в эпителиального слоя. Таким образом, клетки этого монослоя, по-видимому, нестратифицированной эпителия, показывать ограничивается интеркинетической ядерной миграции.
Визуализация общедоступных запасов и линий, созданных для brainbow 17 типа живого изображения у дрозофилы 11, показали, что этот метод распространены на изучении других биологических явлений. Методика описана здесь был использован в производстве смотриОС за времена от нескольких минут до 10 часов. В какой-то степени, параметры микроскопа меняться в зависимости от эксперимента. Например, частота дискретизации покадровой обработки изображений должны соответствовать природе биологического явления под наблюдением: для наблюдения деления клеток, которые обычно принимают около 12 мин от профазы к телофазе, собирая стопку изображений каждую минуту уместно. Чтобы наблюдать за поведением филоподий в одних и тех же клеток, части или стеки должны быть собраны в более тонкой (3 сек) интервалов.
В описанных условиях, не наблюдалось никакого эффекта на выживаемость или морфологии eclosing взрослых независимо от периода наблюдения. Когда флуоресцентный маркер имеет низкой численности, мощность лазера была, как правило, увеличивается. В таких ситуациях, сокращения продолжительности фильма или уменьшения количества секций или Z-стеки, свернутом воздействия. В управления для других экспериментов, подвергая ткани максимальной интенсивности в течение 5 минут не имел эффективнот по морфологии или выживания взрослого. Визуализация была расширена, чтобы включить красный, зеленый, желтый, оранжевый и синий флуоресцентные белки, помеченные на множестве различных белков, локализованных на мембране и / или заполнение в цитоплазму. Особенности в субмикронного диапазона наблюдались над сроками от нескольких секунд до часов. Этот метод широко используется для наблюдения и измерения времени и верность митоза в дикого типа и мутантов (в процессе подготовки).
Стадия куколки развития Drosophila это период значительной пластичности, в котором личиночная форма по существу устраняется в то время как взрослая форма развивается на эшафоте тела личинки. Несмотря на богатую историю, изучение метаморфоза была методологически затруднено. Например, использование прямого наблюдения для изучения процессов, лежащих метаморфозы было ограничено отсутствием надежной в естественных условиях доступа к клеткам и тканям во время реконструкции. Удивительнопростой подход, представленный здесь позволяет получить доступ к этой загадочной период развития у дрозофилы. Подход достаточно прост, что студенты могут легко изучать и использовать его и достаточно прочным, чтобы позволить наблюдения ткани, клетки и субклеточных организации. Микроскоп используется для этих экспериментов не оптимизирован для работы с изображениями глубокой ткани, и так наши наблюдения в значительной степени ограничены к внешнему 20 мкм куколки. Вполне вероятно, что методы, которые позволяют более глубокому проникновению тканей, таких как многофотонной микроскопии позволило бы гораздо большую глубину изображения и позволяют исследование внутренних структурных перестроек, лежащих в основе метаморфоз.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность Akira Chiba для интеллектуальной поддержки, материальной поддержки, и акции. Благодаря Юлии Dallman для комментариев.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly stuff fly pad | Genesee Scientific | 59-114 | for fly anesthetization |
| CO2 gas | Airgas South | CD50 | For fly anesthetization |
| Regulator | Airgas South | CO2 regulator | |
| Fly vials | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Fly culture |
| Drosophila lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Glass bottom dishes #1 1/2 | WillCo Wells BV | For microscopy | |
| Thiodiethylene Glycol | Fluka | 88559 | mountant |
| Modeling clay | art supply store | Support to position pupae against | |
| Paintbrushes | art supply store | To manipulate flies | |
| Fine Forceps, Inox #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | Dumont #5 |
| computer | any | 8 Gb RAM for image/movie analysis | |
| Fiji software | Free ware http://fiji.sc/Fiji | Image analysis software | |
| Confocal microscope | Any fast scanning confocal should be sufficient | ||
| 20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses | any | For imaging tissue, cellular, and subcellular features | |
| Immersion oil (nonfluorescent) | |||
| Stereomicroscope | any | For fly manipulation |
References
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M.
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C.
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
