Introduction
התהליך של אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME) תלוי בהגעה מתוזמן היטב של מרכיבים הרבים של מכונות endocytic בתיווך clathrin לאסוף מטען ולתפעל את קרום הפלזמה לתוך שלפוחית 1-3. CME הוא ביוזמת חלבוני עיוות קרום ומטען מתאם שמגיעים יחד באתרים המתהווים של אנדוציטוזה 1. חלבונים אלה לגייס clathrin חלבון מעיל, אשר מרכיבה לתוך מבנה דמוי כלוב שיוצר את הבור מצופה clathrin (מק"ס) 4. ברגע שהמפלגה הקומוניסטית הסיני מורכב במלואו לצורה כדורית, scission קרום, בעיקר באמצעות פעולה של GTPase הגדול, dynamin, יוצר שלפוחית חופשית מצופה clathrin (CCVs) 5,6. הפנמה זו מעוררת פירוק מהיר של מעיל clathrin, המאפשר רכיבים לשימוש חוזר לסבבים רבים של CME.
הגילוי והאפיון של החלבונים המעורבים בCME כבר מושרשים בbioch המסורתיוטכניקות emical, גנטיות, מיקרוסקופיה 4-6,8. מבחני אלה הובהרו התפקידים ונקודות אינטראקציה של מרכיבי endocytic אלה. למרות שמאוד שימושי להגדרת מרכיבים חיוניים של מכונות סחר, מבחני אלה מוגבלים מאוד בלכידת ההתנהגות הדינמית של רכיבי CME או ריכוז מטען. זוהי מגבלה קריטית, שכן CME הוא מונע על ידי ההרכבה כוריאוגרפיה של קבוצות של מודולים חלבון בצעדים מוגדרים, וכן שינויים קטנים בדינמיקה של אירועי endocytic בודדים יכולים להיות השלכות מצטברות גדולות באנדוציטוזה. יתר על כן, הנתונים אחרונים מצביעים על כך שCCPs הבודד עשוי להיות שונה הן בהרכב ובהתנהגות, המצביעה על כך הרגולציה הפיזיולוגית של תהליך זה היא מאוד במרחב ובמוגבל 9-14 בזמן. לדמיין אירועי endocytic פרט, לכן, הוא חיוני כדי להבין מדוע יש חלבונים מרובים מיותרים מעורבים בCME וb איך אפשר לבקר את החלבונים האלהאותות פיסיולוגיים y להסדיר הפנמת מטען.
כאן אנו מתארים את השימוש בסך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM) להתבונן CME ברמה של הדינמיקה של CCPs הבודד בתאים חיים. TIRFM מסתמך על ההבדל במקדם שבירה בין coverslip הזכוכית וסביבת הנוזל של תאי 15,16. כאשר אור העירור מכוון לתאים של יותר מ הזווית הקריטית, זה בא לידי ביטוי באופן פנימי, יצירת גל חולף ששומר על שדה דק של תאורה המשתרע כ 100 ננומטר מעל coverslip. הדבר מבטיח כי מולקולות הניאון רק בתחום צר זה שמחים. למעשה, זה מאפשר העירור של מולקולות ניאון על או ליד קרום הפלזמה, וממזער את הקרינה מחלקי הפנים של התא. זה מספק רזולוציה יחס וציר z אות לרעש גבוהה באופן משמעותי כדי לחזות אירועים בקרום פלזמה, שיתוףmpared למצבים נפוצים יותר כגון epifluorescence הקונבנציונלי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. אנו גם מתארים, במבוא וברמה מעשית, השימוש בפלטפורמת ניתוח תמונה נפוץ לנתח ולכמת תכונות מורפולוגיות פשוטות ודינמיקה של אירועי endocytic המטען אישיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 ביטוי של מתויג fluorescently CME רכיבים בתאים בתרבית
HEK293 תאים הם תאי מודל שימושיים שהיה בשימוש נרחב כדי ללמוד ביולוגיה GPCR ואנדוציטוזה, ומשום כך הם משמשים כמודלים בפרוטוקול זה. השתמש בכל פרוטוקול transfection מתן ביטוי אחיד ללא ביטוי יתר ורעיל נמוכים.
- לטפל בכל תרבית התאים בזרימה למינרית סטרילי. מלא 4 בארות של צלחת 12 גם עם 1 מ"ל של מדיה חיונית (DMEM) השתנה Dulbecco עם 10% בסרום שור עוברי (FBS). מבקבוק T25 ומחוברות של תאי HEK293 לדלל 1:50, 1:25, 01:16, 01:10 בהתאמה לכל אחד 4 הבארות.
- לחלופין, תאי זרע לצלחת רבות גם של גודל רצוי, לפי הוראות יצרן. זרעי .4-2 x 10 4 תאים לתוך צלחת 12 גם. לגדול תאי לילה ב37 מעלות צלזיוס סטרילי עם 5% CO 2 ולחות 95%.
הערה: בהתחשב בכך שr הצמיחהates משתנה בהתאם לתנאים ושורות תאים, שזה עשוי להיות עדיף על זרע בארות מרובות כדי להבטיח confluency האידיאלית עבור transfection למחרת או את האפשרות של ביצוע transfections בשני עותקים.
- לחלופין, תאי זרע לצלחת רבות גם של גודל רצוי, לפי הוראות יצרן. זרעי .4-2 x 10 4 תאים לתוך צלחת 12 גם. לגדול תאי לילה ב37 מעלות צלזיוס סטרילי עם 5% CO 2 ולחות 95%.
- למחרת בבוקר, בחר גם שהוא ~ ומחוברות 70% עבור transfection (ראה איור 1). אם הגיע לא טוב המצב הזה, לחכות עוד יום.
הערה: confluency 70% היא אידיאלית עבור HEK293 תאים. Transfecting תאים המהווים את תוצאה דלילה יותר במוות של תאים ורעילות. Transfecting תוצאות תאים מעל ומחוברות בביטוי עני. - הוסף 60 μl חיץ EC (מערכת transfection), 400 ng של פלסמידים קידוד מתויג GPCRs ו / או רכיבים של מכונות clathrin, ו2.4 μl של Enhancer לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, כפי שמתואר בפרוטוקול של היצרן. מערבולת למשך 2 שניות כדי להבטיח ערבוב מספיק, ולהסתובב בmicrofuge ב2,000 XG עבור 2 שניות כדי לאסוף את הנוזלים בתחתית.
- הוספה6 μl Effectene כפי שמתואר בפרוטוקול של היצרן. מערבולת למשך 2 שניות, וספין ב2,000 XG עבור 2 שניות בmicrofuge לאסוף את הנוזל בתחתית. חכה ל20 דקות, כדי לאפשר היווצרות של מיצלות המורכבת transfection.
- תקשורת לשאוב מהבאר להיות transfected. בעדינות להוסיף 0.8 מ"ל של DMEM עם 10% FBS לתערובת מגיב transfection ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה באיטיות להפחתת שבירת מיצלות. הוסף את התקשורת ותערובת transfection לטוב מאוד לאט מהצד. להוסיף כל תערובת transfection שנותר מצינור microcentrifuge אל הבאר באמצעות micropipettor.
הערה: לחלופין, להוסיף 0.5 מ"ל נוסף של DMEM עם 10% FBS אל באר transfected לתת תאי תזונה נוספת וכתוצאה מכך transfection העדין וביטוי נמוך יותר חולף. - להחזיר את התאים ל37 מעלות צלזיוס החממה במשך 5 שעות.
- תקשורת לשאוב מכילה תערובת transfection. החלף עם 1 מ"ל של DMEM עם 10% FBS. לאפשרהתאים לגדול בין לילה.
- למחרת, להעביר את התאים לcoverslips ללא ציפוי, מעוקר בעבר על ידי מעוקר.
- הוסף 0.5 מ"ל של בופר פוספט (PBS) עם 1 mM EDTA היטב כל אחד. לחלופין, להשתמש 0.5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA. השאר בחממה במשך דקות 1.
- הנח סיבוב 3, coverslips 25 מ"מ סטרילי לתוך בארות נפרדות של צלחת 6 היטב. ממלא כל היטב עם 2 מ"ל של תקשורת. דחף בעדינות את coverslip עד לתחתית הבאר כדי למנוע מתאים מהגידול בחלקו התחתון של coverslip.
- ידני להתסיס גם כדי להרים את התאים מתחתית הבאר. הוסף 1 מ"ל של DMEM עם FBS 10% לresuspend. הפץ את התאים הרימו מהיטב 1 של 12 גם צלחת באופן שווה בין 3 coverslips. לחלופין, תאי צלחת על 3 מנות עם רצפת זכוכית.
- לאפשר לתאים לגדול על coverslips לפחות 48 שעות לפני ההדמיה. ודא שתאים פרושים ושטוח.
2.TIRFM באמצעות הדמיה המק"ס וDynamics המטען
- נוגדנים נגד דגל המצומד M1 עם צבעי Alexa באמצעות ערכת תיוג חלבון אלקסה פלואוריד על פי הפרוטוקול של הייצור. לחלופין, נוגדנים מראש מצומדות ניתן לרכוש.
- טרום דגירה תאים עם הנוגדנים בדילול 1: 1,000 ב 1 מ"ל של מדיום ליבוביץ מראש חימם עם 10% FBS, או Opti-ממ עם 50 FBS 7.4 ו10% HEPES מ"מ pH 10 דקות ב 37 ° C (הדמיה בינוני), לתייג GPCRs מתויג דגל על פני התא. דלג על השלבים הבאים אם חלבוני ניאון מקודדים גנטיים, כגון GFP, משמשים כתגים (ראה דיון לפרטים נוספים).
- העבר את coverslip לחדר הדמיה לחיות תאים. לחלופין, עבור מנות עם רצפת זכוכית, תקשורת נוגדן תיוג לשאוב ולהוסיף 700 μl של מדיום הדמיה מחומם מראש.
- השתמש בזוג מלקחיים ולכופף את קצה מחט 25 מד לתוך וו.
- להחזיק זוג מלקחיים ביד הדומיננטית. החזק את המחט הכפופה בothאה. הפעל את המחט עד לעקומות הוו מטה לכיוון הזכוכית. בעדינות לגרור את המחט, צד וו למטה, על פני החלק התחתון של צלחת 6 היטב עד שווים על coverslip. יש להיזהר שלא לשרוט את פני השטח של coverslip, כפי שהוא יהיה לנתק את התאים. רם בעדינות את coverslip מתחתית הבאר. לאזן את coverslip נגד קיר של גם לתמיכה.
- השתמש במלקחיים כדי לתפוס ליד הקצה של coverslip ולעבור בצד תא coverslip עד לחדר ההדמיה, ולהרכיב את החדר. הוסף 700 μl (או כמות מתאימה) של מדיום הדמיה מחומם מראש. ידית coverslips בזהירות בלי לחץ כדי למנוע פיצוח או שבירה.
- העבר את התא על מיקרוסקופ ולשמור על הטמפרטורה של התאים על 37 מעלות צלזיוס באמצעות תנור במה או חממה סגורה.
- להביא תאים אל מוקד באמצעות מטרת 100X או 60X TIRF נפט טבילה (1.45 NA ומעלה). תמונת התאים בepifluorescence או נגד קונבנציונלייםמצבי מוקד של תאורה (כלומר, לא TIRFM) כדי לזהות תאים המבטאים את המבנים המתאימים. Out-of-להתמקד תאים הם כמעט בלתי נראים בעומק הדק של תאורת TIRF ולכן קשה למצוא את המטוס ותאי מוקד.
הערה: חלק מהמערכות להשתמש באותו הלייזרים לTIRFM לתמונה בepifluorescence הקונבנציונלי, על ידי הזזת זוית פגיעה של הלייזר מעל הזווית הקריטית. כאמצעי בטיחות חשוב, תמיד להיות מודע לזווית של קרן הלייזר, ותמיד לכוון אותו הרחק מצופה. - פוקוס עד למשטח התחתון של תא להביע עד קווי המתאר של קרום פלזמה סביב התא נעלמים ומרכז התא מופיע. זה בולט במיוחד עם חלבון מטען מקומי קרום פלזמה כגון קולט μ-אופיואידים (ראה איור 2 א).
- לעבור להדמית TIRF.
- אם משתמש באותו לייזרים להדמיה בepifluorescence הקונבנציונלי, להגדיל את הזווית של שכיחות שללייזר עד הקרינה מחוץ לפוקוס בחלק הפנימי של התא נעלם, ולא קווי המתאר של קרום פלזמה סביב התא נראה. (השווה איור 2 ג ל2A דמויות ו2B)
הערה: בTIRFM, נעה מטוס המוקד גורמת תמונה ללכת לגמרי מחוץ לפוקוס ו / או עמום, ורמות הקרינה הכוללות יורדת עקב העומק הקטן יותר של תאורה. לכן, שיטה חלופית כדי לעבור לתאורת TIRFM הוא המוקד הראשון במרכז התא בepifluorescence confocal / קונבנציונלי, ולאחר מכן להגדיל את זוית פגיעה עד שאתה מאבד את רוב הקרינה, ולאחר מכן להתמקד במורד לקרום הפלזמה. - ברגע שבTIRFM, להבטיח לייזר העירור משקף בחזרה דרך האובייקטיבי ואינו נראה מעל המטרה. לאשר זאת על ידי בדיקה אם כתם הלייזר הוא גלוי.
הערה: במצבי epifluorescence או confocal קונבנציונליים, תאורת הלייזר היא נראית מעל המטרה,כמו על התקרה. - לחדד את הפוקוס כדי לקבל תמונה חדה. המרכיבים העיקריים של מכונות endocytic, כגון clathrin, יהיו גלויים בpuncta. התאם את המיקוד על קנס, כך puncta הם עגול כאפשרי.
הערה: לקבלת מטען מקומי קרום, להתאים להתמקד בסדר עד filopodia מופיע מובחן. - השתמש בתכנית רכישה כדי להציל את כל הפרמטרים ההדמיה כגון מראות וזווית TIRF. האם זה עבור כל אורכי הגל הנדרשים.
- אם משתמש באותו לייזרים להדמיה בepifluorescence הקונבנציונלי, להגדיל את הזווית של שכיחות שללייזר עד הקרינה מחוץ לפוקוס בחלק הפנימי של התא נעלם, ולא קווי המתאר של קרום פלזמה סביב התא נראה. (השווה איור 2 ג ל2A דמויות ו2B)
- סריקה סביב coverslip למצוא תאים המבטאים את כל סמני endocytic הרצויים: קולט μ-אופיואידים והמתאם β-arrestin בדוגמא המוצגת באיור 3 א. בחר תאים שמביעים אך לא מעל להביע. ראה דיון לפרטים.
- ברגע שתאים מזוהים, לרכוש תמונות בכל 3 שניות ל10 דקות. זה מספיק כדי ללכוד את כל החיים של המק"ס, מאז החיים של המק"ס הממוצע בHEK293 תאים צילמו בתנאים אלה הוא around 40 שניות 10-11. זה מאפשר על 12-14 מסגרות להתבונן המק"ס. לדוגמא לראות סרט 1. חזרה על כל השלבים לתאים נוספים תמונה.
.3 ניתוח endocytic Dynamics על ידי אימות ידנית
למרות שאימות ידנית של החיים המק"ס מוגבל מאוד על ידי מספר CCPs שניתן לאתרם, זה עדיין נשאר אמצעי מדויק של זיהוי לא נרתע משינויים הגלובליים בחפצי תמונה וזיהוי. ראה דיון לפרטים.
- פתח את הקובץ בImageJ. תמונות מאוחסנות כערימה אחת של קבצי TIFF עם ערוצים רציפים. המרת תמונות לhyperstacks. עבור לתמונה> Hyperstacks> מחסנית לhyperstack. הזן את מספר הערוצים שנרכשו (כלומר, אם ההדמיה β-arrestin וקולט μ-אופיואידים, הזן 2), הזן 1 לערימת Z (TIRFM הוא מטוס יחיד), ומספר הפריימים של הסרט (כלומר 10 דקות סרט ליום 1 במסגרת כל i 3 שניותשל 200) בחלון הקופץ.
- פורמט hyperstack מניב חלון עם שני פסי גלילה. השתמש בסרגל העליון כדי לעבור בין הערוצים והתחתון כדי לעבור זמן. גלול לערוץ של החלבון שמשך חייהם יהיה assayed.
- לעבור למסגרת 10 או 15 של הסרט כדי להקטין את הכללת CCPs קיים מראש המשכים שכל אינם גלויים. לצייר תיבת ROI סביב נקודה שנבחרה באקראי.
- לספור את מספר מסגרות מקום גלוי.
הערה: ראה איור 3 ב ו3C לדוגמאות משלוש קטגוריות מורפולוגיות של אירועי endocytic 10,11,16-19.
.4 ניתוח endocytic Dynamics על ידי הכרה אובייקטיבית
הכרה אובייקטיבית מאפשרת זיהוי של כמעט כל CCPs צילם בתא, אבל יכולה להיות מועדים לטעויות עקב זיהוי מזויף של מבנים שגויים. ראה דיון לפרטים במשקל היתרונות וחסרונות של דוארשיטת ACH. מספר תוכניות, כוללים אלגוריתמים שנבנו מותאמים אישית, עשויות לשמש כדי לזהות באופן אובייקטיבי CCPs. פרוטוקול זה מתאר הכרה אובייקטיבית של CCPs באמצעות Imaris, תוכנת דימוי ניתוח (ראה חומרים).
- כדי להתחיל, לפתוח את קובץ תמונת הגלם בתוכנת דימוי ניתוח. כברירת מחדל, תמונת צבע ממוזגת תופיע. השתמש בחלון "התאמת תצוגה" כדי להתאים את הבהירות של ערוץ. לחץ על השם של ערוץ כדי לשנות את הצבע מוצג. הסר את הסימון מהתיבה שליד הערוץ כדי למנוע התצוגה שלה (ראה איור 4 א).
- צור "כתמים" על ידי לחיצה על הסמל עם כתמים כתומים. ראה איור 4. בחר אזור של העניין (ROI) סביב התא. ראה איור 4C. השתמש בהחזר על השקעה לאי הכללה של אזורים שבצורה לא נכון יהיה לזהות קצוות מובילים בהירים ושלטים. לנתח תאים מרובים עם רמות ביטוי שונות בנפרד.
- מדוד את הקוטר של ספוט לproviהערכות ראשוניות דה לאלגוריתם. עבור למצב "Slice", ולחצו על קצוות קוטביים של מקום כדי למדוד את קוטרו. ראה איור 4E. האם זה עבור 4 או 5 נקודות עגולות שנראות מעידים על המק"ס בשיא יציבותה, לאחר היווצרות ולפני scission. השתמש במדידות אלה כדי לחשב קוטר ממוצע עד לעשירית הקרוב ביותר של מיקרון.
- זיהוי כתמים. לחזור למצב "לעלות". בחר את הערוץ המתאים לגילוי. הזן את הקוטר הנמדד הממוצע, בדרך כלל 0.3 או 0.4 מיקרומטר. לחץ על החץ קדימה הכחול לכמת את כתמים. ראה איור 4E. אם הקוטר של כתמים הוא להמעיט, נקודות מזויפות של הקרינה תהיה מזוהות ככתמים. אם הקוטר גדול מדי, כתמים אמיתיים יהיו להתעלם ממנו. כאשר לא בטוח, מעריך נמוך מעט, ולסנן את התגליות שגויות מאוחר יותר.
- סנן כתמים על ידי איכות. התאם את המסנן כדי ללכוד כתמים רבים ככל האפשר בלי גבקרקע. מסנן האיכות נבחר כברירת מחדל 20. ראה איור 4F.
- השתמש בעקומת "האיכות" כמדריך להגדרת סף מתאים. הזז את הסף התחתון של המסנן עם לחצן העכבר השמאלי כדי לטבול ראשון בעקומה. זוהי נקודת התחלה טובה עבור המסנן, כעמדה זו בדרך כלל מזקקת איתור לכתמים רק נראים לעין. ראה איור 4F.
- כתמים שאותרו מופיעים בסרט כתחומים או פיקסלים מרכז. שימוש בכרטיסייה "הצבעים", להתאים את הצבע של כתמים לצבע מנוגד כדי להפוך אותו קל יותר לראות אותם. גלול בסרט כדי לבחון את כתמים בכל מסגרת. המטרה היא לזהות כתמים רבים ככל האפשר למכלול חייהם.
- לחסל את כתמים עמומים או ידני לחבר אותם למסלולים רציפים בשלב מאוחר יותר, כפי שהם אינם מזוהים היטב באמצעות מהלך חייהם.
- הסר שלטים מוארים עם fil "עוצמה"ter, במידת צורך. לחץ על הסימן הפלוס הירוק להוסיף מסנן חדש. ראה איור 4F. יצירת מסנן עוצמה כדי לסנן באו כתמים של אותות הקרינה שניתנו החוצה. השתמש בעקומה שנוצרה העוצמה, (המקבילה לאיכות Curve דנה ב4.5) כדי לקבוע את הסף. השתמש בלחצן העכבר השמאלי כדי להסיר את הקצה השמאלי הקיצוני של העקומה המייצגת את כתמים הבהירים.
הערה: מבני שלט גדולים הם בדרך כלל בין האלמנטים הבהירים ביותר בתא, והם אינם נכללים בקלות עם מסנן זה. - גלול בסרט על מנת להבטיח שCCPs מזוהים ככתמים והלוחות הבהירים כבר לא זוהו. איור 3D מראה תא שבו זיהוי של CCPs (כונה על ידי כדורים לבנים) היה מותאם עם מסנן האיכות ושלטים הוצאו עם האיכות מסנן.
- להפחית קצות תא בהירים עם מסנן האיכות. אובייקטים מואר עדיין ייתכן שיהיו הצורך להסיר באופן ידני, בשלב הבא. המשך עם הכחולחץ.
- הסר כתמים חריגים במסך כתמי עריכה. Switch to "בחר באפשרות" מצב. לחץ על המקום. זה יהפוך צהוב. לחץ על "מחק". לחץ על החץ הכחול כדי להמשיך לבנות את האלגוריתם. ראה איור 4G.
- מסלולי מידה. להגדיר מסלולים ל" תנועה בראונית. "המפלגה הקומוניסטית הסינית לא צריכה להציג כל תנועה מכוונת, נסחף מינימאלי בלבד על פני קרום הפלזמה. אלגוריתם זה הוא מתאים ביותר לתנועה ש. ראה איור 4H.
- הגדר את המרחק מקסימאלי לערך קטן כגון 0.7 מיקרומטר. ראה איור 4H.
הערה: הגדרת מרחק קטן ממזערת חיבור של כתמים סמוכים ועדיין מאפשרת למעקב מתמשך של נקודת תא דרך המק"ס או תנועת תא. - להגדיר גודל מקסימאלי גאפ ל -1 זה מאפשר מסלול כדי להמשיך אם יש רק אחד מסגרת החסרה ברציפות. לחץ על החץ הכחול לחישוב מסלולים. ראה איור 4H.
הערה: Gגדלי ap של מסלולים שונים יותר מ 3 סיבות להיות מקושרים יחד בצורה לא נכונה. - מסלול מתג צפייה ל" זנב הדרקון. "גלול בסרט התבוננות איכות זיהוי. אם כתמים סמוכים להיות מחוברים, להקטין את המרחק מקסימאלי מתחת 0.7 מיקרומטר. אם כתמים נשברים מדי בקלות, להגדיל את גודל מקס גאפ. לחץ על החץ הכחול כדי ליצור מסלולים. זה מוביל למסך מסלולי מסנן. ראה איור 4H.
- הגדר את המרחק מקסימאלי לערך קטן כגון 0.7 מיקרומטר. ראה איור 4H.
- מסלולי סינון ויצוא נתונים. השתמש במסנן "עוצמה" כדי להסיר פלאק הבהיר נוסף. השתמש במסנן "עקירה" כדי להסיר endosomes שלהיכנס לתחום TIRF. השתמש בזהירות, ככתמים כבר יהיו לי התקות ארוכות יותר גם כן. לחץ על החץ הכפול הירוק כדי להשלים את הפרוטוקול. ראה איור 4I.
- השתמש בכרטיסיית המסלולים ערוך, עם סמל העיפרון, כדי להסיר לתגליות חיוביות כוזבות של מסלולים שלא ניתן להסירו באמצעות מסננים. הגעה לdiscontinuities או קשרי שווא. כדי לחבר בין שני מסלולים, בחר אותם באמצעות Ctrl-שמאל לחץ, ואז ללחוץ על "התחבר" בתיבת מסלולי עריכה. כדי לנתק מסלולים לכתמים נפרדים, לבחור מסלול ופגע "נתק". בחר כתמים מרובים עם Ctrl + שמאל לחץ ולחץ על "התחבר" כדי ליצור מסלול חדש. השיטה היא זהה עבור עריכת כתמים, שתוארו ב4.5.7. ראה איור 4J.
- כדי לייצא נתונים, פתח את כרטיסיית הסטטיסטיקה. לחץ על סמל התקליטון היחיד לייצא נתון שנבחר. לחץ על הסמל שנראה כמו סדרה של תקליטונים כדי לייצא את כל הנתונים הסטטיסטיים. נתון "משך מסלול" מכיל את אורך מסלולי endocytic. ראה איור 4K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש בתאי החיים TIRF מיקרוסקופית יש לנו נרשם דינמיקת endocytic של μ-אופיואידים קולטן (מור), קולטן G-חלבון בשילוב (GPCR) וβ-arrestin חלבון מתאם endocytic. מבנה β-arrestin היה transfected זמני לקו תא מור ביציבות להביע באמצעות הפרוטוקול המתואר באיור 1, וצלם 96 שעה מאוחר יותר. מור בשורת התאים היציב הוא N-סופני מתויג עם GFP pH רגיש. חלבון פלואורסצנטי זה מאיר רק בנוזל החוץ תאי הניטרלי. כמו כן, מור endocytoses רק הופעל בעבר על ידי אגוניסט, ונשאר אחר מתחלק באופן שווה על פני קרום הפלזמה. התמקדות בקרום הפלזמה חסיד שיושב על מכסה הזכוכית בתוצאות מצב confocal בתא כי הוא מלא בעם הקרינה עמומה. זה שונה מהתמקדות במרכז התא, שבו קרום הפלזמה נראה רק כטבעת של הקרינה סביב התא. השווה את השמאלולוחות מימין באיור 2 א. מעבר לepifluorescence או TIRF הקונבנציונלי עם זווית לא נכונה גורם מתוך הקרינה מוקד להתברר באותם תאים כפי שמוצג באיור 2. כאשר זווית TIRF נכונה קרום הפלזמה הוא מאוד חד וברור ובהיר ומתוך הקרינה מיקוד כבר לא משבש את התמונה. להשוות איור 2C ל2A דמויות ו2B.
התמונה ברורה וחדה, כי מור הוא בקרום הפלזמה חסיד, שהוא במידה רבה בתחום TIRF. בניגוד לכך, β-arrestin נשאר בבריכת cytosolic כאשר עדיין לא גויס לpuncta endocytic, ונראה מעורפל ומחוץ לפוקוס כי זה לא בתחום TIRF. ברגע מור מופעל על ידי אגוניסט, β-arrestin מגויס לקרום הפלזמה, ושניהם β-arrestin והקולט להפיץ לCCPs (איור 3 א ו -1 סרט , Β-arrestin בירוק, מור באדום, הכיסוי הוא צהוב).
החיים של הצבירים הללו ניתן לכמת באופן ידני באמצעות שלושה הפרמטרים לאנדוציטוזה הושלמה כמתואר באיור 3. הכתמים המציין CCPs יכולים גם להיעלם לחלוטין (ראה גם איור 3 ג), "למצמץ" ולכבות או "לצבוט את" מבנה גדול יותר. שני התנאים האחרונים מייצגים אירועים שמרחבית קרובים מדי יחד כדי להיפתר כאירועים נפרדים. אלגוריתם זיהוי ספוט בImaris שימושי גם לכמת CCPs, כפי שמתוארים באיור 4. איור 3D מציין CCPs זוהה באמצעות Imaris, לאחר הסינון כדי להסיר מבני שלט שאינו דינמיים. תחומים לבנים מעולף נסמן נקודות שזוהו. כתמי דימר שלא ניתן הייתה לזהות לכל חייהם גם לא נכללו במסנן "האיכות".
">
איור 1: תרשים זרימה של Transfection נוהל. (א) ראשית, זרע מגוון של דילולים (1:50, 1:25, 01:16, 1:10) על צלחת 12 גם. לאפשר לתאים לגדול בין לילה. למחרת, לחפש היטב כי הוא ומחוברות% על 70, ומופץ באופן שווה, כפי שהוא מתואר. זה גם שיהיה transfected. (B) הוסף 60 μl של חיץ EC ו400 ng של DNA לתוך צינור microcentrifuge. וורטקס עבור 10 שניות ולסובב את הנוזל לחלק תחתון של הצינור. הוספת 2.4 μl של Enhancer. מערבולת למשך 2 שניות ולסובב את הנוזל לחלק תחתון של הצינור. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 3 דקות. להוסיף 6 μl של Effectene. מערבולת למשך 2 שניות ולסובב את הנוזל לחלק תחתון של הצינור. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. (C) לאט לאט לערבב 0.8 מ"ל של DMEM עם 10% FBS עם transfection. הוסף לתאים שבנבחרו קודם לכן היטב. דגירה תאים למשך 5 שעות ב37 מעלות צלזיוס. החלף עם טריDMEM עם 10% FBS.
איור 2: מציאת שדה TIRFM. קרום הפלזמה צילם בconfocal (). הפנל השמאלי מתאר תאים בconfocal עם דגש על מרכז התא. קרום הפלזמה נראה רק כ" טבעת "סביב התא. התמקדות עד קרום הפלזמה הבסיסי, בסמוך לcoverslip גורם לתא להיות מלא בעם הקרינה עמומה. "הטבעת" קרום הפלזמה לא צריכה להיות גלויה לעין בתחום TIRF דק יותר. (ב) קרום הפלזמה הבסיסי עם זווית TIRF רדודה ייצור תאורת epifluorescence קונבנציונלי באמצעות המדגם. זה מאיר את כל התא והרבה מקרינת מוקד מהחלק העליון של התא הוא הווה. (C) קרום הפלזמה בTIRF. ההתמקדות בfilopodia עוזרת למצוא את המטוס הזה. שימו לב שזהמטוס אחד חלק. ברים סולם הם 10 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: חזותי וכימותי אירועי endocytic בTIRF. (א) תא המבטא את μ-אופיואידים קולטן (מור) וβ-arrestin לפני ואחרי תוספת של אגוניסט שגורם אנדוציטוזה. אגוניסט גורם חלוקה מחדש של שני החלבונים לpuncta endocytic. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר. (ב ') שלושה סוגים של אירועי endocytic, ראו על ידי לדמיין דינמיקת arrestin, עולה בקנה אחד עם מורפולוגיות שתוארו קודם לכן. "יירגע", אות יציבה אחד שבמהירות נעלמה. זהו הסוג העיקרי, המצביע על כך המק"ס מנוצן ועזב את שדה TIRF. "בלינק", אות שמהבהבת לאות נמוכה ומופיעה שוב באותה הנקודה בשל הרכבה של המפלגה הקומוניסטית הסינית שנייה באותה הנקודה. "לצבוט את", הקרנה צינורי יורדת נקודה, כאשר שתי CCPs קרוב מדי זה לזה כדי להיפתר ככתמים שונים, ואחד endocytosed. התיבה היא 2 x 2 מיקרומטר. (C) חזותי אנדוציטוזה בתיווך clathrin של מור ברזולוציה יחיד אירוע. שתי דוגמאות המייצגות את השבר הגדול של אירועי endocytic מור מוצגות. מסגרות הן כל 3 שניות. התיבה היא 2 x 2 מיקרומטר. (ד) איתור של אירועי endocytic בודדים באמצעות Imaris. תחומים לבנים נסמן CCPs זוהה ככתמים. איתור ספוט היה מותאם באמצעות מסנן "איכות". כתמי דימר שלא ניתן הייתה לזהות את מכלול חייהם גם לא נכללו עם מסנן האיכות. מבני שלט גדולים שמוצגים כמי שמבלי שיבחין הושמטו באמצעות מסנן "עוצמה"."Target =" ig3large.jpg _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: הכרה מטרה של הדינמיקה של אירועי endocytic באמצעות Imaris. חלון התאמת התצוגה, משמש כדי להתאים את התצוגה של התמונה כפי שמתואר בשלב 4.1 (). (ב) פתיחה "כתמים" הבונה האלגוריתם. הבונה מוצגת בחלון הבא. הצעד הראשון של הבונה אלגוריתם כתמים (C). בדוק "כתמי מסלול (לאורך זמן)." בדוק "מגזר היחיד באזור של העניין," במידת צורך. מסך בחירה (D) את ההחזר על ההשקעה. ראה שלב 4.2 לפרטים. (E) החלונות המרובים הדרושים כדי להגדיר את הקוטר של ספוט נמדד. פנלים מייצגים: מעבר מלעלות למצב פרוס באמצעות Navigation בר בחלק העליון, לחיצה על הקצוות הקוטביים של מקום, שבו הקוטר נמדד מוצג, בדרך כלל בצד ימין הקיצוני, שבו להיכנס לקוטר שנמדד. צעדים ראו 4.3-4.4. (F) סינון איכות המקום מתואר ב4.5-4.5.3. כתמי חלון (G) עריכה שתואר ב4.5.7. (H) מסלולי מדוד וחלונות מסלולי צפייה, שתוארו ב4.6. (I) חלון מסלולי מסנן מתואר ב4.7. (J) ערוך עוקב חלון המתואר ב4.7.1. מסך נתונים (K) שמירה מתוארת ב4.7.2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים את השימוש בTIRFM לדמיין אנדוציטוזה בתיווך clathrin (CME) ברמה של CCPs הבודד בתאים חיים בזמן אמת. CME הוא אירוע מהיר ודינמי מאוד מתווך על ידי ההשפעה המצטברת של אירועים בודדים רב מרחב ובזמן נפרד. רוב מבחני המשמשים כיום, כגון מדידות ביוכימיים של הפנמה באמצעות biotinylation משטח או ליגנד המחייב, זרימת cytometry או מבחני תאים קבועים למדידת כמות חלבונים הפנימו, או הלוקליזציה מיקרוסקופית אלקטרונים של חלבונים, לעקוב אחר שינויי הרכב בלוקליזציה חלבון בנקודות זמן קבועות . שיטות הקיימות אלה היו מאוד שימושיות בזיהוי חלבונים הדרושים לCME, אבל חוסר הרזולוציה המרחב ובזמן שמתאימה לכף הפיזיולוגית של CME או תהליכי סחר קרום דינמי אחרים. זה חשוב, כראיות האחרונות עולה כי CCPs הן הטרוגניים בהרכב החלבונים ודינמיקת 9-12, וכמו CME סביר להניח מוסדר במהירות באופן דיסקרטי במרחב. TIRFM תא חי מספק את היכולת לנתח CME ברמה של CCPs הבודד המופרד מרחבית, בזמן אמת, בתאים חיים.
יישום מוצלח של assay זה חזק מסתמך על שני גורמים מרכזיים: בריאות טובה של התאים וניתוח מעמיק של הפרמטרים של CME. לביטוי לשעבר, הנכון של חלבונים מתויגים ושיטות מיקרוסקופיה מזעור phototoxicity הם קריטיים. שורות תאי יציבות להביע חלבוני עניין הן אידיאליים, כפי שניתן לאמוד את רמות הביטוי באופן מהימן. אנו לתייג קולטנים עם תגים או epitope דגל N-מסוף או SPH 21-25. אמנם לא הכרחי, שתי מערכות התיוג להקל TIRFM של CME כי הקולטנים יכולים להיות מזוהים באופן סלקטיבי על קרום הפלזמה בתחילת הניסוי. רכיבי endocytic נוספים הרצויים יכולים להיות גם transfected זמני לשורות תאי יציבות אלה. TRפרוטוקול ansfection ציין כאן הוא מותאם להדמיה CME באמצעות TIRFM. ראשית, הוא מותאם לאף ומתון ברמות של ביטוי. ביטוי עניים מחייב כוח לייזר גבוה יותר לגילוי, ומגביר את הסיכון לphototoxicity וphotobleaching. יתר על כן, מאז assay זה מתעד את היעלמותו של puncta כCCPs הפנים, אותות וphotobleaching נמוכים משפיעים לרעה גם לניתוח. אנו מציעים כי, בנסיבות אלה, יופחת משך הזמן הכולל ו / או התדירות של הדמיה. שנית, הדגירה הקצרה של ריאגנטים transfection בתאים, המרווח בין transfection והניסוי, ואת המעבר הטרי של תאי transfected לcoverslips לפני ההדמיה, כל להבטיח שהתאים צילמו במצב בריאותי אופטימלי. שלישית, זה מבטיח כי הרוב המכריע של מבני clathrin הוא CCPs, וגיליונות לא שטוחים של לוחות clathrin או clathrin. רביעית, פרוטוקול זה ממזער ביטוי יתר של רכיבי CME transfected, אשר כבר הראהn כדי לשנות את דינמיקת CME 20,26.
הדמיה עם phototoxicity הנמוך, זה חשוב כדי לייעל את מערכת ההדמיה לרזולוציה אופטימלית ורגישות המרבית. הגדלה של אובייקטיבי וגודל גלאי המצלמה צריכה להיות מתאימה כדי למזער את ההגדלה מתחת או דגימת יתר וריקה. צמצם גבוה מספרי (1.45 ומעלה) מטרת TIRF יש להשתמש כדי לאסוף את האור המרבי אפשרי. אנו רוכשים תמונות עם מצלמת מכשיר תשלום מצמידים אלקטרונים הכפלה ליעילות קוונטית גבוהה, זמני חשיפה נמוכים, ומהירויות קריאה מהירות. בנוסף, על מנת להבטיח את בריאותם של התאים, הם צילמו בתקשורת ליבוביץ, אשר נאגרה עצמאי של CO 2, והוא השלים עם 10% FBS, בתא סגור לחלוטין מוגדר 37 ° C. בגלל TIRFM הוא רגיש מאוד ומטרות צמצם המספריות גבוהות בשימוש יכול לזהות אור הסביבה אפילו מינימאלי, זה קריטי כדי ליצור סביבת הדמיה המצורפת חינםמאור חיצוני ורעידות שעלולות לשבש את מישור המוקד בסדר.
חשוב לציין כי תקופות החיים ודינמיקה של רוב המרכיבים של CME מוחלטים משתנים בהתאם במידה רבה על סוגי תאים, רמות ביטוי של חלבון, טמפרטורה, ימים לאחר ציפוי, ווריאציות אחרות בתנאי תרבות 7,10,14,17,20, 25,27. הדבר בא לידי ביטוי בווריאציות עצומות בלוחות הזמנים והפצות נצפו בין קבוצות שונות באמצעות טכניקה זו, מגבלה ברורה של assay זה. יתר על כן, זה אפשרי, כי CCPs על המשטח התחתון של התא, צילם בTIRFM, מתנהג בצורה שונה מהמשטח העליון 23,25. בזמן שהוא שנוי במחלוקת על איזה משטח המייצג במדויק את התא 'טיפוסי', מוקף רכיבי מטריצה תאיים ברקמה, פרשנויות של דינמיקת המק"ס ראתה בטכניקה זו צריכה לקחת בחשבון הבדל פוטנציאל זה. הכוח האמיתי של assay, אפוא, בהשוואת שינויים בדynamics של CCPs, באותם תאים בתנאי תרבות זהים, לאחר מניפולציות חריפות, כוללים האשכולות של מולקולות מטען כגון GPCRs בתגובה להפעלה. השוואה זו מאפשרת לנורמליזציה של השינויים באותו התא, ובכך פיקוח על כל הפרמטרים שצוינו לעיל שעשוי לגרום לשינויים בהתנהגות המפלגה הקומוניסטית הסינית.
אנחנו בדרך כלל להעסיק שני ניתוחים ידניים ואוטומטיים, שתוארו לעיל, כדי לנתח את משך הזמן של אירועי endocytic: אימות ידנית והכרה אובייקטיבית באמצעות תוכנת ניתוח תמונת Imaris. אימות ידנית היא labor- והזמן אינטנסיבי, כפי שהוא מוגבל על ידי מספר CCPs משתמש יכול לספור, אבל זה הוא ללא ספק הטכניקה מדויקת ביותר זמינה. העין אנושית מיומנת יכולה בקלות להמשיך לעקוב אחר המפלגה הקומוניסטית הסינית באמצעות תנועת תא, ושינויים בצורה או במוקד, לוחות במדויק למעט ופיקסלים פגומים. זה גם יכול לזהות שינויים מורפולוגיים במפלגה הקומוניסטית הסינית מעיד על ערב הושלםNTS, כפי שמוצג באיור 3 ב ו3C. זה הכרחי, עם זאת, כי הניתוח נשאר אובייקטיבי ככל האפשר בתוך האילוצים הללו. זה דורש ההגדרה של קריטריונים ספציפיים המשמשים באופן עקבי בכל קבוצות נתונים. בנוסף, אנחנו בדרך כלל לנתח את התמונות באופן כפול סמיות, שבו שמות התמונה מקושקשים, כך שהתנאים אינם ידועים לאדם לנתח את התמונות. זיהוי אוטומטי, למשל באמצעות "כתמים" ו" משך מסלול "אלגוריתמים בImaris, ניתן להשתמש בם כדי לזהות את מרבית כתמי endocytic בסרט נתון, שהניבו מספר גבוה מדגם. בעוד אפשרויות רבות, כוללים אלגוריתמי מחוייט המורכבים ביותר 3,14,23,26,27, נמצאות שנוצרו, האמינות של שיטות אלה כדי לזהות אירועי endocytic נכונים תוך הימנעות זיהוי מזויף נשארת הדאגה הגדולה ביותר. לדוגמא, בImaris, תנועת תא יצירת קצוות מובילים בהירים, לוחות, ומתוךמסגרות מיקוד יכולות בקלות לזרוק את אלגוריתם נקודת איתור, שכן יש נטייה לזהות מבנים בהירים כמורכבים לחלוטין של כתמים. על מנת למנוע כתמים אלה מלהיות מחוברים למסלול, הם חייבים כל יוסרו. כתמים חריגים יחיד שאינם נמצאים במבנים גדולים כגון לוחות ניתן להסיר עם עריכת כתמי כרטיסייה, ואילו כתמים המחוברים ניתן להסיר מאוחר יותר באמצעות עריכת מסלולי כרטיסייה. הכתמים החריגים גם ניתן להסיר עם מסננים מותאמים אישית. לדוגמא, איור 3D מציג מסנן עוצמה משמש להגבלה להימנע מלכלול לוחות בזיהוי המק"ס. מסנן האיכות הוא עוד מסנן מאוד שימושי עבור מחיקת כתמים שגויים. "איכות" היא מדידה מצטברת של בהירות וצורה שנמצאה על ידי לקיחה את עוצמת הקרינה של המקום וסינון גאוס על ידי ¾ באורך של רדיוס המקום 20. עקומת האיכות נמצאת מתחת לקריטריונים שנבחרו. הוא מתאר את מספר הנקודות (y) זוההכאשר האיכות היא ערך מסוים (x). באיכות נמוכה יותר, יותר הנקודות שזוהו. אם מסנן האיכות נמוך מדי, כתמים יזוהו בו אין הקרינה גלויה, לעומת זאת, אם מסנן האיכות הוא גבוה מדי, רק הכתמים הבהירים יזוהו. עקוב לאורך העקום לערכים גבוהים יותר (x); מספר המקומות זוהה (y) יהיה בדרך כלל ירידה דרמטית. הזז את הסף התחתון לנקודה זו. זוהי נקודת המינימום למקום הסף התחתון. תורמים עיקריים אחרים לכתמים כוזבים בתחום TIRF הם endosomes שיעבור לפריפריה של התא ולהיכנס לתחום TIRF. קריטריון חזק להסרת אלה הוא הניידות של כתמים, כלומר התזוזה של כתמים לאורך זמן. CCPs להזיז מעט מאוד אלא אם כן, כחלק מהתנועה של התא כולו, בזמן שendosomes להציג תנועה בראונית או מכוון מהר. אלגוריתמים חדשים יותר, תוך שיפור משמעותי, עדיין מעודנים ומותאמים 3,14,23,26,27. כנפגשו אלהhods להיות יותר מתוחכם ואמין, אנחנו יכולים לנתח מאות או אלפי נקודות, מבלי לבדוק אותם באופן ידני בכל נקודה. נכון לעכשיו, עם זאת, אנו מציעים שישמשו שני ניתוחים אלו יחד כדי להשלים אחד את השני לדיוק.
הפרוטוקול שתארנו ניתן להתאים בקלות כדי לענות על שאלות רבות בנוגע לאנדוציטוזה מטען. ניתן להשתמש בו כדי לבצע לוקליזציה שיתוף פשוטה של מטענים עם רכיבי CME, ונהג להראות שינויים ברכיבים ספציפיים של מכונות endocytic עקב גירויים מסוימים. Assay גם יכול בקלות להיות מותאם לכל תהליך endocytic, כגון caveolae 28, שמראה ריכוזים של מרכיבי מטען ומעיל בדידים, ולמחקר של תהליכים הבסיסיים אלה בסוגים מיוחדים של תאים. בעתיד, כפי שעריכת הגנום תהפוך למקובלת יותר 20,29,30, אנו צופים כי הוא יהפוך את השיטה המועדפת לתיוג רכיבים, וכי o הדינמיקה וההתנהגותרכיבים שונים f יהיו מעודנים יותר. בהתחשב בכך שההבנה של תהליכים תאיים שלנו כבר מונעת במידה רבה על ידי זיהוי של גנים, שינויי חלבון, וinteractomes, assay שתוארנו כאן מייצג את אחד מגבולות החקירה הבאים, דהינו. ההגדרה של דינמיקת spatiotemporal של תהליכים ומנגנונים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 mm coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
- Ungewickell, E., Branton, D.
- Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
- Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
- Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
- Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
- Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
- Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
- Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
- Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
- Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
- Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
- Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
- Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
- Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
- Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
- Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
- Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
- Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
- Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
- Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G.
- Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
- Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
