Introduction
عملية بوساطة بالكلاذرين الإلتقام (CME) تعتمد عند وصول توقيت جيد لعناصر كثيرة من الآلات التقامي بوساطة بالكلاذرين لجمع البضائع والتلاعب غشاء البلازما إلى الحويصلات 1-3. يبدأ CME من تشويه الغشاء والبضائع محول البروتينات التي تأتي معا في مواقع الوليدة من الإلتقام 1. هذه البروتينات تجنيد بالكلاذرين البروتين معطف، والتي تجمع إلى بنية تشبه القفص الذي يشكل حفرة المغلفة بالكلاذرين (CCP) 4. مرة واحدة يتم تجميعها في CCP بالكامل في شكل كروي، انفصال الغشاء، في المقام الأول من خلال عمل GTPase كبير، dynamin، يولد حويصلات المغلفة بالكلاذرين مجانية (CCVs) 5،6. استيعاب هذا يؤدي التفكيك السريع للمعطف بالكلاذرين، مما يسمح المكونات ليتم إعادة استخدامها لجولات متعددة من التعليم الطبي المستمر.
تم اكتشاف الجذور وتوصيف البروتينات المشاركة في التعليم الطبي المستمر في bioch التقليديemical، الوراثية، وتقنيات الفحص المجهري 4-6،8. وقد أوضحت هذه المقايسات أدوار ونقاط التفاعل بين هذه المكونات التقامي. على الرغم من المفيد جدا لتحديد المكونات الأساسية للماكينات الاتجار، هذه المقايسات محدودة للغاية في الاستيلاء على السلوك الديناميكي مكونات CME أو تركيز البضائع. هذا هو الحد الحرج، منذ تحركها CME من قبل الجمعية فشلت مجموعات من وحدات البروتين في خطوات محددة، ومنذ التغيرات الصغيرة في ديناميات الأحداث التقامي الفردية يمكن أن تكون له عواقب تراكمية كبيرة على الإلتقام. وعلاوة على ذلك، فإن البيانات الأخيرة تشير إلى أن نقط التحكم الحرجة الفردية قد تختلف سواء في تكوين والسلوك، مما يشير إلى أن التنظيم الفسيولوجي لهذه العملية هو غاية مكانيا وزمانيا مقيدة 9-14. تصور الأحداث التقامي الفردية، وبالتالي، لا بد أن نفهم لماذا هناك بروتينات زائدة المتعددة التي ينطوي عليها ب CME وكيف يمكن التحكم هذه البروتيناتإشارات الفسيولوجية ذ لتنظيم استيعاب البضائع.
نحن هنا وصف استخدام التفكير إجمالي الداخلية مضان المجهري (TIRFM) لمراقبة CME على مستوى ديناميات نقط التحكم الحرجة الفردية في الخلايا الحية. TIRFM تعتمد على الفرق في معامل الانكسار بين ساترة الزجاج والبيئة السوائل من الخلايا 15،16. عندما يتم توجيه ضوء الإثارة تجاه الخلايا في أكثر من زاوية حرجة، وينعكس داخليا، وخلق موجة زائل التي تحافظ على حقل رقيقة من الإضاءة تمتد حوالي 100 نانومتر فوق ساترة. وهذا يضمن أن فقط جزيئات الفلورسنت في هذا المجال الضيق متحمسون. عمليا، هذا يسمح الإثارة من جزيئات الفلورسنت على أو بالقرب من غشاء البلازما، ويقلل من مضان من الأجزاء الداخلية للخلية. هذا يوفر أعلى بكثير نسبة الإشارة إلى الضوضاء وض محور قرار لتصور الأحداث في غشاء البلازما، وشاركmpared إلى طرق أكثر شيوعا مثل epifluorescence التقليدية أو متحد البؤر المجهري مضان. وصفنا أيضا، في أحد التمهيدية والمستوى العملي، واستخدام صورة منصة التحليل تستخدم عادة لتحليل وquantitate معالم شكلية بسيطة وديناميات الأحداث الفردية التقامي البضائع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التعبير عن الموسومة fluorescently CME في مكونات الخلايا المستزرعة
HEK293 الخلايا هي خلايا نموذج المفيدة التي استخدمت على نطاق واسع لدراسة البيولوجيا النوع من الاختزال والإلتقام، وبالتالي تستخدم كنماذج في هذا البروتوكول. استخدام أي بروتوكول ترنسفكأيشن توفير تعبير موحد دون overexpression ومنخفضة السمية الخلوية.
- ثقافة التعامل مع كل خلية في معقم غطاء تدفق الصفحي. ملء 4 آبار من لوحة 12 جيدا مع 1 مل من التعديل وسائل الإعلام Dulbecco والأساسي (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). من قارورة متكدسة T25 الخلايا HEK293 تمييع 01:50، 01:25، 01:16، 01:10 على التوالي في كل من 4 آبار.
- بدلا من ذلك، البذور الخلايا إلى لوحة متعددة جيدا من الحجم المطلوب، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. البذور 0،4-2 × 10 4 الخلايا في 12 لوحة جيدا. تنمو الخلايا خلال الليل في العقيمة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 95٪ الرطوبة.
ملاحظة: نظرا إلى أن نمو صآتش تختلف تبعا لشروط وخطوط الخلايا، قد يكون من الأفضل أن البذور آبار متعددة لضمان confluency المثالي لترنسفكأيشن في اليوم التالي أو إمكانية أداء transfections في مكررة.
- بدلا من ذلك، البذور الخلايا إلى لوحة متعددة جيدا من الحجم المطلوب، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. البذور 0،4-2 × 10 4 الخلايا في 12 لوحة جيدا. تنمو الخلايا خلال الليل في العقيمة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 95٪ الرطوبة.
- في صباح اليوم التالي، حدد علاوة على ذلك هو ~ 70٪ متموجة لترنسفكأيشن (انظر الشكل 1B). إذا لم يتم التوصل الى جانب هذه الدولة، الانتظار ليوم آخر.
ملاحظة: 70٪ confluency مثالية لHEK293 الخلايا. بنقل العدوى إلى خلايا التي هي نتائج أكثر متفرق في موت الخلايا والسمية. Transfecting نتائج الإفراط في خلايا متكدسة في سوء التعبير. - إضافة 60 ميكرولتر العازلة EC (من عدة ترنسفكأيشن)، 400 نانوغرام من البلازميدات ترميز الموسومة GPCRs و / أو مكونات الماكينات بالكلاذرين، و 2.4 ميكرولتر من محسن في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة. دوامة لمدة 2 ثانية لضمان خلط كاف، وتدور في microfuge في 2،000 x ج لمدة 2 ثانية لجمع السائل في الجزء السفلي.
- إضافة6 ميكرولتر Effectene كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة. دوامة لمدة 2 ثانية، وتدور في 2،000 x ج لمدة 2 ثانية في microfuge لجمع السائل في الجزء السفلي. الانتظار لمدة 20 دقيقة للسماح لتشكيل المذيلات ترنسفكأيشن المعقدة.
- وسائل الإعلام نضح من البئر ليتم transfected. بلطف إضافة 0.8 مل من DMEM مع 10٪ FBS لترنسفكأيشن خليط كاشف ومزيج من قبل pipetting صعودا ونزولا ببطء لتقليل كسر المذيلات. إضافة وسائل الإعلام وخليط ترنسفكأيشن إلى البئر ببطء شديد من الجانب. إضافة أي المتبقية خليط ترنسفكأيشن من أنبوب microcentrifuge إلى البئر باستخدام micropipettor.
ملاحظة: اختياريا، إضافة اضافية 0.5 مل من DMEM مع 10٪ FBS إلى transfected جيدا لإعطاء خلايا التغذية الإضافية الناتجة في ترنسفكأيشن ألطف وأقل تعبير عابر. - العودة الخلايا إلى 37 درجة مئوية الحاضنة لمدة 5 ساعة.
- نضح وسائل الإعلام التي تحتوي على خليط ترنسفكأيشن. استبدال مع 1 مل من DMEM مع 10٪ FBS. سماحالخلايا لتنمو بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، وتمرير الخلايا لcoverslips غير المصقول، معقمة من قبل التعقيم.
- إضافة 0.5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع 1 ملم EDTA إلى كل بئر. بدلا من ذلك، استخدم 0.5 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA. تترك في الحاضنة لمدة 1 دقيقة.
- وضع 3 جولة، معقمة coverslips 25 ملم في آبار منفصلة من لوحة 6 جيدا. ملء كل جيدا مع 2 مل من وسائل الإعلام. دفع برفق ساترة وصولا الى قاع البئر لمنع الخلايا من النمو على الجزء السفلي من ساترة.
- تستنهض الهمم يدويا البئر لرفع قبالة خلايا من قاع البئر. إضافة 1 مل من DMEM مع 10٪ FBS ل resuspend. توزيع الخلايا رفع من 1 بئر من لوحة 12 جيدا بالتساوي بين 3 coverslips. بدلا من ذلك، لوحة الخلايا على 3 أطباق ذات قاع زجاجي.
- تسمح للخلايا أن تنمو على لل coverslips لمدة 48 ساعة على الأقل قبل التصوير. تأكد من أن الخلايا تنتشر ومسطحة.
2.التصوير CCP والبضائع عن طريق ديناميات TIRFM
- المكورات M1 الأجسام المضادة لمكافحة FLAG مع الأصباغ اليكسا اليكسا فلور باستخدام عدة وصفها البروتين وفقا لبروتوكول تصنيع. بدلا من ذلك، يمكن شراؤها قبل الأجسام المضادة مترافق.
- قبل احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة في 1: 1،000 التخفيف في 1 مل من قبل تحسنت المتوسطة يبوفيتش مع 10٪ FBS، أو غروب MEM مع 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4 و 10٪ FBS لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية (التصوير المتوسطة)، لتسمية GPCRs الموسومة FLAG على سطح الخلية. تخطي هذه الخطوات إذا البروتينات الفلورية المرمزة وراثيا، مثل GFP، وتستخدم من العلامات (انظر المناقشة للحصول على التفاصيل).
- نقل ساترة لغرفة التصوير الخلية الحية. بدلا من ذلك، لأطباق ذات القاع الزجاجي، نضح وسائل الإعلام الأجسام المضادة وضع العلامات وإضافة 700 ميكرولتر من قبل تحسنت المتوسطة التصوير.
- استخدام زوج من ملقط وثني غيض من إبرة قياس 25 إلى الخطاف.
- عقد زوج من ملقط في اليد المهيمنة. عقد الإبرة عازمة في أوراسكوم تليكوم القابضةإيه. تحويل الإبرة حتى منحنيات هوك أسفل نحو الزجاج. بلطف سحب الإبرة، والجانب هوك أسفل، عبر الجزء السفلي من لوحة 6 جيدا حتى السنانير على ساترة. الحرص على عدم خدش سطح ساترة، كما أنه سيتم فصل الخلايا. رفع بلطف صعودا ساترة من قاع البئر. موازنة ساترة ضد جدار البئر حصول على الدعم.
- استخدام ملقط لفهم قرب حافة ساترة ونقل الجانب الخلية ساترة إلى غرفة التصوير، وتجميع الغرفة. إضافة 700 ميكرولتر (أو كمية مناسبة) من قبل تحسنت المتوسطة التصوير. التعامل مع لل coverslips بعناية دون ضغوط لمنع تشقق أو كسر.
- نقل غرفة على المجهر والحفاظ على درجة حرارة الخلايا عند 37 درجة مئوية باستخدام سخان مرحلة أو حاضنة المغلقة.
- جعل الخلايا في التركيز باستخدام هدف النفط الغمر أو 100X 60X TIRF (NA 1.45 أو أعلى). صورة الخلايا في epifluorescence التقليدية أو يخدعوسائط الاتصال من الإضاءة (أي لا TIRFM) لتحديد الخلايا معربا عن يبني المناسبة. خارج نطاق التركيز خلايا غير مرئية تقريبا في عمق رقيقة من TIRF الإضاءة مما يجعل من الصعب العثور على طائرة الوصل والخلايا.
ملاحظة: بعض أنظمة تستخدم نفس الليزر لTIRFM إلى الصورة في epifluorescence التقليدية، عن طريق تحريك زاوية السقوط ليزر فوق الزاوية الحرجة. باعتبارها قائي مهم، يكون دائما على بينة من زاوية شعاع الليزر، ودائما توجيهها بعيدا عن المراقب. - التركيز وصولا الى السطح السفلي للخلية حتى التعبير عن الخطوط العريضة للغشاء البلازما حول الخلية يختفي ويظهر مركز الخلية. وهذا هو أكثر وضوحا مع غشاء البلازما بروتين البضائع المحلية مثل مستقبلات المواد الأفيونية μ (انظر الشكل 2A).
- التبديل إلى TIRF التصوير.
- إذا باستخدام نفس الليزر للتصوير في epifluorescence التقليدية، وزيادة زاوية السقوط للليزر حتى خارج التركيز مضان في داخل الخلية يختفي، ويعتبر أي مخطط من غشاء البلازما حول الخلية. (قارن الشكل 2C إلى أرقام 2A و 2B)
ملاحظة: في TIRFM، والانتقال البؤري يسبب الصورة للذهاب تماما من التركيز و / أو قاتمة، ومستويات مضان الشاملة يتناقص نظرا لعمق أقل من الإضاءة. ولذلك، أسلوب بديل للتبديل إلى TIRFM الإضاءة هو التركيز الأول على مركز الخلية في epifluorescence مبائر / التقليدية، ثم زيادة زاوية السقوط حتى تفقد معظم مضان، ومن ثم التركيز وصولا الى غشاء البلازما. - مرة واحدة في TIRFM، وضمان الليزر الإثارة يعكس مرة أخرى من خلال موضوعي وغير مرئية فوق الهدف. تأكيد هذا عن طريق فحص إذا كانت بقعة الليزر مرئيا.
ملاحظة: في epifluorescence مبائر أو وسائط التقليدية، وإضاءة الليزر مرئيا فوق الهدف،مثل على السقف. - صقل التركيز للحصول على صورة واضحة. المكونات الرئيسية لآلية التقامي، مثل بالكلاذرين، سوف تكون واضحة في نقاط و. ضبط التركيز على غرامة، وبالتالي فإن نقاط والجولة هي كما ممكن.
ملاحظة: للحصول على البضائع المترجمة الغشاء، وضبط التركيز بشكل جيد حتى تظهر أرجل كاذبة خيطية متميزة. - استخدام برنامج الاستحواذ على حفظ كافة المعلمات التصوير مثل المرايا وTIRF زاوية. نفعل ذلك لجميع الأطوال الموجية اللازمة.
- إذا باستخدام نفس الليزر للتصوير في epifluorescence التقليدية، وزيادة زاوية السقوط للليزر حتى خارج التركيز مضان في داخل الخلية يختفي، ويعتبر أي مخطط من غشاء البلازما حول الخلية. (قارن الشكل 2C إلى أرقام 2A و 2B)
- مسح حول ساترة للعثور على الخلايا معربا عن علامات التقامي المطلوب: مستقبلات μ-الأفيونية ومحول β-arrestin في المثال هو موضح في الشكل 3A. حدد الخلايا التي يتم التعبير لكن ليس على التعبير عن. انظر المناقشة للحصول على التفاصيل.
- مرة واحدة يتم تحديد خلايا، الحصول على صور كل 3 ثانية لمدة 10 دقيقة. هذا يكفي للقبض على عمر من CCP، لأن متوسط عمر من CCP في HEK293 خلايا تصويرها في ظل هذه الظروف هو آرواوند 40 ثانية 10-11. هذا يسمح لحوالي 12-14 الأطر لمراقبة CCP. انظر على سبيل المثال فيلم 1. كرر جميع الخطوات لصورة خلايا إضافية.
3. تحليل ديناميات التقامي بواسطة التحقق اليدوي
على الرغم من التحقق اليدوي للأعمار CCP يقتصر إلى حد كبير على عدد من نقط التحكم الحرجة التي يمكن أن يتم الكشف عن، فإنه لا يزال وسيلة دقيقة للكشف دون أن يعترضها التغيرات العالمية في الصورة وكشف القطع الأثرية. انظر المناقشة للحصول على التفاصيل.
- فتح الملف في ImageJ. يتم تخزين الصور كما كومة واحدة من ملفات TIFF مع قنوات معشق. تحويل الصور إلى hyperstacks. اذهب إلى صورة> Hyperstacks> كومة إلى Hyperstack. أدخل عدد من القنوات المكتسب (أي إذا كان التصوير β-arrestin ومستقبلات المواد الأفيونية μ، أدخل 2)، أدخل 1 لZ كومة (TIRFM هو طائرة واحدة)، وعدد من الأطر من الفيلم (أي 10 دقيقة الفيلم في إطار كل ط 1 3 ثانيةق 200) في نافذة منبثقة.
- شكل hyperstack غلة نافذة مع اثنين من أشرطة التمرير. استخدام الشريط العلوي للتنقل عبر القنوات وأسفل للانتقال عبر الزمن. انتقل إلى القناة من البروتين الذي سوف يعاير عمر.
- الانتقال إلى تأطير 10 أو 15 من الفيلم للحد من إدراج نقط التحكم الحرجة الموجودة من قبل والتي تكون غير مرئية فترات بأكمله. رسم مربع ROI حول بقعة المختارة عشوائيا.
- حساب عدد من الأطر بقعة مرئيا.
ملاحظة: انظر الشكل 3B و 3C للحصول على أمثلة من ثلاث فئات شكلية من الأحداث التقامي 10،11،16-19.
4. تحليل ديناميات التقامي بواسطة الاعتراف الهدف
اعتراف موضوعي يسمح الكشف عن تقريبا كل من نقط التحكم الحرجة تصوير في زنزانة، ولكن يمكن أن يكون عرضة للخطأ بسبب الكشف زائفة هياكل خاطئة. انظر المناقشة للحصول على تفاصيل الموازنة بين مزايا وعيوب البريدطريقة منظمة العمل ضد الجوع. العديد من البرامج، بما في ذلك الخوارزميات مبنية خصيصا، يمكن استخدامها للكشف عن بموضوعية نقط التحكم الحرجة. يصف هذا البروتوكول الاعتراف الموضوعي للنقط التحكم الحرجة باستخدام Imaris، وهو برنامج تحليل صورة (انظر المواد).
- للبدء، افتح ملف الصورة الخام في صورة برامج التحليل. افتراضيا، تظهر صورة ملونة المدمجة. استخدام إطار "عرض تعديل" لضبط سطوع قناة. انقر على اسم قناة لتغيير لون المعروض. قم بإلغاء تحديد المربع الموجود بجوار القناة لمنع عرض لها (انظر الشكل 4A).
- خلق "النقاط" من خلال النقر على أيقونة مع بقع برتقالية. انظر الشكل 4B. تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) حول الخلية. انظر الشكل 4C. استخدام العائد على الاستثمار لاستبعاد المناطق التي سيتم الكشف عن الحواف الأمامية المشرقة واللوحات بشكل غير صحيح. تحليل خلايا متعددة مع مستويات التعبير المختلفة بشكل منفصل.
- قياس قطرها من بقعة إلى ال Øالتقديرات الأولية لدي الخوارزمية. التبديل إلى وضع "شريحة"، وانقر على طرفي القطبية من بقعة لقياس قطرها. انظر الشكل 4E. القيام بذلك لمدة 4 أو 5 البقع الجولة التي تبدو يدل على CCP في ذروة استقرارها، بعد تشكيل وقبل انفصال. تستخدم هذه القياسات لحساب متوسط قطرها إلى أقرب عشر من ميكرون.
- كشف البقع. عودة إلى وضع "فق". اختيار القناة المناسبة للكشف. أدخل متوسط قطرها قياسه، عادة 0.3 أو 0.4 ميكرون. انقر فوق السهم إلى الأمام الزرقاء لتحديد المواقع. انظر الشكل 4E. إذا تم التقليل قطر البقع، وسيتم تحديد نقاط زائفة من مضان على شكل بقع. إذا كان القطر كبير جدا، سيتم تجاهل البقع الحقيقية. عندما لم تكن متأكدا، تقدير أقل قليلا، وتصفية المكتشفة غير صحيحة في وقت لاحق.
- تصفية البقع من الجودة. ضبط مرشح لالتقاط أكبر عدد ممكن من النقاط ممكن دون العودةالأرض. يتم تحديد مرشح الجودة افتراضيا 20. انظر الشكل 4F.
- استخدام "الجودة" منحنى كدليل لوضع عتبة المناسبة. نقل العتبة السفلية للمرشح مع زر الماوس الأيسر لهذا الانخفاض الأول في المنحنى. هذا هو نقطة انطلاق جيدة لمرشح، وهذا الموقف عادة بتكرير لكشف البقع المرئية فقط. انظر الشكل 4F.
- تظهر بقع الكشف على الفيلم والمجالات أو مركز بكسل. باستخدام "ألوان" علامة التبويب، وضبط لون البقع للون مغاير لجعله أسهل لرؤيتهم. التمرير من خلال فيلم لمراجعة البقع في كل إطار. الهدف هو الكشف عن العديد من البقع ممكن لمجمل حياتهم.
- إزالة البقع باهتة أو يدويا ربطها في المسارات مستمرة في وقت لاحق، كما لم يتم الكشف عنها بشكل جيد من خلال مسار حياتهم.
- إزالة لوحات مشرقة مع "كثافة" فيلثالثا، إذا لزم الأمر. انقر فوق علامة الجمع الأخضر لإضافة فلتر جديد. انظر الشكل 4F. إنشاء فلتر لتصفية الكثافة داخل أو خارج البقع من إشارات مضان معين. استخدام منحنى الكثافة ولدت، (مماثلة لجودة المنحنى مناقشتها في 4.5) لتعيين العتبة. استخدم زر الماوس الأيسر لإزالة نهاية اليسار المتطرف المنحنى الذي يمثل ألمع البقع.
ملاحظة: الهياكل وحة كبيرة وعادة ما تكون بين ألمع العناصر في الخلية، ويتم استبعادها بسهولة أنهم مع هذا الفلتر. - التمرير من خلال الفيلم لضمان اكتشاف نقط التحكم الحرجة كبقع ولم يعد يتم الكشف ألمع ويحات. يبين الشكل 3D خلية حيث كشف نقط التحكم الحرجة (الرمز بواسطة المجالات البيضاء) تم الأمثل مع فلتر الجودة واستبعدت لويحات مع نوعية التصفية.
- تقليل الحواف خلية مشرقة مع مرشح الجودة. قد لا تزال بحاجة أجسام لامعة لإزالتها يدويا، في الخطوة التالية. تواصل مع الأزرقالسهم.
- إزالة البقع الشاذة في شاشة تحرير البقع. التحول إلى "حدد" واسطة. انقر على الفور. وسوف تتحول الصفراء. انقر على "حذف". انقر على السهم الأزرق لمواصلة بناء الخوارزمية. انظر الشكل 4G.
- مسارات التدبير. تحديد المسارات ل"الحركة البراونية". وCCP يجب أن لا تظهر أي حركة موجهة، فقط الحد الأدنى من الانجراف عبر غشاء البلازما. هذه الخوارزمية هي الأنسب لهذا الاقتراح. انظر الشكل 4H.
- تعيين المسافة القصوى إلى قيمة صغيرة مثل 0.7 ميكرون. انظر الشكل 4H.
ملاحظة: وضع مسافة صغيرة يقلل من البقع اتصال المجاورة والتي لا تزال تسمح لاستمرار تتبع مكان الخلية من خلال CCP أو حركة الخلية. - تعيين ماكس الفجوة الحجم إلى 1. هذا يسمح مسار لمواصلة إذا كان هناك واحد فقط في عداد المفقودين في إطار الخلافة. انقر على السهم الأزرق لحساب المسارات. انظر الشكل 4H.
ملاحظة: Gأحجام ا ف ب أكثر من 3 أسباب مسارات مختلفة ليتم ربطها معا بشكل غير صحيح. - التبديل إلى عرض المسار "التنين الذيل." انتقل من خلال فيلم مراقبة الجودة الكشف. إذا أن يكون متصلا البقع المجاورة، تقليل المسافة القصوى أقل من 0.7 ميكرون. إذا كان يتم كسر البقع تصل بسهولة جدا، وزيادة الفجوة ماكس الحجم. انقر على السهم الأزرق لخلق المسارات. هذا يؤدي إلى الشاشة المسارات التصفية. انظر الشكل 4H.
- تعيين المسافة القصوى إلى قيمة صغيرة مثل 0.7 ميكرون. انظر الشكل 4H.
- مرشح المسارات وتصدير البيانات. استخدام "كثافة" فلتر لإزالة اللويحات مشرقة إضافية. استخدام "إزاحة" فلتر لإزالة الإندوسومات التي تدخل مجال TIRF. توخي الحذر، والبقع أطول وسيكون نزوح أطول أيضا. انقر فوق السهم المزدوج الأخضر لإتمام البروتوكول. انظر الشكل 4I.
- استخدم علامة التبويب تحرير المسارات، مع رمز قلم رصاص، لإزالة المكتشفة إيجابية كاذبة من المسارات التي لا يمكن إزالتها عن طريق المرشحات. التحقق من وجود discontinuities أو اتصالات كاذبة. للاتصال مسارين، حدد لهم باستخدام السيطرة اليسار انقر، ثم انقر على "الاتصال" في مربع تحرير المسارات. لقطع المسارات الى بقع منفصلة، حدد المسار وضرب "قطع الاتصال". تحديد البقع متعددة مع السيطرة + اليسار انقر وانقر على "اتصال" لإنشاء المسار الجديد. والأسلوب هو نفسه بالنسبة البقع التحرير، وصفها في 4.5.7. انظر الشكل 4J.
- تصدير البيانات، انتقل إلى علامة التبويب الإحصائيات. انقر على أيقونة قرص مرن واحد لتصدير الإحصائية المختارة. انقر على الأيقونة التي تشبه سلسلة من الأقراص المرنة لتصدير جميع الإحصاءات. "المسار المدة" إحصائية تحتوي على طول المسارات التقامي. انظر الشكل 4K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الخلية الحية TIRF المجهر سجلنا ديناميات التقامي للμ مستقبلات المواد الأفيونية (MOR)، ومستقبلات البروتين يقترن G-(GPCR) ولها التقامي البروتين محول β-arrestin. تم transfected في بناء β-arrestin عابر في خط خلية MOR التعبير عن ثابت باستخدام بروتوكول المبين في الشكل 1، وتصوير 96 ساعة في وقت لاحق. وMOR في خط الخلية مستقرة هو N-عضال الموسومة مع GFP الحساسة الرقم الهيدروجيني. هذا بروتين فلوري تتفلور فقط في السائل خارج الخلية محايد. أيضا، وMOR endocytoses تنشيط مرة واحدة فقط بواسطة ناهض، وخلاف ذلك لا تزال موزعة بالتساوي عبر غشاء البلازما. التركيز على غشاء البلازما ملتصقة أن يجلس على غلاف من الزجاج في نتائج مبائر وضع في زنزانة التي شغلها في مع مضان خافت. هذا يختلف من التركيز على مركز الخلية، حيث يعتبر غشاء البلازما فقط باعتباره حلقة من مضان حول الخلية. قارن اليساروالألواح الصحيحة في الشكل 2A. التحول إلى epifluorescence التقليدية أو TIRF مع زاوية غير صحيحة يسبب من التركيز مضان لتصبح واضحة في الخلايا نفسها كما هو مبين في الشكل 2B. عند زاوية TIRF صحيحة غشاء البلازما هو هش جدا، واضحة ومشرقة وخارج التركيز مضان لم يعد يعطل الصورة. مقارنة الشكل 2C إلى أرقام 2A و 2B.
كانت الصورة واضحة وحادة لأن MOR على غشاء البلازما ملتصقة، وهو إلى حد كبير في مجال TIRF. في المقابل، لا يزال β-arrestin في بركة عصاري خلوي عندما لا جندت حتى الآن نقاط والتقامي، ويبدو ضبابي والخروج من التركيز لأنها ليست في مجال TIRF. مرة واحدة يتم تنشيط MOR بواسطة ناهض، يتم تجنيده β-arrestin إلى غشاء البلازما، وكلاهما β-arrestin ومستقبلات إعادة توزيع لنقط التحكم الحرجة (الشكل 3A والفيلم 1 ، β-arrestin باللون الأخضر، في MOR أحمر، أصفر تراكب).
أعمار هذه المجموعات يمكن قياسها كميا يدويا باستخدام المعلمات الثلاث لالإلتقام الانتهاء كما هو مبين في الشكل 3B. البقع تدل على نقط التحكم الحرجة إما أن يختفي تماما (انظر أيضا الشكل 3C)، "وميض" وإيقاف أو "قرصة قبالة" هيكل أكبر. وهذا الأخير شرطين تمثل الأحداث التي يتم مكانيا قريبة جدا معا لحلها كأحداث منفصلة. خوارزمية الكشف بقعة في Imaris مفيد أيضا لتحديد نقط التحكم الحرجة، على النحو المبين في الشكل 4. يدل الشكل 3D الكشف عن نقط التحكم الحرجة باستخدام Imaris، بعد تصفية لإزالة الهياكل وحة غير ديناميكية. مجالات البيضاء مضافين دلالة الكشف عن البقع. استبعدت بقع باهتة لا يمكن الكشف عن حياتهم كلها أيضا مع "الجودة" التصفية.
">
الشكل 1: مخطط تدفق ترنسفكأيشن الداخلي. (A) أولا، البذور مجموعة متنوعة من التخفيفات (1:50، 1:25، 1:16، 1:10) على لوحة ال 12 أيضا. تسمح للخلايا أن تنمو بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، والبحث عن جيدا أن حوالي 70٪ متموجة، وموزعة بالتساوي، كما هو مبين. هذا هو البئر التي سيتم transfected. (B) أضف 60 ميكرولتر من العازلة EC و 400 نانوغرام من الحمض النووي في أنبوب microcentrifuge. دوامة لمدة 10 ثانية وتدور السائل إلى أسفل الأنبوب. إضافة 2.4 ميكرولتر من محسن. دوامة لمدة 2 ثانية وتدور السائل إلى أسفل الأنبوب. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. إضافة 6 ميكرولتر من Effectene. دوامة لمدة 2 ثانية وتدور السائل إلى أسفل الأنبوب. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. (C) مزيج ببطء 0.8 مل من DMEM مع 10٪ FBS مع ترنسفكأيشن. إضافة إلى الخلايا في تحديده مسبقا أيضا. احتضان خلايا لمدة 5 ساعة عند 37 درجة مئوية. استبدال طازجةDMEM مع 10٪ FBS.
الشكل 2: العثور على الحقل TIRFM. (A) غشاء البلازما تصويرها في متحد البؤر. لوحة ترك يصور الخلايا في مبائر مع التركيز على وسط الخلية. ويعتبر غشاء البلازما فقط بأنها "عصابة" حول الخلية. التركيز وصولا الى غشاء البلازما القاعدية، المجاورة لساترة يسبب الخلية المراد شغلها في مع مضان خافت. غشاء البلازما "عصابة" لا ينبغي أن تكون واضحة في مجال TIRF أرق. (B) غشاء البلازما القاعدية مع ضحالة زاوية TIRF إنتاج epifluorescence الإضاءة التقليدية من خلال العينة. هذا ينير الخلية بأكملها والكثير من التركيز مضان من أعلى الخلية موجود. (C) غشاء البلازما في TIRF. التركيز على أرجل كاذبة خيطية يساعد على العثور على هذه الطائرة. لاحظ أنهطائرة واحدة على نحو سلس. الحانات هي مقياس 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تصور وقياس الأحداث التقامي في TIRF. (A) خلية معربا عن μ-الأفيونية مستقبلات (MOR) وβ-arrestin قبل وبعد إضافة ناهض أن يدفع الإلتقام. ناهض يسبب إعادة توزيع كل من البروتينات إلى نقاط والتقامي. شريط النطاق هو 10 ميكرون (B) ثلاثة أنواع من الأحداث التقامي، وينظر من خلال وضع تصور ديناميات arrestin، بما يتفق مع الأشكال التضاريسية التي سبق وصفها. "ثابت"، إشارة واحدة ثابتة أن يختفي بسرعة. هذا هو النوع الرئيسي، مشيرا إلى أن CCP تمت المبرعمة وخرج من الملعب TIRF. "وميض"، إشارة إلى أن يومض إشارة إلى الدنيا ويظهر ثانية في نفس المكان بسبب تجميع لCCP الثانية في نفس المكان. "قرصة قبالة"، إسقاط أنبوبي يأتي من بقعة، عندما اثنين من نقط التحكم الحرجة هي قريبة جدا من بعضها البعض لحلها كبقع مميزة، وأحد endocytosed. المربع هو 2 × 2 ميكرون. (C) تصور بوساطة بالكلاذرين الإلتقام من MOR الدقة في حدث واحد. وترد مثالين التي تمثل جزءا كبيرا من الأحداث MOR التقامي. الإطارات هي كل 3 ثانية. المربع هو 2 × 2 ميكرومتر (D) الكشف عن الأحداث التقامي الفردية باستخدام Imaris. مجالات البيضاء دلالة نقط التحكم الحرجة الكشف عن البقع. تم الكشف عن بقعة الأمثل باستخدام "الجودة" التصفية. استبعدت بقع باهتة لا يمكن الكشف عن مجمل حياتهم أيضا مع مرشح الجودة. حذفت الهياكل اللوحة الكبيرة التي تظهر على أنها لم يتم كشفها باستخدام "كثافة" التصفية.ig3large.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الهدف الاعتراف ديناميات الأحداث التقامي باستخدام Imaris. (A) نافذة تعديل العرض، وتستخدم لضبط العرض من الصورة كما هو موضح في الخطوة 4.1. (B) فتح "النقاط" خوارزمية البناء. يتم عرض باني في الإطار أدناه. (C) والخطوة الأولى لبناء البقع الخوارزمية. تحقق "النقاط المسار (مع مرور الوقت)." التحقق "قطعة فقط منطقة سياحية،" إذا لزم الأمر. الشاشة (D) اختيار العائد على الاستثمار. راجع الخطوة 4.2 لمزيد من التفاصيل. (E) والعديد من النوافذ اللازمة لتحديد القطر من بقعة قياسها. وحات تمثل: التحول من تفوق إلى وضع شريحة باستخدام نافيgation بار في الأعلى، بالضغط على طرفي القطبية من بقعة، حيث القطر يقاس عرض، عادة على اليمين المتطرف الجانب، حيث لدخول قطر قياسها. نرى خطوات 4،3-4،4. (F) وتصفية الجودة بقعة وصفها في 4.5-4.5.3. (G) تحرير البقع نافذة وصفها في 4.5.7. (H) المسارات قياس وعرض المسارات النوافذ، وصفت في 4.6. (I) مرشح المسارات نافذة صفها في 4.7. (J) تحرير المسارات نافذة وصفها في 4.7.1. (K) شاشة حفظ البيانات الموصوفة في 4.7.2. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا وصف استخدام TIRFM لتصور بوساطة بالكلاذرين الإلتقام (CME) على مستوى الأفراد نقط التحكم الحرجة في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي. CME هو الحدث السريع والديناميكي للغاية بوساطة الأثر التراكمي لأحداث فردية العديد مكانيا وزمانيا منفصلة. معظم المقايسات التي يتم استخدامها حاليا، مثل القياسات البيوكيميائية لتدخيل باستخدام biotinylation السطح أو يجند ملزم، التدفق الخلوي أو خلايا ثابتة فحوصات قياس كمية البروتينات المنضوية، أو الإلكترون المجهري التعريب من البروتينات، ورصد التغيرات في فرقة الترجمة البروتين في نقطة زمنية محددة . وكانت هذه الأساليب القائمة مفيدة جدا في تحديد البروتينات التي هي ضرورية لCME، ولكنها تفتقر إلى القرار المكانية والزمانية يطابق المقاييس الفسيولوجية للCME أو عمليات الاتجار غشاء حيوي آخر. هذا هو المهم، كما تشير الأدلة مؤخرا أن نقط التحكم الحرجة هي غير متجانسة في تكوين البروتين، وديناميات 9-12، وكما هو المرجح ينظم CME بسرعة بطريقة منفصلة مكانيا. يوفر TIRFM الخلايا الحية القدرة على تحليل CME على مستوى فصل نقط التحكم الحرجة مكانيا واحد، في الوقت الحقيقي، في الخلايا الحية.
التطبيق الناجح لهذا الاختبار قوي يعتمد على عاملين رئيسيين: الصحة الجيدة للخلايا وتحليل دقيق للمعالم CME. لالسابق، والتعبير السليم للبروتينات ذات الكلمات الدلالية وتقنيات المجهر تقليل الضيائية حاسمة. خطوط الخلايا معربا عن ستابلي-البروتينات ذات الاهتمام مثالية، حيث أن مستويات التعبير يمكن تقديرها بشكل موثوق. نحن علامة المستقبلات إما مع N-الطرفية العلم حاتمة أو علامات SPH 21-25. في حين لم الضرورة القصوى، سواء أنظمة وضع العلامات تسهل TIRFM من CME لمستقبلات يمكن الكشف عنها بشكل انتقائي في غشاء البلازما في بداية التجربة. ويمكن أيضا المكونات الإضافية المطلوبة يتم التقامي عابر في هذه خطوط الخلايا مستقرة. آروأشار البروتوكول ansfection هنا هو الأمثل للتصوير CME باستخدام TIRFM. أولا، يتم تفصيلها لأنه حتى المستويات المعتدلة والتعبير. سوء التعبير يتطلب أعلى قوة الليزر للكشف ويزيد من خطر على حد سواء الضيائية photobleaching من و. وعلاوة على ذلك، لأن هذا الاختبار يسجل اختفاء نقاط ونقط التحكم الحرجة والمنضوية، وإشارات منخفضة وphotobleaching من تضر أيضا إلى تحليل. نقترح، في ظل هذه الظروف، يتم تخفيض المدة الإجمالية و / أو تواتر التصوير. ثانيا، حضانة قصيرة من الكواشف ترنسفكأيشن على الخلايا، والفاصل الزمني بين ترنسفكأيشن والتجربة، ومرور جديدة من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل إلى coverslips قبل التصوير، والتأكد من أن جميع الخلايا المصورة هي في تمام الصحة. ثالثا، وهذا يضمن أن غالبية الهياكل بالكلاذرين هي نقط التحكم الحرجة، وصحائف يست مسطحة من بالكلاذرين بالكلاذرين أو لويحات. رابعا، يقلل هذا البروتوكول ينته التعبير عن مكونات CME transfected، التي كانت تظهرن لتغيير ديناميات CME 20،26.
للتصوير مع انخفاض الضيائية، من المهم لتحسين نظام التصوير للقرار الأمثل والحساسية القصوى. يجب أن تكون مطابقة التكبير الهدف والكاميرا حجم كاشف لتقليل التكبير الناقص أو الإفراط وفارغ. والفتحة العددية عالية (1.45 أو أعلى) الهدف TIRF ينبغي أن تستخدم لجمع الحد الأقصى للضوء ممكن. نحن الحصول على صور مع كاميرا الجهاز إلى جانب تهمة ضرب الإلكترون لكفاءة عالية الكم، مرات التعرض المنخفضة، وبسرعة قراءات سريعة. بالإضافة إلى ذلك، لضمان صحة الخلايا، يتم تصوير أنهم في وسائل الاعلام يبوفيتش، التي يتم تخزينها مؤقتا مستقلة عن CO 2، وتستكمل مع 10٪ FBS، في غرفة مغلقة تماما المنصوص إلى 37 درجة مئوية. لأن TIRFM حساس للغاية وأهداف الفتحة العددية العالية المستخدمة يمكن الكشف حتى الحد الأدنى من الإضاءة المحيطة، فمن الأهمية بمكان لخلق بيئة التصوير المغلقة مجانامن الضوء الخارجي والاهتزازات التي قد تعطل البؤري غرامة.
من المهم أن نلاحظ أن أعمار المطلقة وديناميات معظم مكونات CME تختلف بشكل كبير على أنواع الخلايا، ومستويات التعبير عن البروتينات، ودرجة الحرارة، يوما بعد الطلاء، واختلافات أخرى في ظروف الثقافة 7،10،14،17،20، 25،27. وينعكس هذا في تغيرات كبيرة في الجداول الزمنية والتوزيعات لوحظ بين الجماعات المختلفة باستخدام هذه التقنية، وتحديد واضح لهذا الاختبار. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن أن نقط التحكم الحرجة على السطح السفلي للخلية، تصوير في TIRFM، تتصرف بشكل مختلف من أعلى سطح 23،25. بينما هو قابل للنقاش على النحو الذي يمثل سطح بدقة خلية "نموذجية" محاطة مكونات المصفوفة خارج الخلية في الأنسجة، وتفسيرات ديناميات CCP اطلعت عليها هذه التقنية تحتاج إلى النظر في هذا الاختلاف المحتملين. القوة الحقيقية للمقايسة، ولذلك، يكمن في مقارنة التغيرات في دynamics من نقط التحكم الحرجة، في نفس الخلايا تحت ظروف التربية متطابقة، بعد التلاعب الحادة، بما في ذلك تجميع جزيئات البضائع مثل GPCRs ردا على التنشيط. هذه المقارنة تسمح للتطبيع من التغييرات على الخلية نفسها، وبالتالي السيطرة على جميع المعلمات المذكورة أعلاه يمكن أن تحفز تغيرات في السلوك CCP.
نحن توظيف عادة كلا من التحليل اليدوي والآلي، المذكورة أعلاه، لتحليل الأحداث مدة التقامي: التحقق اليدوي والاعتراف موضوعي باستخدام Imaris برامج تحليل الصور. التحقق اليدوي الأيدي العاملة ووجود مكثف الوقت، ويقتصر من قبل عدد من نقط التحكم الحرجة يمكن للمستخدم الاعتماد، ولكن يمكن القول إن التقنية الأكثر دقة المتاحة. ويمكن للعين البشرية المدربة وتواصل بسهولة لتعقب CCP من خلال حركة الخلية، والتغيرات في الشكل أو التركيز، باستثناء بدقة لويحات ومعيبة بكسل. ويمكن أيضا الكشف عن تغيرات شكلية في CCP يدل عشية الانتهاءاليلة، كما هو مبين هي الشكل 3B و 3C. لا بد، مع ذلك، أن يبقى تحليل موضوعي ممكن ضمن هذه القيود. وهذا يتطلب تحديد المعايير التي يتم استخدامها باستمرار في جميع مجموعات البيانات. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا عادة تحليل الصور بطريقة مزدوجة التعمية، حيث سارعت أسماء الصورة بحيث تبقى الظروف غير معروفة للشخص تحليل الصور. الكشف الآلي، مثل استخدام "النقاط" و "المسار المدة" الخوارزميات في Imaris، ويمكن استخدامها للكشف عن معظم البقع التقامي في فيلم معين، وتوليد عدد العينة عالية. بينما العديد من الخيارات، بما في ذلك حسب الطلب خوارزميات معقدة للغاية 3،14،23،26،27، يجري إنشاء وموثوقية هذه الأساليب للكشف عن الأحداث التقامي الصحيحة مع تجنب الكشف زائفة يبقى القلق الأكبر. على سبيل المثال، في Imaris، حركة الخلية خلق الحواف الأمامية مشرق، لويحات، والخروج منيمكن إطارات التركيز رمي بسهولة قبالة خوارزمية بقعة الكشف، لأنه لديه ميل للكشف عن الهياكل مشرقة على أنها تتألف بشكل كامل من البقع. من أجل منع هذه البقع من أن يكون متصلا إلى مسار، يجب أن يكون كل إزالتها. يمكن إزالة البقع الشاذة واحدة التي ليست في الهياكل الكبيرة مثل لويحات مع تحرير البقع علامة التبويب، في حين ترتبط البقع يمكن إزالتها في وقت لاحق باستخدام علامة التبويب تحرير المسارات. كما يمكن إزالة البقع الشاذة مع عوامل تصفية مخصصة. على سبيل المثال، يظهر الشكل 3D مرشح كثافة استخدامها للحد من تجنب بما في ذلك اللوحات في الكشف CCP. مرشح الجودة هو مرشح آخر مفيد جدا لحذف النقاط الخاطئة. "الجودة" هو القياس التراكمي للسطوع وشكل جدت من خلال اتخاذ كثافة مضان من الفور وتصفية جاوس بواسطة ¾ من طول نصف قطرها 20 نقطة. تم العثور على منحنى الجودة تحت عوامل التصفية المختارة. وهو يصور عدد من البقع (ذ) الكشف عنعندما تكون الجودة هي قيمة معينة (خ). وانخفاض الجودة، الكشف عن المزيد من البقع. إذا كان مرشح جودة منخفضة جدا، وسوف يتم الكشف عن البقع التي لا يوجد فيها مضان مرئية، على العكس، إذا كان مرشح جودة عالية جدا، وسوف يتم الكشف فقط ألمع البقع. اتبع على طول منحنى نحو القيم اكبر (خ). فإن عدد البقع الكشف عن (ص) عادة ما تنخفض بشكل كبير. نقل العتبة السفلية إلى هذه النقطة. هذا هو الحد الأدنى من نقطة لوضع حد القاع. المساهمين الرئيسيين الآخرين لبقع كاذبة في مجال TIRF هم الإندوسومات أن تنتقل إلى المحيط الخارجي للخلية ودخول مجال TIRF. وهناك معيار قوي لإزالة هذه هو التنقل من البقع، أي تهجير البقع مع مرور الوقت. نقط التحكم الحرجة التحرك قليلا جدا إلا كجزء من حركة خلية كاملة، في حين الإندوسومات تظهر حركة البراونية أو توجه بسرعة. الخوارزميات الجديدة، في حين تحسنت بشكل ملحوظ، لا تزال صقل والأمثل 3،14،23،26،27. كما التقت هذهhods تصبح أكثر تطورا وموثوق بها، يمكننا تحليل المئات أو الآلاف من المواقع، دون الحاجة إلى التحقق منها يدويا في كل نقطة. حاليا، ومع ذلك، فإننا نقترح أن اثنين من هذه التحليلات أن تستخدم معا ليكمل كل منهما الآخر للتأكد من دقتها.
بروتوكول صفناها يمكن تكييفها بسهولة للإجابة على العديد من الأسئلة المتعلقة الإلتقام البضائع. ويمكن استخدامه لإجراء بسيط شارك في توطين الشحنات مع مكونات التعليم الطبي المستمر، وتستخدم لإظهار التغييرات على مكونات محددة لآلية التقامي نظرا للمؤثرات معينة. الفحص يمكن أيضا أن تتكيف بسهولة لأي عملية التقامي، مثل caveolae 28، التي تظهر تجمعات منفصلة من مكونات البضائع ومعطف، وإلى دراسة هذه العمليات الأساسية في أنواع الخلايا المتخصصة. في المستقبل، ويصبح أكثر انتشارا التحرير الجينوم 20،29،30، فإننا نتوقع أنه سيصبح الأسلوب المفضل لوضع علامات على المكونات، وهذا ديناميات والسلوك سسوف يتم تكريره المكونات المختلفة و أكثر من ذلك. معتبرا أن فهمنا للعمليات الخلوية تم مدفوعا إلى حد كبير في تحديد الجينات، والتعديلات البروتين، وinteractomes، الفحص الذي وصفها هنا يمثل واحدة من الحدود المقبلة من التحقيق، بمعنى. تعريف ديناميات الزمانية المكانية من هذه العمليات والآليات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 mm coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
- Ungewickell, E., Branton, D.
- Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
- Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
- Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
- Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
- Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
- Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
- Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
- Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
- Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
- Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
- Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
- Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
- Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
- Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
- Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
- Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
- Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
- Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
- Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G.
- Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
- Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
