Introduction
Het proces van clathrine gemedieerde endocytose (CME) is afhankelijk van de tijdige aankomst van de vele componenten van de clathrine gemedieerde endocytotische machines lading verzamelen en manipuleren van het plasmamembraan in de vesicles 1-3. CME is een initiatief van membraan vervorming en vracht-adapter eiwitten die bij ontluikende locaties van endocytose 1 bij elkaar komen. Deze eiwitten werven de manteleiwitgen clathrin, die assembleert in een kooi-achtige structuur die de clathrin coated pit (CCP) 4 vormt. Zodra de CCP volledig is geassembleerd in een bolvorm, membraan splitsing, voornamelijk door middel van acties van de grote GTPase, dynamin, genereert free-clathrin gecoate blaasjes (CCV) 5,6. Deze internalisatie veroorzaakt snelle demontage van de clathrine laag, waardoor de componenten worden hergebruikt voor meerdere ronden van CME.
De ontdekking en karakterisering van de bij CME eiwitten is geworteld in de traditionele Biochemical, genetische en microscopische technieken 4-6,8. Deze testen zijn de rol en de interactie punten van deze endocytisch componenten toegelicht. Hoewel zeer nuttig voor het definiëren essentiële onderdelen van handel machines, zijn deze bepalingen zeer beperkt vastleggen van het dynamisch gedrag van CME onderdelen of lading concentratie. Dit is een kritieke beperking, aangezien CME wordt door de choreografie samenstellen van sets van proteïne modules in gedefinieerde stappen, en aangezien kleine veranderingen in de dynamiek van afzonderlijke gebeurtenissen endocytotische grote cumulatieve gevolgen endocytose hebben. Verder recente gegevens blijkt dat individuele CCP kunnen verschillen zowel in samenstelling als in gedrag, wat suggereert dat de fysiologische regulering van deze taak zeer ruimtelijk en temporeel beperkt 9-14. Visualiseren individuele endocytische gebeurtenissen is dus essentieel om te begrijpen waarom er meerdere redundante eiwitten betrokken bij CME en hoe deze eiwitten kunnen worden gecontroleerd by fysiologische signalen om vracht internalisatie reguleren.
Hier beschrijven we het gebruik van totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRFM) CME observeren op het niveau van de dynamiek van individuele CCP in levende cellen. TIRFM berust op het verschil in brekingsindex tussen de glazen dekglaasje en vloeibare omgeving cellen 15,16. Wanneer het excitatie licht naar de cellen op dan de kritische hoek, wordt intern gereflecteerd, waardoor een verdwijnende golf die een dunne gebied van verlichting zich ongeveer 100 nm boven het dekglaasje handhaaft. Dit zorgt ervoor dat alleen de fluorescerende moleculen binnen deze smalle veld zijn enthousiast. Praktisch, dit maakt de excitatie van fluorescerende moleculen op of nabij het plasmamembraan en minimaliseert fluorescentie van de inwendige delen van de cel. Dit verschaft een aanzienlijk hogere signaal-ruisverhouding en z-as resolutie gebeurtenissen in de plasmamembraan, co visualiserenmpared meer algemeen gebruikte modi zoals conventionele epifluorescentie of confocale fluorescentie microscopie. We beschrijven ook op een inleidend en praktijk, het gebruik van een algemeen gebruikte beeldanalyse platform te analyseren en kwantificeren eenvoudige morfologische kenmerken en dynamica van individuele lading endocytische events.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Expressie van fluorescent label CME Components in gekweekte cellen
HEK293 cellen zijn bruikbaar model cellen die uitgebreid zijn gebruikt om GPCR biologie en endocytose studeren, en daarom worden gebruikt als modellen in dit protocol. Gebruik een transfectieprotocol verstrekken van eenduidige uitstraling zonder overexpressie en lage cytotoxiciteit.
- Behandel alle celcultuur in een steriele laminaire stroming kap. Vul 4 putjes van een 12-well plaat met 1 ml Dulbecco's Modified Essential Media (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS). Van een samenvloeiing T25 fles van HEK293 cellen verdunnen 1:50, 1:25, 1:16, 1:10, respectievelijk in elk van de 4 putten.
- Alternatief zaadcellen om een multi-well plaat van gewenste grootte, volgens instructies van de fabrikant. Seed 0,4-2 x 10 4 cellen in een 12-well plaat. Groeien de cellen gedurende de nacht in een steriele 37 ° C met 5% CO2 en 95% vochtigheid.
NB: Gezien het feit dat de groei rates variëren, afhankelijk van de omstandigheden en cellijnen, is het misschien beter om meerdere bronnen te zaaien om te zorgen ideaal samenvloeiing voor transfectie de volgende dag of de mogelijkheid van het uitvoeren van transfecties in tweevoud.
- Alternatief zaadcellen om een multi-well plaat van gewenste grootte, volgens instructies van de fabrikant. Seed 0,4-2 x 10 4 cellen in een 12-well plaat. Groeien de cellen gedurende de nacht in een steriele 37 ° C met 5% CO2 en 95% vochtigheid.
- De volgende ochtend, selecteer een goed dat ~ 70% confluent voor transfectie (zie figuur 1B). Als er geen goed deze staat heeft bereikt, wacht nog een dag.
NB: 70% samenvloeiing is ideaal voor HEK293 cellen. Transfecteren van cellen die schaarser resultaten in celdood en toxiciteit. Transfecteren over-confluente cellen resulteert in slechte expressie. - Voeg 60 ul buffer EC (bij transfectie kit), 400 ng van plasmiden die gelabeld GPCR en / of componenten van de clathrine machines, en 2,4 pl van Enhancer in 1,5 ml microcentrifugebuis, zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Vortex 2 seconden voldoende menging en draaien in een microcentrifuge bij 2000 xg gedurende 2 seconden om de vloeistof onderin verzamelen.
- Toevoegen6 pl Effectene zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Vortex 2 seconden en rotatie bij 2000 xg gedurende 2 seconden in een microfuge om de vloeistof onderin verzamelen. Wacht 20 minuten om voor vorming van transfectie complexe micellen.
- Zuig media uit de put te worden getransfecteerd. Voeg voorzichtig 0,8 ml van DMEM met 10% FBS aan de transfectie reagentia mengsel en meng door pipetteren en langzaam te verminderen breken van de micellen. Voeg de media en transfectie mengsel aan de put langzaam vanaf de zijkant. Commentaar resterende transfectie mengsel uit de microcentrifugebuis het goed om met een micropipettor.
OPMERKING: Eventueel een extra 0,5 ml DMEM met 10% FBS aan de getransfecteerde cellen goed aan de extra voeding resulteert in zachtere transfectie en onderste tijdelijke expressie geven. - Zet de cellen om de 37 ° C incubator gedurende 5 uur.
- Zuig medium dat de transfectie mengsel. Te vervangen door 1 ml DMEM met 10% FBS. Toestaande cellen een nacht groeien.
- De volgende dag voorbij de cellen ongecoate dekglaasjes, gesteriliseerde autoclaaf.
- Voeg 0,5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 1 mM EDTA aan elk putje. U kunt ook 0,5 ml van 0,05% trypsine-EDTA. Laat in de incubator gedurende 1 minuut.
- Plaats 3 ronde, steriele 25 mm dekglaasjes in afzonderlijke putjes van een 6-wells plaat. Vul elk putje met 2 ml medium. Duw de dekglaasje naar de bodem van de put te voorkomen dat cellen groeien op de bodem van het dekglaasje.
- Handmatig schudden de put te heffen van de cellen van de bodem van de put. Voeg 1 ml van DMEM met 10% FBS te mengen. Verdeel de opgeheven cellen van 1 putje van een 12-well plaat gelijkmatig over de 3 dekglaasjes. Als alternatief, plaat cellen op 3 glazen bodem gerechten.
- Laat de cellen groeien op dekglaasjes gedurende ten minste 48 uur voor de beeldvorming. Ervoor zorgen dat cellen worden verspreid en plat.
2.Imaging CCP en Cargo Dynamics behulp TIRFM
- Conjugaat M1 anti-FLAG antilichamen met Alexa kleurstoffen met Alexa Fluor Protein Labeling Kit volgens het protocol van de fabrikant. Als alternatief kan pre-geconjugeerde antilichamen worden gekocht.
- Pre-incubeer cellen met de antilichamen bij een 1: 1000 verdunning in 1 ml voorverwarmde Leibovitz medium met 10% FBS of Opti-MEM met 50 mM HEPES pH 7,4 en 10% FBS gedurende 10 minuten bij 37 ° C (imaging medium), om-FLAG gelabeld GPCR label op het celoppervlak. Door deze stappen als genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten zoals GFP, worden gebruikt als tags (zie bespreking voor details).
- Breng de dekglaasje om een live-cell imaging kamer. Als alternatief voor de glazen bodem gerechten, aspireren antilichaam-etikettering media en voeg 700 ul van voorverwarmde beeldvorming medium.
- Gebruik een pincet en buig het uiteinde van een 25 gauge naald in een haak.
- Houd een pincet in de dominante hand. Houd de gebogen naald in de otheh. Draai de naald totdat de haak bochten naar beneden richting het glas. Sleep voorzichtig de naald, haak naar beneden, over de bodem van een 6-well plaat totdat het haakt op het dekglaasje. Let erop dat u geen krassen op het oppervlak van het dekglaasje, zoals cellen los. Til het dekglaasje van de bodem van de put. De balans van de dekglaasje tegen wand van de put voor ondersteuning.
- Gebruik de tang te vatten in de buurt van de rand van het dekglaasje en beweeg het dekglaasje cel kant tot aan de beeldvorming kamer, en monteer de kamer. Voeg 700 ul (of juiste hoeveelheid) van voorverwarmde beeldvorming medium. Behandel de dekglaasjes voorzichtig zonder druk om te voorkomen dat scheuren of breken.
- Breng de kamer op de microscoop en houd de temperatuur van de cellen bij 37 ° C met een thermostaatbad of een afgesloten incubator.
- Breng cellen in beeld met behulp van een 100X of 60X TIRF olie-immersie objectief (1.45 NA of hoger). Afbeelding van de cellen in conventionele epifluorescentie of confocale vormen van verlichting (dus niet TIRFM) aan cellen die de juiste constructies te identificeren. Out-of-focus cellen zijn bijna onzichtbaar in de dunne diepte van TIRF verlichting waardoor het moeilijk is om de focal plane en cellen te vinden.
OPMERKING: Sommige systemen maken gebruik van dezelfde lasers voor TIRFM op de foto om in conventionele epifluorescentie, door het verplaatsen van de invalshoek van de laser boven de kritische hoek. Als een belangrijke veiligheidsmaatregel, altijd op de hoogte van de hoek van de laserstraal en richt deze altijd uit de buurt van de waarnemer. - Focus naar het bodemoppervlak van een cel tot expressie totdat de omtrek van plasmamembraan rond de cel verdwijnt en het centrum van de cel weergegeven. Dit is het duidelijkst bij een plasmamembraan gelokaliseerde lading eiwit zoals de μ-opioid receptor (zie Figuur 2A).
- Schakel over naar TIRF beeldvorming.
- Bij gebruik van dezelfde lasers voor beeldvorming in conventionele epifluorescentie, verhoging van de invalshoek van delaser tot out-of-focus fluorescentie in het inwendige van de cel verdwijnt, en geen overzicht van plasmamembraan rond de cel waargenomen. (Vergelijk figuur 2C figuren 2A en 2B)
OPMERKING: In TIRFM, het verplaatsen van de focal plane zorgt ervoor dat de afbeelding om volledig uit te gaan van de focus en / of dimmen, en de totale fluorescentie niveau daalt als gevolg van de kleinere diepte van verlichting. Daarom is een alternatieve methode om naar TIRFM verlichting is eerst gericht op het midden van de cel confocale / conventionele epifluorescentie, verhoog de invalshoek totdat grootste verlies van de fluorescentie en dan richten naar de plasmamembraan. - Eenmaal in TIRFM, zorgen voor de excitatie laser reflecteert terug door de objectieve en niet zichtbaar is boven de doelstelling. Bevestig deze door te controleren of de laserspot zichtbaar.
OPMERKING: In conventionele epifluorescentie of confocale modes, de laser verlichting is zichtbaar boven de doelstelling,zoals aan het plafond. - Verfijn de focus om een scherp beeld te krijgen. De belangrijkste componenten van de endocytische machine, zoals clathrine, zichtbaar in puncta wordt. Pas de focus op fijne, zodat de puncta zijn zo rond mogelijk.
OPMERKING: Voor-gelokaliseerde lading, past u de fijne scherpstelling totdat de filopodia verschijnen verschillend. - Gebruik een overname programma om alle beeldvormende parameters zoals spiegels en TIRF hoek slaan. Doe dit voor alle noodzakelijke golflengten.
- Bij gebruik van dezelfde lasers voor beeldvorming in conventionele epifluorescentie, verhoging van de invalshoek van delaser tot out-of-focus fluorescentie in het inwendige van de cel verdwijnt, en geen overzicht van plasmamembraan rond de cel waargenomen. (Vergelijk figuur 2C figuren 2A en 2B)
- Scan rond dekglaasje aan cellen die alle gewenste endocytische markers voorbeeld: de μ-opioïde receptor en de adapter β-arrestin in het in figuur 3A voorbeeld. Selecteer cellen die expressie maar niet overexpressie. Zie bespreking voor details.
- Eenmaal geïdentificeerd zijn, krijgen beelden elke 3 seconden voor 10 minuten. Dit is voldoende om de levensduur van een CCP vangen, aangezien de gemiddelde levensduur van een CCP in HEK293 cellen afgebeeld onder deze omstandigheden around 40 sec 10-11. Hierdoor kan ongeveer 12-14 frames om de CCP te observeren. Zo zie Film 1. Herhaal alle stappen op de foto om bijkomende cellen.
3 Analyse van Endocytische Dynamics door Manual Verification
Hoewel de handmatige controle van de CCP levens wordt sterk beperkt door het aantal CCP's die kunnen worden gedetecteerd, blijft het nog steeds een accurate wijze van opsporing zich niet afschrikken door de wereldwijde veranderingen in het beeld en detectie artefacten. Zie bespreking voor details.
- Open het bestand in ImageJ. Beelden worden opgeslagen als een enkele stapel van tiff-bestanden met interleaved kanalen. Afbeeldingen converteren naar hyperstacks. Ga naar Afbeelding> Hyperstacks> Stapel aan HyperStack. Voer het aantal kanalen verworven (dwz als beeldvorming β-arrestine en de μ-opioïde receptor, voer 2), toets een 1 voor Z-stack (TIRFM is een enkel vlak), en het aantal frames van de film (dat wil zeggen een 10 minuten film 1 beeld per 3 sec is 200) in het pop-up venster.
- De HyperStack formaat levert een venster met twee schuifbalken. Gebruik de bovenste balk om door de kanalen en de bodem om door de tijd. Naar het kanaal van de proteïne waarvan levens worden getest.
- Verplaatsen naar het frame 10 of 15 van de film aan het opnemen van reeds bestaande centrale tegenpartijen wiens gehele duur niet zichtbaar verminderen. Teken een ROI kader rond een plek willekeurig gekozen.
- Tel het aantal frames een vlek zichtbaar.
OPMERKING: Zie Figuur 3B en 3C naar voorbeelden van drie morfologische categorieën endocytisch gebeurtenissen 10,11,16-19.
4 Analyse van Endocytische Dynamics doelstelling Recognition
Doelstelling herkenning maakt detectie van vrijwel alle CCP afgebeeld in een cel, maar kan gevoelig voor fouten als gevolg van valse detectie van foutieve structuren. Zie bespreking voor details het afwegen van de voor-en nadelen van each methode. Verschillende programma, zoals op maat gemaakte algoritmes kunnen worden gebruikt om objectief detecteren CCP. Dit protocol beschrijft objectieve erkenning van ctp gebruik Imaris, een beeld-analyse software (zie ook Materiaal).
- Om te beginnen, opent u het rauwe beeldbestand in het beeld-analyse software. Standaard wordt het een samengevoegde kleur. Gebruik het venster "Weergave aanpassen" om de helderheid van een kanaal aan te passen. Klik op de naam van een kanaal om de getoonde kleuren te wijzigen. Schakel het selectievakje naast het kanaal om het display te voorkomen (zie figuur 4A).
- Creëren "Spots" door te klikken op het icoon met oranje vlekken. Zie Figuur 4B. Selecteer een regio of Interest (ROI) rond de cel. Zie Figuur 4C. Gebruik een ROI om gebieden die ten onrechte heldere voorste randen en plaques zal detecteren sluiten. Analyseer meerdere cellen met verschillende expressie niveaus afzonderlijk.
- Meet de diameter van een plek om te bepade eerste ramingen voor het algoritme. Schakel over naar "Slice"-modus, en klik op de polaire uiteinden van een plek om de diameter te meten. Zie figuur 4E. Doe dit voor 4 of 5 ronde vlekken die kunnen wijzen op een CCP kijken naar de hoogte van de stabiliteit, na de vorming en vóór splitsing. Gebruik deze metingen om de gemiddelde diameter te berekenen tot op het dichtstbijzijnde tiende van een micron.
- Detecteren Spots. Ga terug naar "Overtref" modus. Kies het juiste kanaal voor de detectie. Voer de gemiddelde gemeten diameter, meestal 0,3 of 0,4 micrometer. Klik op de blauwe pijl vooruit naar de Spots kwantificeren. Zie figuur 4E. Indien de diameter van Locaties onderschat zal valse punten van fluorescentie worden geïdentificeerd als spots. Als de diameter te groot is, zal waar Locaties genegeerd. Als niet zeker weet, schatten een beetje lager, en filteren op de onjuiste detecties later.
- Filter Spots door Quality. Pas de filter om zo veel Spots mogelijk vast te leggen, zonder teruggrond. De kwaliteit filter is standaard geselecteerd 20. Zie Figuur 4F.
- Gebruik de "Kwaliteit" curve als een gids voor een passende drempel. Verplaats de onderste drempel van het filter met de linker muisknop om deze eerste duik in de curve. Dit is een goed uitgangspunt voor het filter, als deze positie verfijnt meestal detectie om alleen toegankelijk Spots. Zie Figuur 4F.
- Gedetecteerd Spots op de film als bollen of centrum pixels. Via het tabblad "Kleuren", past de kleur van de vlekken van een contrasterende kleur om het gemakkelijker maken om ze te zien. Blader door de film te herzien de Spots in elk frame. Het doel is om zo veel Spots mogelijk te ontdekken voor het geheel van hun leven.
- Elimineer dimmer Spots of handmatig sluit ze in continue tracks later op, omdat ze niet goed in de loop van hun leven worden ontdekt.
- Verwijder heldere plaques met een "Intensity" filter, indien nodig. Klik op het groene plusteken om een nieuw filter toe te voegen. Zie Figuur 4F. Maak een Intensity filter te filteren in of uit Spots van een bepaalde fluorescentie signalen. Gebruik de gegenereerde intensiteit curve, (analoog aan Quality Curve besproken in 4.5) om de drempel. Gebruik de linker muisknop om de uiterste linkerkant van de curve die de helderste Spots vertegenwoordigt verwijderen.
OPMERKING: Large plaque structuren behoren gewoonlijk tot de helderste elementen in de cel, en ze zijn gemakkelijk uitgesloten met dit filter. - Doorloop de film zodat de CCP worden gedetecteerd als Locaties en helderste plaques worden niet meer waargenomen. Figuur 3D toont een cel waar detectie van CCP (aangeduid met witte gebieden) werd geoptimaliseerd met de kwaliteit filter en plaques werden uitgesloten van de kwaliteit filter.
- Verminder heldere celranden de kwaliteit filter. Bright voorwerpen kunnen nog steeds handmatig worden verwijderd bij de volgende stap. Ga verder met de blauwearrow.
- Verwijder afwijkende Spots in het scherm Spots Bewerken. Schakel over naar "Select"-modus. Klik op de plek. Het wordt geel. Klik op "Verwijderen". Klik op de blauwe pijl om verder te gaan bouwen van het algoritme. Zie Figuur 4G.
- Maatregel tracks. Stel tracks "Brownse beweging. 'De CCP mag vertonen alle gerichte beweging slechts minimale drifting over het plasmamembraan. Dit algoritme is het meest geschikt voor die beweging. Zie figuur 4H.
- Zet de Max Afstand tot een kleine waarde, zoals 0,7 micrometer. Zie figuur 4H.
OPMERKING: een kleine afstand instellen minimaliseert aansluiting van aangrenzende Spots en nog steeds zorgt voor een voortdurende opvolging van een cel spot door CCP of cel beweging. - Stel Max Gap Size tot 1 Hiermee track blijven als er slechts een lijst ontbreekt elkaar. Klik op de blauwe pijl om tracks te berekenen. Zie figuur 4H.
OPMERKING: Gap maten van meer dan 3 oorzaken verschillende tracks worden niet correct met elkaar verbonden. - Schakelaar spoor bekijken op "Dragon Tail." Scroll door de film het observeren van de detectie kwaliteit. Als aangrenzende Spots zijn verbonden, verlaagt de Max Afstand minder dan 0,7 micrometer. Als Spots worden opgebroken te gemakkelijk, verhogen het Max Gap Size. Klik op de blauwe pijl om tracks te maken. Dit leidt tot het gaasfilter tracks. Zie figuur 4H.
- Zet de Max Afstand tot een kleine waarde, zoals 0,7 micrometer. Zie figuur 4H.
- Tracks filter en exporteren van gegevens. Gebruik een "Intensity" filter om extra heldere plaques te verwijderen. Gebruik een "Verplaatsing" filter om endosomes dat het veld TIRF gaan verwijderen. Wees voorzichtig, als langere Spots langere verplaatsingen zal hebben ook. Klik op de groene dubbele pijl om het protocol te voltooien. Zie Figuur 4I.
- Gebruik het tabblad Bewerken Tracks, met het pictogram potlood, om vals-positieve detecties van nummers die niet konden worden verwijderd door filters te verwijderen. Controleer op discontinuities of valse verbindingen. Op de twee sporen aan te sluiten, selecteert u ze met behulp van Ctrl-Links-klik, klik dan op "Connect" in het vak Bewerken Tracks. Tracks in afzonderlijke plekken verbreken, selecteert u een track en klik op "Disconnect". Selecteer meerdere Spots met Ctrl + Links-klik en klik op "Connect" om een nieuwe track te maken. De methode is hetzelfde voor Spots bewerken, in 4.5.7 beschreven. Zie Figuur 4J.
- Om gegevens te exporteren, gaat u naar het tabblad statistieken. Klik op het diskette icoon enkel om de geselecteerde statistiek exporteren. Klik op het pictogram dat lijkt op een reeks diskettes om alle statistieken te exporteren. De "Tijdsduur" statistiek bevat de lengte van de endocytische tracks. Zie Figuur 4K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van levende cellen TIRF Microscopie we de endocytische dynamiek van de μ-opioïde-receptor (MOR) hebt opgenomen, een G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) en haar endocytisch adapter eiwit β-arrestine. De β-arrestin construct werd transiënt getransfecteerd in een stabiele wijze MOR cellijn die het protocol geschetst in figuur 1, en afgebeeld 96 uur later. De MOR in de stabiele cellijn N-terminaal gelabeld met een pH-gevoelige GFP. Dit fluorescerend eiwit fluoresceert alleen in de neutrale extracellulaire vloeistof. Ook de MOR endocytoses alleen een agonist eenmaal geactiveerd en blijft anders gelijkmatig verdeeld over het plasmamembraan. Focussen op de aanhangende plasmamembraan die zit op de cover-glas in confocale mode resulteert in een cel die wordt ingevuld met een dim fluorescentie. Dit verschilt van een gericht op het midden van de cel, waarbij de plasmamembraan alleen beschouwd als een ring van fluorescentie rond de cel. Vergelijk de linkeren rechter panelen in figuur 2A. Schakelen conventionele epifluorescentie of TIRF met een onjuiste hoek veroorzaakt onscherp fluorescentie zichtbaar worden dezelfde cellen zoals getoond in figuur 2B. Wanneer de TIRF hoek juist is het plasmamembraan is zeer helder, duidelijk en helder en onscherp fluorescentie niet langer verstoort het beeld. Vergelijk Figuur 2C figuren 2A en 2B.
Het beeld is helder en scherp omdat de MOR op het adherent plasmamembraan, die grotendeels binnen het TIRF. Daarentegen β-arrestin blijft een cytosolisch zwembad als nog niet aangetrokken om endocytische puncta en lijkt wazig en onscherp omdat het niet op het gebied TIRF. Zodra de MOR wordt geactiveerd door een agonist, wordt β-arrestin gerekruteerd naar de plasmamembraan, en beide β-arrestin en de receptor herverdelen CCP (figuur 3A en Film 1 , Β-arrestine in groen, MOR in rood, overlay is geel).
De levensduur van deze clusters kunnen handmatig worden gekwantificeerd met de drie parameters voor voltooide endocytose zoals in figuur 3B. De vlekken duiden CCP's kunnen ofwel volledig verdwijnen (zie ook figuur 3C), "blink" aan en uit of "knijpen" een grotere structuur. De laatste twee voorwaarden vertegenwoordigen gebeurtenissen die ruimtelijk te worden dicht bij elkaar worden opgelost als afzonderlijke gebeurtenissen. The Spot algoritme in Imaris is ook nuttig te kwantificeren CCP, zoals geschetst in figuur 4. Figuur 3D zit je CCP gedetecteerd middels Imaris na filtering niet-dynamische plaque structuren te verwijderen. Overtrok witte bollen duiden gedetecteerd plekken. Dimmer vlekken die niet kon worden gedetecteerd voor de gehele levensduur werden uitgesloten van de "kwaliteit" filter.
">
Figuur 1: Stroomschema van transfectieprocedure. (A) Ten eerste zaad verschillende verdunningen (1:50, 1:25, 1:16, 1:10) op een 12-well plaat. Laat cellen een nacht groeien. De volgende dag, op zoek naar een goed, dat is ongeveer 70% samenvloeiing, en gelijkmatig verdeeld, zoals afgebeeld. Dit is de put, die zullen worden getransfecteerd. (B) Voeg 60 ul van EG-buffer en 400 ng DNA in een microcentrifugebuis. Vortex gedurende 10 seconden en draaien de vloeistof bodem van de buis. Voeg 2,4 ul van Enhancer. Vortex 2 sec draaien de vloeistof bodem van de buis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. Voeg 6 pi Effectene. Vortex 2 sec draaien de vloeistof bodem van de buis. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min. (C) roerend 0,8 ml van DMEM met 10% FBS bij de transfectie. Toevoegen aan cellen in eerder goed gekozen. Incubeer cellen gedurende 5 uur bij 37 ° C. Vervangen met verseDMEM met 10% FBS.
Figuur 2: Het vinden van het veld TIRFM. (A) De plasmamembraan afgebeeld in confocale. Het linker paneel toont cellen in confocale met een focus op het midden van de cel. Het plasmamembraan wordt alleen gezien als een 'ring' rond de cel. Gericht naar de basale plasmamembraan, grenzend aan het dekglaasje zorgt de cel te vullen met een dim fluorescentie. Het plasmamembraan "ring" niet zichtbaar in de dunnere TIRF veld. (B) De basale plasmamembraan met een ondieper TIRF hoek produceren conventionele epifluorescentie verlichting door het monster. Dit verlicht de gehele cel en veel van de focus fluorescentie van de bovenkant van de cel aanwezig is. (C) het plasmamembraan in TIRF. Focussen op filopodia helpt om dit vliegtuig te vinden. Merk op dat heteen gladde enkel vlak. Schaal bars zijn 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: visualisatie en kwantificatie van Endocytische gebeurtenissen in TIRF. (A) een cel die de μ-opioïde-receptor (MOR) en β-arrestin voor en na toevoeging van een agonist die endocytose induceert. De agonist veroorzaakt herverdeling van beide eiwitten endocytotische puncta. Schaal bar is 10 micrometer. (B) Drie soorten endocytisch gebeurtenissen, gezien door arrestine dynamiek, consistent met eerder beschreven morfologie visualiseren. "Steady", een stabiel signaal dat snel verdwijnt. Dit is de belangrijkste soort, wat aangeeft dat de CCP heeft gebloeid had en verliet het veld TIRF. "Blink", een signaal dat knippert een lagere signaal en verschijnt op dezelfde plaats door montage van een tweede CCP op dezelfde plaats. "Knijp off", een buisvormige projectie komt uit een plek, wanneer twee CCP's zijn te dicht bij elkaar worden opgelost als aparte vlekken, en een is endocytosed. De doos is 2 x 2 micrometer. (C) Het visualiseren clathrin endocytose van MOR bij een eenmalige gebeurtenis resolutie. Twee voorbeelden die grote fractie MOR endocytotische gebeurtenissen representeren getoond. Frames zijn elke 3 sec. De doos is 2 x 2 micrometer. (D) Detectie van individuele endocytisch gebeurtenissen met behulp Imaris. Witte gebieden duiden CCP's gedetecteerd als Spots. Spot detectie werd geoptimaliseerd met behulp van een "Quality" filter. Dimmer vlekken die niet kon worden gedetecteerd voor het geheel van hun leven werden uitgesloten van de kwaliteit filter. Grote plaque structuren die worden weergegeven als zijnde onopgemerkt waren weggelaten met behulp van een "Intensity" filter.ig3large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Doelstelling Erkenning van de dynamiek van Endocytische Events behulp Imaris. (A) Het venster Toon Adjustment, gebruikt voor de weergave van het beeld aan te passen zoals beschreven in stap 4.1. (B) Het openen van de "Spots" algoritme bouwer. De builder wordt in onderstaande venster. (C) De eerste stap van het algoritme Locaties builder. Controleer "Track vlekken (in de tijd)." Check "segment slechts een regio van belang," indien nodig. (D) ROI selectie scherm. Zie Stap 4.2 voor details. (E) De meerdere vensters noodzakelijk om de diameter van een afgemeten Spot definiëren. Panelen vertegenwoordigen: overschakelen van Overtref naar Slice-modus met de Naviting Bar op de top, op de polaire uiteinden van een plek, waar de gemeten diameter wordt weergegeven, meestal op de uiterst rechts, waar de gemeten diameter in te voeren. Zie Stappen 4,3-4,4. (F) De spot Kwaliteit Filter in 4.5-4.5.3 beschreven. Venster (G) Bewerken plekken in 4.5.7 beschreven. (H) Meet tracks en het bekijken van tracks ramen, in 4.6 beschreven. (I) Tracks filtervenster beschreven in 4.7. (J) het bewerken van tracks raam in 4.7.1 beschreven. (K) Sla gegevens scherm in 4.7.2 beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Film 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we het gebruik van TIRFM naar clathrine gemedieerde endocytose (CME) op het niveau van individuele CCP visualiseren in levende cellen in real time. CME is een snelle en zeer dynamische evenement gemedieerd door het cumulatieve effect van de vele ruimte en tijd gescheiden individuele gebeurtenissen. De meeste tests die momenteel worden gebruikt, zoals biochemische meting van opname middels oppervlak biotinylering of ligand binding, stroomcytometrie of gefixeerde cellen assays meten hoeveelheid geïnternaliseerd eiwitten of elektronenmicroscopische lokalisatie van eiwitten, bewaken ensemble veranderingen in eiwit lokalisatie op vaste tijdstippen . Deze bestaande methoden zijn zeer nuttig geweest bij het identificeren van eiwitten die nodig zijn voor de CME, maar missen de ruimtelijke en temporele resolutie die overeenkomt met de fysiologische schalen van CME of andere dynamische membraan mensenhandel processen. Dit is belangrijk, aangezien recente gegevens blijkt dat CCP's zijn heterogeen in hun eiwitsamenstelling en dynamiek 9-12, en als CME is waarschijnlijk snel geregeld in een ruimtelijk discrete manier. Levende cellen TIRFM biedt de mogelijkheid CME analyseren op het niveau van ruimtelijk gescheiden enkelvoudige CTP, in real time, in levende cellen.
Succesvolle toepassing van deze krachtige assay berust op twee belangrijke factoren: gezondheid van de cellen en grondige analyse van de parameters van CME. Voor de eerste, juiste expressie van gelabelde eiwitten en microscopische technieken minimaliseren van fototoxiciteit zijn kritisch. Cellijnen stabiel-uiting van de eiwitten van belang zijn ideaal, omdat de expressie niveaus betrouwbaar kan worden geschat. We tag de receptoren met ofwel N-terminale Flag epitoop of SpH labels 21-25. Hoewel niet strikt noodzakelijk, zowel labelsystemen vergemakkelijken TIRFM CME omdat receptoren selectief kan worden gedetecteerd op het plasmamembraan bij aanvang van het experiment. De gewenste extra endocytische componenten ook transiënt worden getransfecteerd in deze stabiele cellijnen. De transfection protocol opgemerkt hier is geoptimaliseerd voor beeldvorming CME gebruik TIRFM. Allereerst wordt op maat gemaakt voor gelijkmatig en expressieniveaus. Slechte expressie vereist hogere laservermogen voor detectie en verhoogt het risico voor zowel fototoxiciteit en fotobleking. Verder, aangezien deze test registreert de verdwijning van puncta geïnternaliseerde CCP, lage signalen en fotobleken nadelig eveneens analyse. Wij stellen voor dat, onder deze omstandigheden, de totale duur en / of de frequentie van de beeldvorming worden verminderd. Ten tweede, de korte incubatie van de transfectie reagentia op de cellen, het interval tussen transfectie en het experiment en de verse passage van getransfecteerde cellen dekglaasjes voor beeldvorming, al garanderen dat de afgebeelde cellen in optimale gezondheid. Ten derde zorgt dit ervoor dat de meerderheid van clathrine structuren CCP en niet vlakke platen van clathrine of clathrine plaques. Ten vierde, dit protocol minimaliseert overexpressie van getransfecteerde CME onderdelen die toon isn naar CME dynamiek 20,26 veranderen.
Voor beeldvorming met lage fototoxiciteit, is het belangrijk dat het beeldvormingssysteem te optimaliseren voor optimale resolutie en maximale gevoeligheid. De vergroting van het objectief en de camera detector grootte moeten worden afgestemd om te begrijpen of oversampling en lege vergroting minimaliseren. Een hoge numerieke apertuur (1.45 of hoger) TIRF doel moet worden gebruikt om de maximale licht te verzamelen. We krijgen beelden met een elektronen vermenigvuldiging ladingsgekoppelde inrichting camera voor hoge quantum efficiency, lage belichtingstijden en snelle uitlezing snelheden. Bovendien, de gezondheid van de cellen te verzekeren, worden zij afgebeeld in Leibovitz media, die onafhankelijk van CO2 wordt gebufferd, en gesupplementeerd met 10% FBS, in een volledig afgesloten ruimte ingesteld op 37 ° C. Omdat TIRFM is zeer gevoelig en de hoge numerieke apertuur doelen voor zelfs geringe omgevingslicht te detecteren, is het essentieel om een gesloten imaging omgeving zonder creërenvan extern licht en trillingen die de fijne focal plane kunnen verstoren.
Het is belangrijk op te merken dat de absolute levensduur en dynamiek van de meeste componenten van CME variëren sterk afhankelijk celtypen expressie van eiwitten, temperatuur, dagen na plating, en andere variaties in kweekomstandigheden 7,10,14,17,20, 25,27. Dit wordt weerspiegeld in de grote variaties in de termijnen en verdelingen waargenomen tussen verschillende groepen met deze techniek een duidelijke beperking van deze assay. Verder is het mogelijk dat CCP aan de onderkant van de cel, afgebeeld in TIRFM, gedragen zich anders het bovenoppervlak 23,25. Hoewel het de vraag in welk oppervlak nauwkeurig vertegenwoordigt een 'typische' cellen omgeven door extracellulaire matrix componenten in een weefsel, interpretaties van CCP dynamiek gezien door deze techniek moet dit potentiaalverschil te overwegen. De ware kracht van de assay ligt dus veranderingen in d vergelijkenynamics van CCP, in dezelfde cellen onder identieke kweekomstandigheden na acute manipulaties, waaronder de clustering van lading moleculen zoals GPCR in response op activering. Deze vergelijking levert normalisatie van de wijzigingen in dezelfde cel, waardoor controle voor alle hierboven die sectie genoemde variaties in CCP gedrag veroorzaken parameters.
Wij gebruiken meestal zowel handmatige als geautomatiseerde analyses, zoals hierboven beschreven, om de duur van endocytisch gebeurtenissen te analyseren: handmatige verificatie en objectieve erkenning via de Imaris software voor beeldanalyse. Handmatige verificatie is labor- en tijdsintensief, als zij wordt beperkt door het aantal CCP's een gebruiker kan rekenen, maar het is misschien wel de meest accurate techniek beschikbaar. Een getrainde menselijk oog gemakkelijk blijft een CCP volgen door celbeweging en vormveranderingen of focus, nauwkeurig uitzondering plaques en defecte pixels. Het kan ook morfologische veranderingen in de CCP detecteren indicatieve voltooide evagen, zoals getoond is figuur 3B en 3C. Het is noodzakelijk, echter, dat de analyse blijft objectief mogelijk binnen deze beperkingen. Dit vereist de vaststelling van specifieke criteria die consequent worden toegepast in alle datasets. Daarnaast analyseren we meestal beelden in een dubbelblinde wijze, waarbij de beeldnamen worden vervormd zodat de voorwaarden onbekende degene analyse van de beelden blijven. Automatische detectie, bijvoorbeeld op het "Spots" en "Tijdsduur" algoritmen in Imaris kan worden gebruikt om de meeste van de endocytische spots detecteren in een bepaalde film, waardoor een hoge monsternummer. Hoewel veel opties, waaronder zeer complexe maat algoritmen 3,14,23,26,27, worden gegenereerd, de betrouwbaarheid van deze methoden te detecteren correct endosomale gebeurtenissen met vermijding valse detectie blijft de grootste zorg. Bijvoorbeeld, in Imaris, celbeweging een frisse voorranden, plakken en uitscherpstelkader gemakkelijk werpen de spot-algoritme, omdat het de neiging om heldere structuren detecteren als bestaande geheel of spots. Om te voorkomen dat deze Spots van wordt aangesloten op een spoor, worden ze allemaal verwijderd. Enkele afwijkende Spots die niet in grote structuren, zoals plaques kunnen worden verwijderd met de Edit Spots tabblad, terwijl Spots verbonden kunnen worden verwijderd later met behulp van de Edit Tracks tabblad. De afwijkende plekken kunnen ook verwijderd worden met aangepaste filters. Bijvoorbeeld, Figuur 3D toont een intensiteit filter wordt gebruikt om te voorkomen inclusief plaques in CCP detectielimiet. De kwaliteit filter is een zeer handig filter voor het verwijderen van foutieve plekken. "Kwaliteit" is een cumulatieve metingen van helderheid en vorm gevonden door de fluorescentie-intensiteit van de spot en Gaussian filtering door ¾ van de lengte van de contante radius 20. De kwaliteit curve wordt gevonden onder de geselecteerde filters. Het toont het aantal plekken (y) gedetecteerdWanneer de kwaliteit een bepaalde waarde (x). Hoe lager de kwaliteit, hoe meer vlekken waargenomen. Als de kwaliteit filter te laag is, wordt spots gedetecteerd wanneer er geen zichtbare fluorescentie omgekeerd, als de kwaliteit filter te hoog is, alleen de helderste spots worden opgespoord. Volg samen met de buiging naar hogere waarden (x); het aantal spots gedetecteerd (y) zullen kenmerkend dramatisch dalen. Verplaats de onderste drempel om dit punt. Dit is het minimale punt de onderdrempel plaatsen. Andere belangrijke bijdragen valse plekken in het veld TIRF zijn endosomen die naar de omtrek van de cel en het veld in TIRF. Een robuuste criterium voor het verwijderen van deze is de mobiliteit van vlekken, dat wil zeggen de verplaatsing van de spots in de tijd. CCP bewegen heel weinig behalve als deel van de beweging van de gehele cel, maar endosomen vertonen snelle Brownse of gerichte beweging. Nieuwer algoritmen, terwijl aanzienlijk verbeterd, worden nog steeds verfijnd en geoptimaliseerd 3,14,23,26,27. Aangezien deze voldaanhods worden steeds geavanceerder en betrouwbaar is, kunnen we analyseren honderden of duizenden plekken, zonder ze handmatig controleren op elk punt. Op dit moment echter, stellen wij voor dat deze twee analyses samen worden gebruikt om elkaar aan te vullen op juistheid.
De techniek die we hebben beschreven kan eenvoudig worden aangepast aan vele vragen betreffende de lading endocytose beantwoorden. Het kan worden gebruikt om eenvoudige co-lokalisatie van ladingen voeren met CME componenten en om wijzigingen specifieke componenten van de endocytische machine door bepaalde stimuli tonen. De test kan ook gemakkelijk worden aangepast voor elke endocytisch proces, zoals caveolae 28, dat discrete concentraties van lading en vacht componenten vertonen, en de studie van deze fundamentele processen in gespecialiseerde celtypen. In de toekomst, als genoom bewerken wordt meer mainstream 20,29,30, verwachten we dat het de beste methode voor het coderen van onderdelen zal worden, en dat de dynamiek en het gedrag of verschillende onderdelen zal verder worden verfijnd. Gezien het feit dat ons begrip van cellulaire processen is grotendeels gedreven door de identificatie van genen, eiwitten wijzigingen en interactomen, de test die we hier beschreven staat voor een van de volgende grenzen van het onderzoek, namelijk. de definitie van de spatiotemporele dynamiek van deze procedures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/High Glucose with L-glutamine and sodium pyruvate | Fisher Scientific | SH3024301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS), no calcium, no magnesium | Gibco, by Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, by Life Technologies | 10437-028 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco, by Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, by Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE by Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection reagent |
| 25 mm coverglass | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning cell culture treated flasks, 25 cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Cell culture 6-well plate | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG | |
| [D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris Image analysis software | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, for automated analysis | |
| Nikon Eclipse Ti inverted microscope and required accessories including filter cubes and filters | Nikon | ||
| Nikon TIRF arm with required adapters for Nikon Eclipse Ti | Nikon | For adjusting angle of incidence | |
| iXon+ EMCCD camera and adapters | Andor |
References
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clathrin- and Actin-Mediated Endocytosis Machinery. Cell. 123 (2), (2005).
- Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biology. 9 (3), (2011).
- Ungewickell, E., Branton, D.
- Bliek, A. M., Meyerowrtz, E. M. Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature. 351 (6325), (1991).
- Hinshaw, J. E., Schmid, S. L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature. 374 (6518), (1995).
- Merrifield, C. J., Perrais, D., Zenisek, D. Coupling between Clathrin-Coated-Pit Invagination, Cortactin Recruitment, and Membrane Scission Observed in Live Cells. Cell. 121 (4), 593-606 (2005).
- Grabs, D., Slepnev, V. I., et al. The SH3 domain of amphiphysin binds the proline-rich domain of dynamin at a single site that defines a new SH3 binding consensus sequence. The Journal of biological chemistry. 272 (20), 13419-13425 (1997).
- Tosoni, D., Puri, C., et al. TTP Specifically Regulates the Internalization of the Transferrin Receptor. Cell. 123 (5), 875-888 (2005).
- Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Cargo Regulates Clathrin-Coated Pit Dynamics. Cell. 127 (1), 113-124 (2006).
- Soohoo, A. L., Puthenveedu, M. A. Divergent modes for cargo-mediated control of clathrin-coated pit dynamics. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1725-1734 (2013).
- Posor, Y., Eichhorn-Gruenig, M., et al. Spatiotemporal control of endocytosis by phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate. Nature. 10, (2013).
- Mettlen, M., Stoeber, M., Loerke, D., Antonescu, C. N., Danuser, G., Schmid, S. L. Endocytic accessory proteins are functionally distinguished by their differential effects on the maturation of clathrin-coated pits. Molecular Biology of the Cell. 20 (14), 3251-3260 (2009).
- Loerke, D., Mettlen, M., et al. Cargo and dynamin regulate clathrin-coated pit maturation. PLoS Biology. 7 (3), (2009).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of Cell Biology. 89 (1), 141-145 (1981).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nature Cell Biology. 4 (9), 691-698 (2002).
- Ehrlich, M., Boll, W., et al. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits. Cell. 118 (5), 591-605 (2004).
- Yarar, D., Waterman-Storer, C. M., Schmid, S. L. A dynamic actin cytoskeleton functions at multiple stages of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 16 (2), 964-975 (2005).
- Rappoport, J. Z., Kemal, S., Benmerah, A., Simon, S. M. Dynamics of clathrin and adaptor proteins during endocytosis. American journal of physiology. Cell physiology. 291 (5), (2006).
- Doyon, J. B., Zeitler, B., et al. Rapid and efficient clathrin-mediated endocytosis revealed in genome-edited mammalian cells. Nature Cell Biology. 13 (3), 331-337 (2011).
- Hopp, T. P., Prickett, K. S., et al. A Short Polypeptide Marker Sequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification. Bio/Technology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Saffarian, S., Cocucci, E., Kirchhausen, T. Distinct Dynamics of Endocytic Clathrin-Coated Pits and Coated Plaques. PLoS Biology. 7 (9), (2009).
- Yudowski, G., Puthenveedu, M., Henry, A., von Zastrow, M. Cargo-Mediated Regulation of a Rapid Rab4-Dependent Recycling Pathway. Molecular Biology of the Cell. 1, 1-11 (2009).
- Batchelder, E. M., Yarar, D. Differential Requirements for Clathrin-dependent Endocytosis at Sites of Cell-Substrate Adhesion. Molecular Biology of the Cell. 21 (17), 3070-3079 (2010).
- Mattheyses, A. L., Atkinson, C. E., Simon, S. M. Imaging Single Endocytic Events Reveals Diversity in Clathrin, Dynamin and Vesicle Dynamics. Traffic. 12 (10), 1394-1406 (2011).
- Aguet, F., Antonescu, C. N., Mettlen, M., Schmid, S. L., Danuser, G. Advances in analysis of low signal-to-noise images link dynamin and AP2 to the functions of an endocytic checkpoint. Dev Cell. 26 (3), 279-291 (2013).
- Boucrot, E., Howes, M. T., Kirchhausen, T., Parton, R. G.
- Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual review of genetics. 45, 273-297 (2011).
- Boch, J., Scholze, H., et al. Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type. III Effectors. Science. 326 (5959), 1509-1512 (2009).
