Summary
Questo protocollo descrive l'uso di cantilever silicio microscala come superfici di coltura flessibili per misurare la contrattilità delle cellule muscolari in vitro. Contrazione cellulare provoca cantilever flessione, che può essere misurata, registrata e convertita in letture di forza, fornendo un sistema non invasivo e scalabile per misurare funzione contrattile in vitro.
Abstract
Lo sviluppo di test più predittivi e biologicamente rilevanti in vitro si basa sulla promozione dei sistemi di coltura di cellule versatili che facilitano la valutazione funzionale delle cellule teste di serie. A tal fine, la tecnologia cantilever microscala offre una piattaforma con cui misurare la funzionalità contrattile di una gamma di tipi cellulari, incluse scheletrico, cardiaco e cellule muscolari lisce, attraverso la valutazione della contrazione indotta substrato piegatura. Applicazione di matrici a sbalzo multiplex fornisce i mezzi per sviluppare moderata a protocolli di high-throughput per valutare l'efficacia dei farmaci e la tossicità, fenotipo della malattia e la progressione, così come le interazioni neuromuscolari e altri cellula-cellula. Questo manoscritto fornisce i dettagli per la fabbricazione di matrici a sbalzo affidabili per questo scopo, ed i metodi necessari al successo le cellule di coltura su queste superfici. Ulteriore descrizione è fornita sui passi necessari per eseguire anale funzionaleYsis di tipi di cellule contrattili mantenuta su tali array utilizzando un nuovo sistema laser e foto-rilevatore. I dati rappresentativi forniti evidenzia la precisione e la natura riproducibile dell'analisi della funzione contrattile possibile utilizzare questo sistema, così come la vasta gamma di studi cui tale tecnologia può essere applicata. Adozione diffusa di successo di questo sistema potrebbe fornire gli investigatori i mezzi per eseguire rapidi, studi funzionali a basso costo in vitro, portando a previsioni più accurate delle prestazioni dei tessuti, lo sviluppo della malattia e la risposta al trattamento terapeutico.
Protocol
1 Cantilever Chip Fabrication
Dettagli illustrati delle fasi di fabbricazione descritti sono forniti in Figura 1.
- Posizionare wafer di silicio su isolante (SOI) in un forno e cuocere a 125 ° C per 20 min a disidratarsi loro.
- Depositare uno spesso strato di ossido di silicio 1,5 micron sullo strato maniglia del wafer SOI disidratato usando un potenziato a plasma Chemical Vapor Deposition (PECVD) dell'utensile.
- Posizionare la cialda sul mandrino di spin coater con lo strato dispositivo rivolto verso l'alto. Assicurarsi wafer è centrata, dispensare 2 ml di P20 Primer sul centro della fetta, e centrifuga a 3000 rpm per 60 sec a un'accelerazione di 1.000 giri / sec. P20 Primer promuove l'adesione del fotoresist allo strato dispositivo.
- Mentre il wafer è ancora sul mandrino di spin coater, dispensare 2 ml di S1818 fotoresist sul centro della fetta, e centrifuga a 3000 rpm per 60 sec a un'accelerazione di 1.000 giri / sec obtain uno spesso strato di resina fotosensibile 1,5 micron.
- Inserire la cialda su una piastra calda ed effettuare una cottura morbida a 115 ° C per 1 min.
- Eseguire un'esposizione contatto UV disco utilizzando un contatto fotolitografia maschera allineatore per trasferire il disegno dalla maschera sbalzo per il fotoresist sullo strato del dispositivo. Calcolare il tempo di esposizione in base al valore energetico di esposizione di 125 mJ / cm 2 per S1818 photoresist.
- Sviluppare il photoresist immergendo la fetta in una MIF autore fotoresist 726 per 1 min, agitando delicatamente il wafer avanti e indietro.
- Sciacquare il wafer con (DI) di acqua deionizzata e asciugare, preferibilmente utilizzando uno spin risciacquo biancheria (SRD) strumento.
- Rimuovere il fotoresist dal bordo del wafer (fino a 5 mm dal bordo) usando un batuffolo di cotone imbevuto di acetone.
- Caricare il wafer in un Reactive Ion Etch (DRIE) strumento profonda, con il lato fotosensibile rivolto verso l'alto, ed eseguire una ricetta per incidere lo strato di silicio modellato attraverso la devistrato di ce. Le funzioni di strato di ossido sepolto come un arresto etch, quindi eseguire un attacco con il 50% al 100% più cicli che si prevede sarà necessario per garantire una completa etch.
- Posizionare la cialda in una soluzione bagno photoresist caldo per 20 minuti a nudo il photoresist. Trasferire la cialda di un rapido-dump-sciacquatrice (QDR) per sciacquare la cialda con acqua deionizzata. Dopo la striscia di photoresist, caricare la cialda in uno strumento di dominio di risorse condivise per sciacquare e asciugare il wafer. Controllare il wafer al microscopio per assicurare lo schema cantilever visualizza come previsto.
- Depositare uno strato di ossido di silicio drogato un-1 micron sullo strato periferica del wafer con un attrezzo PECVD. Funzioni di questo strato di ossido, come uno strato protettivo per i cantilever durante ulteriori fasi di lavorazione.
- Posizionare il wafer sul mandrino rotazione coater con lo strato rivolto verso l'alto la maniglia per iniziare l'elaborazione del lato posteriore del wafer. Garantire wafer è centrata, dispensare 2 ml di P20 Primer sul centro della fetta, e centrifuga a 3000 rpmper 60 sec a un'accelerazione di 1.000 giri / sec.
- Mentre il wafer è ancora sul mandrino di spin coater, dispensare 2 ml di SPR220-4.5 fotoresist sul centro della fetta, e centrifugare a 2000 rpm per 45 sec a un'accelerazione di 1.000 giri / sec per ottenere uno spesso strato di 6,5 micron photoresist.
- Inserire la cialda su una piastra calda vicinanza effettuare una cottura morbida a 115 ° C per 2 min.
- Utilizzando un contatto fotolitografia allineatore grado di anteriore / posteriore allineamento, allineare la maschera finestra posteriore al modello cantilever lato anteriore ed eseguire un hard esposizione ai raggi UV contatto per trasferire il disegno dalla maschera finestra posteriore per il fotoresist sullo strato maniglia. Utilizzare un tempo di esposizione calcolato in base al valore energetico di esposizione di 480 mJ / cm 2 per SPR220-4.5 photoresist.
- Dopo l'esposizione ai raggi UV, lasciare che i wafer rimangono in una zona scura per 30 minuti prima della prossima fase di lavorazione.
- Sviluppare il photoresist immergendo il wafer inuno sviluppatore 726 MIF photoresist per 2 minuti mentre delicatamente scuotendo il wafer avanti e indietro.
- Sciacquare il wafer con (DI) di acqua deionizzata e asciugare, preferibilmente utilizzando uno spin risciacquo biancheria (SRD) strumento.
- Posizionare i wafer in un forno a 90 ° C per 12 ore.
- Etch lo strato di ossido di silicio sul retro del wafer utilizzando un sistema RIE con gas fluorurati e una ricetta per incisione ossido. L'ossido modellata sul retro della fetta agisce come una maschera di attacco per l'ulteriore elaborazione. Controllare i wafer al microscopio per assicurare che l'ossido di silicio nella finestra esposta è completamente inciso.
- Rimuovere il photoresist sul bordo del wafer (fino a 5 mm dal bordo) usando una camera tampone pulito imbevuto in acetone.
- Caricare il wafer in un utensile con DRIE ed eseguire una ricetta per incidere lo strato maniglia modellata ad una profondità di 500 micron con il funzionamento strato di ossido sepolto come arresto etch. Dividere questo etch in più piste per impedire un eccessivo riscaldamento delwafer, che provoca incisione incoerente del silicio. Questo passaggio etch rimuove completamente il silicio sotto i cantilever.
- Eseguire una fase di attacco umido utilizzando il 25% diluito HF mordenzante, per togliere lo strato di ossido sepolto sotto i cantilever e lo strato di ossido protettivo sulla parte superiore del cantilever.
NOTA: Questo passaggio rilascia la superficie inferiore dei cantilever in silicio e apre una finestra sotto per fornire un accesso per sondare la mensola con il laser. - Sciacquare la cialda con una serie di bagni di acqua deionizzata e asciugare accuratamente con azoto. Dal momento che i cantilever sono supportate solo alle loro basi, non utilizzare spray forti d'acqua DI o gas inerte direttamente sui cantilever.
- Cleave i singoli chip dal wafer lungo le linee Cleave prodotti durante la fase maniglia strato etch.
Cultura 2. cellulare
- Preparare 13F coprioggetto secondo i metodi precedentemente pubblicati 17.
NOTA: Se 13F coverslips non sono disponibili, qualsiasi superficie idrofobica con un angolo di contatto sopra 95 ° può essere utilizzato. - Sterilizzare chip a sbalzo e 13F coprioggetto in una soluzione di etanolo al 70% e lasciare asciugare in una cappa a flusso.
- Posizionare singoli chip a sbalzo sulla parte superiore del 13F vetrini all'interno di una piastra standard 12 bene.
- Rivestire le cantilever con la modifica biopolimero o superficie ottimizzata per il tipo di cellule utilizzate secondo i protocolli standard di coltura cellulare.
- Risospendere le cellule nel loro terreno di crescita specifico alla concentrazione desiderata.
NOTA: Questo protocollo si tradurrà in un notevole numero di cellule che cadono attraverso la finestra a sbalzo e non aderenti alla superficie cantilever desiderato. Preparazioni di cellule devono pertanto essere 3-4 volte più concentrato di quello per le preparazioni coprioggetto standard. Ad esempio, la semina di cellule satelliti muscolari scheletrico di ratto è tipicamente effettuata con una densità di semina di 500 e 700 cellule / quadrato mm 15,16, E sono usati con supporti a sbalzo a 2.000 cellule / mm quadrato. Esperimenti di ottimizzazione devono essere effettuate con le nuove fonti di cellule per accertare una adeguata densità di semina. - Pipettare 200 microlitri della sospensione cellulare sulla superficie del chip cantilever, assicurando la bolla di media copre le finestre a sbalzo interamente. Se il mezzo assorbe attraverso la finestra e non forma una bolla statica sulla parte superiore del cantilever sostituire il coprioggetto 13F e ritentare il fasciame.
- Trasferire il piatto contenente i chip di un incubatore e permettono alle cellule di aderire per almeno 1 ora (preferibilmente 2-3 ore).
- Dopo questo periodo di placcatura, utilizzare pinze sterili per trasferire il chip di un ben pulito, senza coprioggetto 13F, e rabboccare la cultura con 1 ml di terreno di coltura.
- Riportare la piastra per l'incubatore.
- Mantenere le cellule in base alla loro protocollo standard per la manutenzione in vitro su vetrini. Per le cellule del muscolo scheletrico,un interruttore di media composizione per indurre la formazione di miotubi una volta le cellule diventano confluenti sarà necessario.
3 Configurazione di hardware e software per l'analisi sbalzo Flessione
- Posizionare un piatto di coltura riscaldato nella fase di un microscopio elettrofisiologia in posizione verticale.
- Aggiungere 3 ml del mezzo di alimentazione delle celle sono attualmente sospesi in (HEPES mM + 10) alla fase microscopio riscaldata.
- Montare elettrodi inox sulla parte interna del piatto cultura riscaldata ad una distanza di 15 mm e collegarli ad un generatore di impulsi, in grado di produrre impulsi di stimolazione campo di varia intensità, frequenza e forma d'onda, per permettere al sistema di produrre stimolazione del campo delle cellule quando appropriato.
- Fissare un laser a elio-neon, montato su fasi di traslazione XY, alla parte inferiore del tavolo microscopio e regolare in modo che il fascio laser è diretto attraverso la base del piatto cultura riscaldata a 30 ° relativposta al piano del cantilever.
- Fissare un modulo foto-rilevatore quadrante, montato su fasi di traslazione XY, alla parte inferiore del palco microscopio e regolare la posizione in modo che i riflessi terre raggio laser al centro dei quattro quadranti. Figura 2 fornisce una panoramica dell'hardware istituito necessarie per l'attuazione del protocollo descritto.
- Scrivere un programma software per controllare gli attuatori lineari che scandiscono attraverso i cantilever. Scrivere il programma software con riferimento al diagramma di flusso illustrato nella Figura 3. L'interfaccia grafica programmato per l'uso con questo sistema è fornito in Figura 4.
4 Registrazione Cantilever deflessione dei dati
- Accendere l'hardware di analisi cantilever e software associato.
- Inserire il palco termistore riscaldato nel mezzo e attendere che la lettura a 37 ° C.
- Inserire il chip a sbalzo in fase con il cantilevers orientati verso il lato destro del palco.
- Accendere la sorgente di luce del microscopio.
- Mettere a fuoco il microscopio per portare i bordi dei cantilever in vista e utilizzare il software di controllo laser / foto-rilevatore per posizionare il raggio laser sulla punta del cantilever 1 NOTA: Supponendo che i cantilever sono orientati alla destra del palco, cantilever 1 è quello posizionato in alto a sinistra della matrice e numeri scendono a 16 in basso a sinistra. Mensola 17 è nella posizione in alto a destra e corre a 32 in basso a destra (Figura 5A).
- Premere il tasto "play" sul software di registrazione.
- Posizionare la foto-rivelatore in modo che il segnale indica "0" in entrambi x ed y fotogrammi regolando i motori passo-passo che controllano la foto-rivelatore.
- Impostare cantilever 1 posizione nel software di controllo laser / foto-rilevatore (Figura 4).
- Spostare il laser alla punta del cantilever 16, ripetere il punto 4.7., E impostare cantilever 16 posizione nel software di controllo laser / foto-rivelatore.
- Spostare il laser alla punta del cantilever 32, ripetere il punto 4.7., E impostare sbalzo 32 posizione nel software di controllo laser / foto-rivelatore.
- Spostare il laser alla punta del cantilever 17, ripetere il punto 4.7., E impostare sbalzo 17 posizione nel software di controllo laser / foto-rivelatore.
- Spegnere la fonte di luce microscopio e la plafoniera in laboratorio.
- Premere il tasto "record" sul software di registrazione.
- Impostare l'hardware generatore di impulsi di 40 msec, 5 V impulsi ad una frequenza di 1 Hz, e accendere la macchina.
NOTA: In alternativa, impiegare protocolli di stimolazione ottimizzate per fonti di cellule specifiche, a questo punto, le impostazioni indicate sono linee guida basate su dati raccolti utilizzando fonti umane e cellule di roditore 12,13,15,16. - Utilizzando il software di controllo laser / foto-rivelatore, impostare l'hardware per eseguire la scansione attraverso la matrice 32 cantilever, fermandosi per 5 secondi ad ogni sue.
- Quando la scansione dei 32 cantilever è completata, spegnere lo stimolatore, quindi arrestare il software di registrazione e aprire il file di dati.
- Esaminare la traccia registrata da ogni sbalzo per prove di attività contrattile. Prendere nota di ciascuna mensola con le risposte positive. Una contrazione è definito come un picco se la deviazione è di almeno 0,1 V sopra la linea di base.
- Rimuovere qualsiasi cantilever che non rispondono dal protocollo di scansione sul software di controllo laser / foto-rivelatore.
- I cantilever attivi possono quindi essere riesaminati senza stimolazione al fine di ottenere una lettura di spontanea attività contrattile della cellula.
- Eseguire scansioni con o senza stimolazione elettrica vasto campo, dopo aggiunta di un composto terapeutico al mezzo per osservare il suo effetto sull'uscita funzionale delle cellule in coltura.
- Effettuare valutazioni fatica stimolando elettricamente le cellule per lunghi periodi e livelli di scansione di contr actility per misurare quanto tempo ci vuole per forza di picco a scendere al di sotto di una determinata soglia.
- Negli esperimenti in cui i neuroni motori sono mantenuti in co-coltura con il muscolo, misurare la formazione di giunzione neuromuscolare attraverso il trattamento dei motoneuroni-myotube sbalzo co-culture con uno stimolante neuronale (come il glutammato) o inibitore sinaptica (ad esempio, D-tubocurarina) e scansione per aumenti e diminuzioni di attività spontanea, rispettivamente 16.
- Eseguire scansioni specifiche dettate dalle esigenze degli esperimenti pianificati.
5 Analisi di sbalzo deflessione dati
- Usa modificato equazioni di Stoney 15 (di seguito dettagliate) per convertire i dati cantilever grezzi deflessione (in Volt) in una lettura di stress nello strato di cellule o miotubi (in Pascal), e una misura diretta della forza contrattile cellulare (in nano-newton):
annuncio / 51866 / 51866eq1.jpg "/> Equazione 1
Equazione 2 - Dove δ = sbalzo punta flessione e lo stress prodotti dalla myotube, σ c = lo stress prodotto dal myotube, assumendo un film di spessore uniforme l'intera larghezza del cantilever, C rivelatore = coefficiente specifica del sistema relativa tensione di posizione laser sulla foto -detector, θ = l'angolo del laser e rivelatore rispetto al piano del cantilever, E Si = modulo elastico di silicio, t Si = spessori del cantilever, t f = spessore miotubi, v Si = coefficiente di veleno silicio, L = lunghezza a sbalzo, lunghezza P = percorso del laser dalla punta a sbalzo a rivelatore, e w
- Assumendo il miotubi è un film uniforme, la forza nella miotubi è uguale alla forza del film, portando a equazione 3, uguagliando il calcolo della forza da stress e l'area della sezione trasversale cella assunto che è stato utilizzato per l'applicazione di Stoney di equazione.
Equazione 3 - Dopo la raccolta dei dati funzionali, fissare i chip a sbalzo per l'analisi immunocitochimica o utilizzare le celle per proteine o DNA analisi utilizzando tecniche standard.
- Facoltativamente, tornare le cellule al incubatore invece di preparare per l'analisi molecolare, al fine di rivalutare le prestazioni funzionali in un momento-momento successivo.
Equazione 2 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cultura di successo di cellule contrattili su cantilever è una procedura relativamente semplice, utilizzando tecniche standard di coltura cellulare (Figura 5). La percentuale di cellule di supporto cantilever amministrazioni varierà a seconda del tipo di cellula in esame e specifica cultura tecnica impiegata. Utilizzo di cellule embrionali primarie derivate da ratto arti posteriori, l'attività contrattile è stata rilevata il 12% di cantilever esaminati (n = 4). Analisi della funzione contrattile utilizzando il sistema laser e la foto-rilevatore descritto fornisce dati accurati in tempo reale relativi alla maturazione funzionale delle cellule teste di serie. Utilizzo di software elettrofisiologica standard può quindi essere utilizzato per analizzare i dati grezzi, facilitando calcolo rilevanti proprietà funzionali, come forza di picco, tempo al picco forza, e il tempo di rilassamento metà, come illustrato nella Figura 7. Raccolta di dati successivo da colture trattate con composti terapeutici permette diconfronto delle proprietà funzionali con e senza aggiunta di droga, consentendo così la valutazione dell'attività composto e conseguente previsione di risposte in vivo. Inoltre, protocolli di stimolazione estesi forniscono i mezzi per valutare i tassi di fatica in cellule in coltura, ampliando così il livello dei dati fisiologici ottenibili da questo sistema (Figura 8).
La cultura a sbalzo può essere modificato per includere motoneuroni del sistema di coltura con miotubi muscolari scheletriche 16, in modo da consentire la valutazione della formazione di sinapsi neuromuscolare in vitro (Figura 9). In tali colture, i tassi di attività contrattile spontanea sono confrontati con i tassi di contrazione in risposta al trattamento con uno stimolante neurone-specifica, come glutammato. Eventuali glutammato indotto aumenti osservati nei tassi di contrazione suggeriscono l'attivazione dei neuroni in coltura, portando a rilascio di acetilcolina e successiva myoattivazione del tubo. Il trattamento con gli inibitori sinaptiche, come ad esempio l'acetilcolina bloccante del recettore D-tubocurarina, che portano alla cessazione dell'attività glutammato indotta fornire ulteriori elementi di prova per la presenza di sinapsi neuromuscolari funzionali in queste culture 16.
Figura 1 Schema di flusso del processo di fabbricazione dettaglio sbalzo. I numeri elencati nel diagramma di flusso correlato alle fasi di protocollo nella sezione Metodi intitolata "circuito integrato a sbalzo fabbricazione." Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Hardwaredettagli del sistema laser / foto-rivelatore utilizzato per valutare la contrazione cellulare su cantilever. (A) Fotografia del microscopio elettrofisiologico modificato utilizzato per la valutazione cantilever. Il laser (i) e foto-rivelatore (ii) sono montati sotto il palco sui palchi di traslazione XY. Un piatto di coltura trasparente è montato sulla fase (iii), che permette il passaggio del laser alla matrice cantilever attraverso la parte inferiore dello stadio. (B) Schema "top-down" prospettiva del palco microscopio. Fasi traslazionali XY consentono il movimento del laser e la foto-rilevatore in entrambi i piani Y (frecce rosse) e X, facilitando il movimento del laser di interrogare ogni cantilever in un array. Chip a sbalzo (iii) dovrebbero essere messi in scena con i cantilever rivolti verso la destra del palco in modo che il sistema funzioni correttamente. (C) Primo piano fotografia del laser (i) efoto-rilevatore (ii) montato sotto il palco microscopio. Il laser è posizionato ad un angolo di 30 ° rispetto al piano del chip sbalzo (θ). (D) Primo piano fotografia del piatto cultura. Stimolazione elettrica viene applicata mediante una coppia di elettrodi d'argento a largo campo posizionato 15 mm (iv). Un elemento riscaldante (v) fissato al lato inferiore del piatto viene utilizzato per mantenere la coltura a 37 ° C durante l'analisi. Il controllo della temperatura è dinamico, e regolata per mezzo di un termistore posto nel mezzo (non mostrato). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3 Diagramma di flusso della logica sottostante software di controllo. scansione del software laser e foto-rilevatore di due loop di controllo di movimento: un ciclo principale per l'input dell'utente e un ciclo che controlla il movimento di scansione. Installazione viene eseguita mentre nel ciclo principale, seguita dalla attivazione del secondo ciclo di medio e raccolta di dati high-throughput. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4 Interfaccia utente grafica del software utilizzato per controllare le posizioni laser e foto-rivelatore durante la valutazione sbalzo. (A) per controllare manualmente laser e foto-rivelatore posizioni in entrambi i piani X e Y. (B) I comandi per impostare manualmente le posizioni dei 4 cantilever angolari (1, 16, 17, e 32), consentendo in tal modo al software diestrapolare le posizioni dei rimanenti cantilever nella matrice. (C) Controlli che permette agli utenti di selezionare quali sbalzo da includere in ogni scansione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5 Immagini di un personalizzato costruito chip di cantilever per l'uso in questo sistema, e immagini rappresentative di cellule mantenute su superfici simili. (A) Fotografia di un unico, personalizzato costruito chip di sbalzo. Ogni chip contiene 32 cantilever disposti in 2 file di 16 a sbalzo 1 è posizionato in basso a sinistra dell'immagine e cantilever 32 in alto a destra. Chip a sbalzo sono (B) immagine di fase-contrasto delle cellule del muscolo scheletrico di ratto primario 15 x 15 mm 2. Coltivate su cantilevers. Ogni mensola è di 750 micron di lunghezza, 100 micron di larghezza e 4 micron di spessore. (C) macchia immunocitochimica di un myotube ratto primario mantenuto su un cantilever. Le cellule sono state colorate utilizzando una sonda anticorpo per la catena pesante della miosina. Si noti l'aspetto striato della fibra colta, che indica la maturazione della macchina contrattile. Bordi a sbalzo sono stati artificialmente evidenziati in questa immagine per fornire un'indicazione di scala. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6 Schema che illustra i termini utilizzati nelle equazioni di Stoney per forza prodotta da miotubi su cantilever derivante. Δ = cantilever punta flessione e lo stress prodotto dal myotube, Crivelatore = coefficiente specifica del sistema relativa tensione di posizione del laser sulla foto-rivelatore, θ = l'angolo del laser e rivelatore rispetto al piano del cantilever, E Si = modulo elastico di silicio, t Si = gli spessori il cantilever, t f = spessore myotube, v Si = rapporto di veleno di silicio, lunghezza L = sbalzo, e la lunghezza P = percorso del laser dalla punta a sbalzo al rivelatore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7 Rappresentante dati grezzi e analisi della forma contrattile utilizzando il sistema cantilever descritto. (A) Esempio di una traccia dati grezzi dal vasto campo stimolazione elettrica dei miotubi primari di ratto su cantilever. Top trace = deflessione laser (in Volt) in asse x, indicando il lungo sforzo sul cantilever. Medio trace = deflessione laser (in Volt) in asse y, che indica tensione torsionale attraverso il cantilever. Basso traccia = Indicazione della posizione temporale di impulsi elettrici utilizzati per suscitare myotube contrazione in questo sistema. (B) Utilizzando il software elettrofisiologia standard, è possibile misurare la forza di picco (PF), il tempo di picco forza (TTP) e il tempo di mezzo rilassamento (1/2 RT) dai dati grezzi raccolti. (C) Fascicola dati contrazione (n = 11) di ratto primaria miotubi muscolo scheletrico. Applicazione dell'equazione di un Stoney modificata permette di calcolare lo stress a sbalzo dalle letture di dati grezzi in Volt. Da questi dati, calcolo diretto della forza (in Newton) può anche essere generato. I dati pubblicati ristampato wesimo autorizzazione 13. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8 dati rappresentativi che dimostrano l'analisi di fatica muscolare scheletrico nelle culture cantilever. I dati grezzi (in Volt) è stato convertito in una misura di forza miotubi (in nano-newton) e ri-tracciati. Dati illustra ampiezza delle contrazioni myotube su cantilever in risposta a 1 Hz ampio campo elettrico impulsi dopo 0 min (traccia nera) e 120 min (grigio traccia) di stimolazione continua. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 9 tracce rappresentativi dall'analisi di un co-cultura-motoneuroni del muscolo scheletrico mantenuto su cantilever, dimostrando gli effetti funzionali di stimolazione motoneurone con e senza l'aggiunta di un bloccante neuromuscolare. Dati grezzi (in Volt) è stato convertito in una misura di miotubi forza (in nano-newton) e ri-tracciati. (A) Misura di contrazioni spontanee da parte dei miotubi in coltura senza stimolazione neuronale. (B) Misura della myotube contrazione a seguito di stimolazione neuronale mediante l'aggiunta di 200 mM glutammato. (C) Misura della myotube contrazione seguente glutammato e 12,5 mM trattamento D-tubocurarina. I dati pubblicati ristampato con il permesso 16. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Le seguenti tabelle elencano i reagenti specifici usati per le cellule di coltura negli esperimenti di validazione descritti, così come le attrezzature necessarie per effettuare la valutazione cantilever. Si prega di notare che i reagenti di coltura utilizzate non sono necessari e questo sistema dovrebbe essere facilmente integrato con i protocolli di coltura di qualsiasi laboratorio di mantenere le cellule contrattili in vitro. I reagenti elencati sono forniti investigatori dovrebbero desiderare di ripetere i risultati sperimentali specifici descritti.
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Discussion
Le fasi critiche analizzando cantilever microscala per prove di contrazione cellulare sono il posizionamento del chip a sbalzo all'interno della fase di microscopio, e il successivo allineamento del laser e foto-rivelatore con la punta del cantilever angolari nella matrice. Se questo non viene fatto accuratamente, quindi il software sarà in grado di estrapolare le posizioni dei rimanenti cantilever nella matrice, potenzialmente conseguente accumulo di falsi negativi durante la raccolta dei dati. Gli operatori devono aver cura di assicurare che il chip cantilever è sdraiato a filo con il fondo del piatto cultura prima di calibrare le posizioni laser. Se il chip si siede in un angolo del piatto, si altera il percorso del raggio laser deviato e confondere la raccolta dei dati.
Un aereo-tabella funzionale deve essere impiegato per annullare le vibrazioni di fondo durante la raccolta dei dati. Il piccolo spessore (circa 4 micron) dei cantilever utilizzato in questo studio provides alta sensibilità per l'attività contrattile, ma ha l'effetto collaterale di una maggiore sensibilità alle vibrazioni. Gli operatori devono fare attenzione a muoversi l'hardware il meno possibile durante la registrazione dei dati, per ridurre le letture di fondo. Infine, quando si posiziona il chip a sbalzo in fase, fare attenzione a garantire il chip non venire a contatto con gli elettrodi d'argento stimolanti nella cultura bene. Applicazione della stimolazione ampio campo con l'elettrodo di toccare il chip altererà il percorso corrente e avere un impatto negativo sulla capacità del sistema di stimolare efficacemente le cellule in coltura.
Al fine di ottenere letture più accurate di potenza forza in miotubi muscolari scheletriche, si consiglia vivamente di eseguire immunoistochimica delle cellule in coltura analisi una volta funzionale è completa. Le equazioni elencate richiedono l'input della sezione trasversale di un miotubi (CSA) per calcolare la forza. Mentre un valore assunto può essere utilizzato sulla base di pdati revious, misurazione della CSA esatto di un myotube utilizzando tecniche di imaging confocale fornirà una stima più accurata della forza esercitata dalle amministrazioni myotube. Relativamente dati contrazione grezzi alle caratteristiche fisiche della cellula in questione è prezioso nei risultati normalizzare tra più cantilever e tra le condizioni sperimentali 15, e quindi fondamentale per generare previsioni accurate delle risposte tissutali interi a trattamento farmacologico o di malattia. Le equazioni di Stoney assumono i miotubi esaminati coprono l'intera lunghezza del cantilever in modo sforzo dovrebbe essere fatto per includere solo i dati ottenuti da cellule conformi a questa ipotesi. Se ciò non è possibile, l'analisi degli elementi finiti può essere utilizzato per fornire una misurazione accurata della forza da miotubi piccoli come pubblicato in precedenza 15. Questo metodo di analisi è molto più alta intensità di lavoro, e quindi poco adatti ad applicazioni di throughput più elevati, ma può essere necessario se ottimizzatocolture cellulari conformi alle ipotesi di Stoney non possono essere ottenuti.
Come già detto, i parametri di coltura possono essere trasferiti da preparazioni coprioggetto standard. Tuttavia, si consiglia di prendere in considerazione utilizzando composizioni di media senza siero e substrati non biologici per l'uso di questo sistema nelle applicazioni di screening di stupefacenti. A causa della natura indefinita di sieri animali, l'effetto delle nuove terapie può essere confusa con l'inclusione di tali additivi nel terreno di coltura. Formulazioni dei media senza siero sono disponibili sia per roditori e culture muscoli scheletrici umani 18-21 e fornire un ambiente ben definito più controllato per l'esecuzione di valutazione composto. Analogamente, l'uso di rivestimenti biologici (collagene, laminina, ecc) su cantilever introduce variabilità delle preparazioni di cellule che vengono evitati applicazione di substrati non biologici. La deposizione di silano monostrati auto-assemblati su superfici di coltura hanno dimostrato extensamente per sostenere l'adesione e lo sviluppo di molteplici tipi di cellule 16,18,20,22-31, e rappresentano i mezzi per generare superfici completamente definiti in modo affidabile e ripetibile.
A causa della varietà di cellule presenti nei mammiferi contrattili, l'applicazione di questo modello per saggi in vitro è relativamente ampia. Sebbene ottimizzato utilizzando cellule del muscolo scheletrico, il sistema è potenzialmente applicabile a cellule muscolari lisce e cardiomiociti pure, fornendo i mezzi per eseguire la rapida valutazione delle risposte del dosaggio per terapeutici antitumorali in queste cellule in tempo reale. Chip a sbalzo correnti sono costituite da una serie di 32 cantilever (Figura 5A), ma potrebbe essere facilmente modificati per includere molti di più. L'analisi di tali array produce un consistente numero di punti dati da una singola cultura, in tal modo aumentando notevolmente la potenza statistica delle eventuali differenze osservate. Come evidenziato in Figura 8, le cellule coltivatein questo sistema subire fatica nel tempo, in risposta alla stimolazione ampio campo continuo, permettendo la valutazione degli effetti dei farmaci sui livelli di resistenza di cellule in vitro. Aggiunta di motoneuroni innervano a questo modello di cultura permette anche la valutazione della formazione di sinapsi attraverso la misurazione del muscolo contrazione in risposta a stimoli neuronali (Figura 9). Mentre la misurazione dei parametri funzionali di base in un saggio multiplex (Figura 7) ha evidenti vantaggi rispetto la valutazione biomolecolare tenore di culture in vitro, la capacità di valutare la funzionalità neuromuscolare e la capacità di resistenza delle cellule seminate aumenta notevolmente l'applicabilità di questo modello per lo screening di stupefacenti e le applicazioni di modellazione malattia. La tecnica descritta offre investigatori i mezzi per eseguire una rapida, a basso costo valutazione funzionale di entrambe le cellule muscolari sani e malati in vitro. La versatilità del sistema di coltura, e la high livello di dettaglio funzionali ottenibili dall'analisi dei dati grezzi, dovrebbe produrre previsioni più accurate delle risposte tissutali in vivo alle sfide patologiche e chimiche romanzo.
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Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dal National Institute of numeri di sovvenzione Salute R01NS050452 e R01EB009429. Fabbricazione dei chip a sbalzo è stata eseguita esternamente da collaboratori presso l'impianto di nanofabbricazione situato presso la Cornell University. Tutte le apparecchiature utilizzate nel processo di fabbricazione a sbalzo era situato in questa struttura. Un ringraziamento speciale a Mandy Esch e Jean-Matthieu Prot per la loro assistenza con cantilever micro-fabbricazione. Animazione Video di funzionalità cantilever è stato generato da Charles Hughes, Alex Zelenin ed Eric Imperiale dal Laboratorio di Realtà sintetica a UCF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
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