Summary
Denne protokollen beskriver bruken av mikrosilisiumbommene som bøyelige kulturoverflater for å måle sammentreknings muskelceller in vitro. Cellular sammentrekning forårsaker cantilever bøying, noe som kan måles, registreres og omdannes til avlesninger av kraft, noe som gir et ikke-invasivt og skalerbar system for måling av kontraktile funksjon in vitro.
Abstract
Utvikling av mer forutsigbar og biologisk relevante in vitro-analyser forutsetter utvikling av allsidige cellekultursystemer som forenkler funksjonell vurdering av de seeded celler. For dette formål, og tilbyr mikro cantilever teknologi en plattform som brukes til å måle kontraktile funksjonaliteten til en rekke celletyper, inkludert skjelettlidelser, hjerte, og glatte muskelceller, gjennom vurdering av sammentrekning indusert substrat bøying. Anvendelse av multipleksede cantilever matriser gir et middel til å utvikle moderat til høy-throughput-protokoller for å vurdere medikament-effektivitet og toksisitet, sykdoms fenotype og progresjon, samt nevromuskulære og andre celle-celle interaksjoner. Dette manuskriptet gir detaljene for fabrikasjon pålitelige cantilever arrays for dette formålet, og metodene som kreves for å lykkes kultur celler på disse flatene. Nærmere beskrivelse er gitt på de nødvendige skritt for å utføre funksjonelle analysis av kontraktile celletyper opprettholdes på slike matriser ved hjelp av en ny laser og fotodetektorsystemet. De representative data levert høydepunkter presisjonen og reproduserbar naturen av analyse av kontraktile funksjon er mulig ved hjelp av dette systemet, så vel som en lang rekke studier der slik teknologi kan anvendes. Vellykket utbredt bruk av dette systemet kunne gi etterforskere med midler til å utføre raske, lavpris funksjonelle studier in vitro, som fører til mer nøyaktige spådommer om vev ytelse, sykdomsutvikling og respons på romanen terapeutisk behandling.
Protocol
1. Cantilever Chip Fabrication
Illustrert detaljene i de beskrevne fremstillingstrinn er gitt i figur 1.
- Plasser Silicon-On-Insulator (SOI) skiver i en ovn og stek ved 125 ° C i 20 min for å tørke dem.
- Et innskudd på 1,5 mikrometer tykt lag av silisium oksid på håndtaket lag av det dehydrerte SOI skiven ved hjelp av en plasma-Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD) verktøyet.
- Plasser wafer på spin coater chuck med enheten lag vendt opp. Sikre wafer er sentrert, fordeles 2 ml P20 primer på midten av skiven, og sentrifugering ved 3000 rpm i 60 sekunder ved en akselerasjon på 1000 rpm / sek. P20 primer fremmer adhesjonen av fotoresist til enheten sjikt.
- Mens skiven er fortsatt på spin belegningsinnretning chuck, dispensere 2 ml S1818 fotoresist på midten av skiven, og sentrifugering ved 3000 rpm i 60 sekunder ved en akselerasjon på 1000 rpm / sek til obtain et 1,5 mikrometer tykt lag av fotoresist.
- Plasser skiven på en varm plate og utføre en myk stek ved 115 ° C i 1 min.
- Utfør en hard kontakt UV eksponering ved hjelp av en fotolitografi kontakt maske aligner for å overføre mønsteret fra cantilever masken til fotoresist på enheten laget. Beregn eksponeringstiden basert på eksponering energiverdi på 125 MJ / cm 2 for S1818 fotoresist.
- Develop fotoresisten ved å dyppe den i en skive 726 MIF fotoresist fremkaller en min mens forsiktig risting skiven frem og tilbake.
- Skyll wafer med de-ionisert (DI) vann og tørk den, helst ved hjelp av en spin skylling tørketrommel (SRD) verktøyet.
- Fjern fotoresisten fra kanten av skiven (opp til 5 mm fra kanten) ved hjelp av en bomullsdott dyppet i aceton.
- Laste wafer i en Deep Reaktiv Ion Etch (DRIE) verktøyet, med fotoresist siden opp, og kjøre en oppskrift for å etse mønstrede silisium laget gjennom device sjikt. Den nedgravde oksyd-laget virker som en etsesperre så utføre en etsing med 50% til 100% flere sykluser enn det som er forventet å være nødvendig for å sikre en fullstendig etch.
- Plasser skiven i et varmt bad fotoresist-løsning i 20 min for å fjerne fotoresisten. Overfør wafer til en rask-dump-rinser (QDR) å skylle wafer med DI vann. Etter fotoresist stripe, laste wafer i en SRD verktøy for å skylle og tørke wafer. Kontroller skiven under et mikroskop for å sikre cantilever mønsteret vises som forventet.
- Innskudd av en 1 mikrometer tykt lag av un-dopet silisium oksid på enheten lag av skiven ved hjelp av en PECVD verktøyet. Denne oksyd-laget virker som et beskyttende lag for de bommene under ytterligere behandlingstrinn.
- Plasser skiven på spin belegningsinnretning chuck med håndtaket sjikt vendt opp for å begynne behandling av baksiden av skiven. Sikre wafer er sentrert, fordeles 2 ml P20 primer på midten av skiven, og sentrifugering ved 3000 rpmi 60 sek ved en akselerasjon på 1000 rpm / sek.
- Mens skiven er fortsatt på spin belegningsinnretning chuck, dispensere 2 ml SPR220-4.5 fotoresist på midten av skiven, og sentrifugering ved 2000 rpm i 45 s ved en akselerasjon på 1000 rpm / sek for å oppnå et 6,5 pm tykt lag av fotoresist.
- Plasser skiven på en avstands varm plate for å utføre en myk stek ved 115 ° C i 2 min.
- Ved hjelp av en fotolitografi kontakt aligner stand foran / bak justering, justere baksiden vinduet masken til forsiden cantilever mønster og utføre en hard kontakt UV eksponering for å overføre mønsteret fra baksiden vinduet masken til fotoresist på håndtaket laget. Bruk en eksponeringstiden beregnes på grunnlag av eksponering energiverdi på 480 mJ / cm 2 for SPR220-4.5 fotoresist.
- Etter UV-eksponeringen, la skivene forblir i et mørkt område i 30 minutter før det neste prosesstrinn.
- Develop fotoresisten ved å dyppe den i skivenen 726 MIF fotoresist utvikler i 2 min mens forsiktig risting skiven frem og tilbake.
- Skyll wafer med de-ionisert (DI) vann og tørk den, helst ved hjelp av en spin skylling tørketrommel (SRD) verktøyet.
- Plasser wafere i en ovn ved 90 ° C i 12 timer.
- Etse silisium oksyd-lag på baksiden av skiven ved hjelp av en RIE system med fluorerte gasser og en oppskrift for etsing av oksydet. Den mønstrede oksyd på baksiden av skiven virker som en etsemaske for videre behandling. Inspisere skivene under et mikroskop for å sikre at det silisium-oksyd i den eksponerte vinduet er helt etset.
- Fjern fotoresist på kanten av skiven (opp til 5 mm fra kanten) ved hjelp av et rent rom dott dyppet i aceton.
- Load skiven i et verktøy med DRIE og kjøre en oppskrift for å etse det mønstrede håndtaket sjikt til en dybde på 500 mikrometer med den begravde oksidsjiktet fungerer som en etsesperre. Dele dette etch i flere omganger for å hindre overdreven oppvarming avskiven, noe som fører til inkonsistent etsing av silisium. Dette etch trinnet fjerner helt silisium under bom.
- Utfør en våtetsing skritt med 25% fortynnet HF etsemiddel, til å strippe den begravde oksidlaget under bommer og den beskyttende oksid lag på toppen av bom.
MERK: Dette trinnet frigjør den nederste overflaten av silisium bommer og åpner et vindu på undersiden for å tilveiebringe en tilgang til sonde cantilever med laseren også. - Skyll skiven ved hjelp av en serie med DI-vann bad og forsiktig tørr med nitrogen. Siden Bommene er kun støttet på sine baser, ikke bruk kraftige spray av DI vann eller inert gass direkte på bom.
- Spalter de enkelte brikker fra wafer langs spalter linjer produsert i løpet av håndtaket sjikt etsetrinn.
2. Cell Culture
- Forbered 13F Dekk ifølge tidligere publiserte metoder 17.
MERK: Hvis 13F buktrslips ikke er tilgjengelige, kan en hvilken som helst hydrofob overflate med en kontaktvinkel over 95 ° brukes. - Sterilisere cantilever chips og 13F Dekk i en 70% etanol løsning og la det lufttørke i en flyt hette.
- Plasser individuelle cantilever chips oppå 13F dekkglass inne i en standard 12 brønners plate.
- Smør bommene med biopolymer eller overflatemodifikasjon som er optimalisert for den celletype som brukes i henhold til standard cellekultur protokoller.
- Re-suspendere cellene i deres spesifikke vekstmedium til den ønskede konsentrasjon.
MERK: Denne protokollen vil resultere i et betydelig antall celler som faller gjennom cantilever vinduet og som ikke følger de ønsket cantilever overflaten. Celle preparater bør derfor gjøres 3-4x mer konsentrert enn for standard dekk forberedelser. For eksempel er såing av rotteskjelettmuskelsatellittceller utføres typisk ved hjelp av en seeding densitet på 500 til 700 celler / kvadrat mm 15,16, Og brukes med meie substrater på 2000 celler / kvadrat mm. Optimalisering eksperimenter skal utføres med nye celle kilder for å fastslå en passende seeding tetthet. - Pipetter 200 pl av cellesuspensjonen på cantilever chip overflaten, som sikrer at boblen mellom dekker cantilever vinduene helt og holdent. Hvis mediet transporterer gjennom vinduet og ikke danner en statisk boble på toppen av bommene erstatte 13F dekkglass og forsøk igjen plating.
- Overfør den plate som inneholder flisen til en inkubator og la cellene få feste seg i minst 1 time (fortrinnsvis 2-3 timer).
- Etter denne pletteringsperioden bruke steril pinsett til å overføre brikken til en ren godt, uten 13F dekkglass, og fyll kulturen med 1 ml vekstmedium.
- Returnere platen til inkubatoren.
- Vedlikeholde celler i henhold til deres standard protokoll for in vitro vedlikehold på dekkglass. For skjelettmuskelceller,en bryter mellom preparat for å indusere dannelsen myotube når cellene blir sammenflytende vil være nødvendig.
3. Oppsett av maskinvare og programvare for Cantilever Deflection Analyse
- Plasser en oppvarmet dyrkningsskål inn i fasen av en oppreist elektromikroskop.
- Tilsett 3 ml av foringsmedium cellene er nå opphengt i (+ 10 mM HEPES) til det oppvarmede mikroskop scenen.
- Monter rustfrie elektroder på innsiden av den oppvarmede dyrkningsskål på en avstand på 15 mm og koble dem til en pulsgenerator, som kan produsere feltstimulering pulser av varierende intensitet, frekvens og bølgeform, for å tillate systemet å produsere feltstimulering av cellene når det passer.
- Bolt et Helium-neon-laser, som er montert på XY translasjonelle trinn, til undersiden av mikroskopet bordet og justere den slik at laserstrålen rettes gjennom bunnen av den oppvarmede dyrkningsskål på 30 ° vinkel relative med planet av braket.
- Bolt et kvadrant-fotodetektormodulen, montert på XY translasjonelle trinn, til undersiden av objektbordet og justere posisjonen, slik at de reflekterte laserstråle lander i midten av de fire kvadranter. Figur 2 gir en oversikt over maskinvaren satt opp nødvendig for å gjennomføre den beskrevne protokoll.
- Skriv et program for å kontrollere de lineære aktuatorer som skanner over bom. Skriv programmet med henvisning til flytdiagrammet vist på fig 3.. Det grafiske grensesnittet er programmert for bruk med dette systemet er gitt i figur 4.
4. Opptak Cantilever Deflection data
- Slå på cantilever analyse maskinvare og tilhørende programvare.
- Sett oppvarmet scenen termistor inn i mediet og vente på det å lese 37 ° C.
- Sett cantilever chip inn i scenen med cantilevers orientert mot høyre side av scenen.
- Slå på mikroskopet lyskilde.
- Fokuser mikroskop for å bringe kantene av bommene til syne og bruke laser / foto-detektor kontroll programvare for å posisjonere laserstrålen på tuppen av cantilever 1. MERK: Forutsatt at de Bommene er orientert til høyre for scenen, cantilever 1 er den plassert i øvre venstre i matrisen og tall kjøre ned til 16 i nedre venstre. Cantilever 17 er øverst i høyre stilling og går til 32 i høyre (figur 5A).
- Trykk "play" på innspillingen programvare.
- Plasser foto-detektoren slik at signalet viser "0" i både x og y rammer ved å justere trinnmotorer som styrer den foto-detektoren.
- Sett cantilever en posisjon i laser / foto-detektor kontroll programvare (figur 4).
- Flytt laser til tuppen av cantilever 16, gjenta trinn 4.7., Og satt cantilevER 16 posisjon i laser / foto-detektor kontrollprogramvare.
- Flytt laser til tuppen av cantilever 32, gjenta trinn 4.7., Og satt cantilever 32 posisjon i laser / foto-detektor kontrollprogramvare.
- Beveg laseren til spissen av cantilever 17, gjenta trinn 4.7., Og sett cantilever 17 posisjon i laser / fotodetektor-kontrollprogramvare.
- Slå av mikroskop lyskilde og indirekte lys i laboratoriet.
- Trykk på "record" på innspillingen programvare.
- Sett pulsgenerator maskinvare til 40 msek, 5 V pulser med en frekvens på 1 Hz, og slå på maskinen.
MERK: Hvis du vil, ansette optimalisert stimuleringsregimer for spesifikke celle kilder på dette punktet, de angitte innstillingene er retningslinjer basert på innsamlede data fra humane og gnager cellekilder 12,13,15,16. - Ved hjelp av laser / foto-detektor software, sette maskinvaren til å skanne over 32 cantilever array, stopper i 5 sek på hver påe.
- Når skanningen av de 32 bommer er fullført, slår du av stimulator, deretter stoppe innspillingen programvare og få opp datafilen.
- Undersøke den innspilte spor fra hver cantilever etter bevis for kontraktile aktivitet. Noter hver cantilever med positiv respons. En sammentrekning er definert som en topp hvis nedbøyning er minst 0,1 V over grunnlinjen.
- Fjern eventuelle ikke-responsive bommene fra skanningen protokollen på laser / foto-detektor kontrollprogramvare.
- De aktive bommene kan deretter bli avsøkt på nytt uten stimulering for å få en avlesning av cellens spontane kontraktile aktivitet.
- Kjør skanninger med eller uten bredt felt elektrisk stimulering, etter tilsetning av en terapeutisk forbindelse til mediet for å observere dens effekt på den funksjonelle utgangs av de dyrkede celler.
- Utfør tretthets vurderinger ved elektrisk stimulering av cellene i lengre perioder, og skanne nivåer av kontr actility å måle hvor lang tid det tar for topp makt for å falle under en bestemt terskel.
- I forsøk hvor motoriske nevroner opprettholdes i ko-kultur med muskel, måle neuromuskulære dannelse gjennom behandling av motoneuron-myotube cantilever ko-kulturer med en neuronal stimulant (slik som glutamat) eller synaptisk inhibitor (for eksempel D-tubokurarin) og skanning for økninger og reduksjoner i spontan aktivitet henholdsvis 16.
- Utføre bestemte skanner som diktert av behovene til de planlagte eksperimenter.
5. Analyse av Cantilever Deflection data
- Bruk modifisert Stoney ligninger 15 (beskrevet nedenfor) for å konvertere rå cantilever nedbøyning data (i volt) i en avlesning av stress i cellelaget eller myotube (i Pascal), og en direkte måling av cellulær kontraktile kraft (i nano-Newton):
AD / 51866 / 51866eq1.jpg "/> Ligning 1
Formel 2 - Der δ = cantilever spissen nedbøyning og stress produsert av myotube, σ c = belastning produsert av myotube, antar en ensartet tykk film over hele bredden av braket, C detektoren = den systemspesifikke koeffisient relatert spenning til laser posisjonen på bildet -detektoren, θ = vinkelen av laseren og detektoren i forhold til planet av braket, E Si = elastisitetsmodulen av silisium, t Si = tykkelsen av det frittbærende, t f = myotube tykkelse, v = Si giften er forholdet silisium, L = cantilever lengde, P = banelengde på laser fra cantilever spissen til detektoren, og w
- Forutsatt at myotube er en uniform film, er den kraft i myotube lik kraften i filmen, noe som fører til ligning 3, ved å sette likhetstegn beregning av kraften fra stress og antatt celletverrsnittsareal som ble brukt for påføring av Stoneys ligning.
Ligning 3 - Etter funksjonell datainnsamling, fikse cantilever chips for immuncytokjemisk analyse eller utnytte celler for protein eller DNA-analyse ved hjelp av standard teknikker.
- Eventuelt tilbake cellene til inkubatoren i stedet for å forberede for molekylær analyse for å revurdere funksjonelle ytelse på et senere tidspunkt-punkt.
Formel 2 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket kultur av kontraktile celler på bommer er en relativt enkel fremgangsmåte, ved å benytte standard cellekulturteknikker (figur 5). Prosentandelen av utkraginger støtter oppdrags celler vil variere avhengig av celletype som blir undersøkt og bestemt kultur teknikk ansatt. Ved hjelp av primære embryonale celler avledet fra rotte baklemmene, ble kontraktile aktivitet detektert på 12% av utkraginger undersøkt (n = 4). Analyse av kontraktile funksjon ved hjelp av laser og fotodetektorsystemet som er beskrevet gir nøyaktige sanntidsdata som gjelder den funksjonelle modenhet av seeded celler. Bruk av standard elektro programvare kan deretter brukes til å analysere de rå data, tilrettelegging beregning av relevante funksjonelle egenskaper, slik som peak force, tiden til maksimal kraft og tid til halv avslapning, som illustrert i Figur 7. Følgende datainnsamling fra kulturer behandlede med terapeutiske forbindelser tillatersammenligning av funksjonelle egenskaper med og uten medikamentet tillegg, og dermed muliggjør vurdering av forbindelse aktivitet og påfølgende prediksjon av in vivo responser. Videre utvidet stimuleringsregimer gi midlene til å vurdere priser av tretthet i dyrkede celler, og dermed utvide nivået av fysiologiske data oppnåelig fra dette systemet (Figur 8).
Den frittbærende kultur kan bli modifisert til å omfatte motoriske nevroner i kultur-system med skjelettmuskel myotubes 16, slik som å tillate vurdering av neuromuskulær synapse dannelse in vitro (figur 9). I slike kulturer, er forekomst av spontane kontraktile aktivitet sammenlignet med rater sammentrekning i respons til behandling med et neuron-spesifikk stimulerende, slik som glutamat. Eventuelle observert glutamatinduserte økninger i sammentrekning priser foreslå aktivering av dyrkede nerveceller, som fører til acetylkolin utgivelsen og påfølgende myorøret aktivering. Behandling med synaptiske inhibitorer, slik som acetylkolin reseptorblokker D-tubokurarin, som fører til opphør av glutamat indusert aktivitet gir ytterligere bevis for tilstedeværelse av funksjonelle neuromuskulære synapser i disse kulturene 16.
Figur 1. Skjematisk detaljering cantilever fabrikasjon prosessflyt. Numrene i flytdiagrammet relateres til protokoll trinnene i metoder delen "Gren chip fabrikasjon." Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Hardwaredetaljer om laser / foto-detektor system brukes til å vurdere cellular sammentrekning på bom. (A) fotografi av den modifiserte elektro mikroskop benyttet for meie vurdering. Laseren (i) og foto-detektoren (ii) er montert under det stadium på XY translasjonelle stadier. Et gjennomsiktig dyrkningsskål er montert på trinn (iii), noe som tillater laser passasje til cantilever arrayet med undersiden av scenen. (B) Skjematisk "top-down" perspektiv av objektbord. XY translasjonelle stadier tillate bevegelse av laser-og fotodetektoren i både X-og Y-plan (røde piler), legge til rette for bevegelse av laser for å avlese hver utkraging i en matrise. Konsoll chips (iii) skal plasseres inn i scenen med bommene vendt mot høyre for scenen for at systemet skal fungere ordentlig. (C) Lukk opp bilde av laser (i) ogfoto-detektor (ii) som er montert under mikroskop scenen. Laseren er plassert i en 30 ° vinkel i forhold til planet av braket chip (θ.) (D) lukke seg fotografi av dyrkningsskål. Bred-feltet elektrisk stimulering påføres ved hjelp av et par av sølvelektroder plassert 15 mm fra hverandre (iv). Et varmeelement (v) som er festet til undersiden av skålen er brukt for å holde kulturen ved 37 ° C i løpet av analysen. Temperaturkontroll er dynamisk, og reguleres ved hjelp av en termistor plassert i medium (ikke vist). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Flytskjema av logikk underliggende programvare for å kontrollere. skanning av laser og fotodetektor To programvare loops kontroll bevegelse: en hoved sløyfe for brukerundersøkelser og en løkke som styrer skanning bevegelse. Oppsett utføres mens i hoved loop, etterfulgt av aktivering av andre sløyfen for middels til høy gjennomstrømming datainnsamling. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Grafisk brukergrensesnitt av programvaren som brukes til å styre laser og fotodetektor stillinger i løpet av cantilever vurdering. (A) for å kontrollere manuelt laser og fotodetektor stillinger i både X og Y-flyene. (B) Styrer for manuell innstilling av posisjonene til de fire hjørnebommene (1, 16, 17, og 32), og dermed lar programvaren tilekstrapolere posisjonene til de gjenværende bommene i tabellen. (C) Controls slik at brukerne kan velge hvilke bommer som skal inkluderes i hver skanning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Bilder av en spesialbygget cantilever-brikke for anvendelse i dette system, og representative bilder av cellene opprettholdt på lignende overflater. (A) Fotografi av en enkelt, tilpasset bygget cantilever chip. Hver brikke inneholder 32 bommene ordnet i to rader med 16. Cantilever 1 er plassert i nederst til venstre på bildet og cantilever 32 i øverst til høyre. Konsoll chips er 15 x 15 mm 2. (B) Fase kontrastrikt bilde av primær rotte skjelettmuskelceller dyrket på cantilevers. Hver konsoll er 750 um lange, 100 mikrometer brede, og 4 mikrometer tykt. (C) immuncytokjemisk flekk av en primær rotte myotube opprettholdes på en utkrager. Celler ble farget ved hjelp av et antistoff-probe for Myosin tung kjede. Legg merke til den lagdelte utseende av kultiverte fibre, noe som indikerer modning av den kontraktile maskineri. Konsoll kanter har blitt kunstig fremhevet i dette bildet for å gi en indikasjon på omfanget. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Skjematisk illustrerer begrepene i Stoney ligninger for utledning kraft produsert av myotubes på bom. Δ = cantilever tips nedbøyning og stress produsert av myotube, Cdetektor = den systemspesifikke koeffisient relatert spenning til laser posisjon på foto-detektoren, θ = vinkelen av laseren og detektoren i forhold til planet av braket, E Si = elastisitetsmodulen av silisium, t Si = tykkelsen cantilever, t f = myotube tykkelse, v Si = gift forhold mellom silisium, L = cantilever lengde, og P = veilengden av laser fra cantilever tips til detektoren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Representative rådata og analyse av kontraktile skjema med cantilever-systemet beskrevet. (A) Eksempel på en rå data spor fra den brede feltet elektrisk stimulering av primære rotte myotubes på bom. Top spor = laser avbøyning (i volt) på x-aksen, noe som indikerer lengde belastning på cantilever. Midtre spor = laser nedbøyning (i volt) i y-aksen, noe som indikerer torsjonsbelastninger over cantilever. Bunnekko = Indikasjon av den tidsmessige posisjonen til elektriske pulser som benyttes til å fremkalle myotube sammentrekning i dette systemet. (B) ved hjelp av standard elektrofysiologi programvare, er det mulig å måle toppkraft (PF), tid til maksimal kraft (TTP) og tiden til halvparten avslapping (1/2 RT) fra de innsamlede rådata. (C) Sortert sammentrekning data (n = 11) fra primær rotte skjelettmuskel myotubes. Anvendelsen av en modifisert Stoney likning tillater beregning av cantilever stress fra rådata målinger i Volt. Fra denne informasjonen, kan direkte beregning av kraften (i Newton) også genereres. Publiserte data gjengitt with tillatelse 13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Representative data som viser analyser av skjelettmuskeltretthet i cantilever kulturer. Rådata (i volt) ble konvertert til en måling av myotube kraft (i nano-Newton) og re-plottet. Data illustrerer omfanget av myotube sammentrekninger på bommene som svar på 1 Hz bredfelt elektriske pulser etter 0 min (svart spor) og 120 min (grå spor) av kontinuerlig stimulering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9. Representative spor fra analysen av en skjelettmuskulatur-motoneuron co-kultur opprettholdes på bommer demonstrere funksjonelle effekter av motoneuron stimulering med og uten tillegg av en nevromuskulær blokkering. Rådata (i volt) ble konvertert til en måling av myotube kraft (i nano-Newton) og re-plottet. (A) Måling av spontane sammentrekninger av de dyrkede myotubes uten neuronal stimulering. (B) Måling av myotube sammentrekning følge neuronal stimulering via tilsetning av 200 uM glutamat. (C) Måling av myotube sammentrekning følgende glutamat og 12,5 mikrometer D-tubocurarine behandling. Publiserte data gjengitt med tillatelse 16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Følgende tabeller viser spesifikke reagenser som brukes til å dyrke celler i valideringen eksperimenter er beskrevet, samt utstyr som er nødvendig for å utføre cantilever vurdering. Vær oppmerksom på at kultur reagenser som brukes er ikke nødvendig, og dette systemet skal være enkelt integreres med kulturen protokoller av noe lab opprettholde kontraktile celler in vitro. De oppførte reagenser er gitt bør etterforskere ønsker å gjenta de spesifikke eksperimentelle resultater er beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiske trinn i å analysere mikrobommene for tegn på celle sammentrekning er plassering av braket brikken i objektbordet, og den etterfølgende justering av laser-og fotodetektoren med spissen av hjørnet bommene i tabellen. Hvis dette ikke gjøres nøyaktig, da programvaren vil være i stand til å ekstrapolere posisjonene til de gjenværende bommene i matrisen, som potensielt kan føre til opphopning av falske negativer under datainnsamling. Operatører bør passe på å sikre at braket chip lå i flukt med bunnen av kulturen rett før kalibrering av laser stillinger. Dersom brikken sitter ved en vinkel i formen, vil den endre banen til laserstrålen avbøyet og forvirre datainnsamling.
En funksjonell air-tabellen må brukes for å kansellere ut bakgrunns vibrasjoner under datainnsamling. Den lille tykkelse (omtrent 4 mikrometer) av bommer brukt i denne studien provides høy følsomhet for kontraktile aktivitet, men har den bivirkning av økt følsomhet overfor vibrasjoner. Operatører bør passe på å flytte rundt på hardware så lite som mulig under datalagring, for å redusere bakgrunnsavlesninger. Til slutt, når du plasserer cantilever chip i den fasen, må du passe på at brikken ikke kommer i kontakt med de stimulerende sølv elektroder i kulturen godt. Anvendelse av bred-feltet stimulering med elektroden berøre brikken vil endre den nåværende banen og negativ innvirkning på systemets evne til å effektivt stimulere dyrkede celler.
For å få mer nøyaktige målinger av kraft produksjonen i skjelettmuskel myotubes, er det sterkt anbefalt å utføre farging av de dyrkede celler gang funksjonelle analysen er ferdig. De ligninger som er oppført krever innsats av en myotube største tverrsnittsareal (CSA) for å beregne styrken. Mens en antatt verdi kan brukes basert på pRevious data, måling av en myotube eksakte CSA hjelp konfokale bildeteknikker vil gi en mer nøyaktig vurdering av kraften som utøves av oppdragsgiver myotube. Knyttet rå sammentrekning data til de fysiske karakteristika for cellen i spørsmålet er verdifulle i normal resultater på flere bommer og mellom eksperimentelle betingelser 15, og derfor kritisk for å generere nøyaktige prediksjoner av hele vev respons på behandling eller sykdom. Stoney ligninger anta myotubes undersøkt dekker hele lengden av cantilever slik innsats bør gjøres for å bare inkludere data fra celler som oppfyller denne forutsetningen. Hvis dette ikke er mulig, kan finite element analyse brukes til å gi en nøyaktig måling av kraft fra mindre myotubes som tidligere 15 publisert. Denne analysemetoden er langt mer arbeidskrevende, og derfor dårlig egnet til høyere gjennomstrømning, men kan være nødvendig hvis optimalisertcellekulturer i samsvar med Stoney forutsetninger kan ikke innhentes.
Som allerede nevnt, kan kultur parametere overføres fra standard dekk forberedelser. Imidlertid er det anbefalt å vurdere å benytte serum-frie medier komposisjoner og ikke-biologiske substrater for bruk av dette systemet i narkotika screening programmer. På grunn av den udefinerte arten av dyr sera, kan effekten av nye terapeutika bli forvirret av inkludering av slike additiver i dyrkningsmediet. Serumfrie medier formuleringer er tilgjengelige for både gnager og menneske skjelettmuskelkulturer 18-21 og gir en mer kontrollert, veldefinert miljø for å utføre forbindelsen vurdering. På samme måte introduserer bruken av biologiske belegg (kollagen, laminin, etc.) på bommer variabiliteten til de cellepreparater som unngås ved anvendelse av ikke-biologiske substrater. Avsettingen av silan selvmontert monolag på kulturoverflater har blitt vist extensively å støtte tilslutning og utvikling av flere celletyper 16,18,20,22-31, og utgjør et middel for å generere fullt definerte flater i en pålitelig og repeterbar måte.
På grunn av omfanget av kontraktile celler i pattedyrsystemer, er anvendelse av denne modell for in vitro-analyser relativt bred. Selv optimalisert ved hjelp av skjelettmuskelceller, er systemet potensielt anvendbar for å glatte muskelceller og kardiomyocytter i tillegg, gir midler for å utføre rask vurdering av dose-reaksjoner til nye terapeutiske midler i disse celler i sanntid. Gjeldende cantilever chips består av en matrise av 32 bommene (figur 5a), men kan enkelt endres til å omfatte mange flere. Analyse av slike matriser gir et betydelig antall datapunkter fra en enkelt kultur, og derved i stor grad øke den statistiske strøm om eventuelle observerte forskjeller. Som vist i figur 8, celler dyrketi dette systemet gjennomgår tretthet med tiden, som reaksjon på kontinuerlig bredfeltstimulering, slik at evaluering av medikamenteffekter på de utholdenhet nivåer av celler in vitro. Tilsetning av innervating motoriske nevroner i denne kulturmodell tillater også vurdering av synapse formasjon gjennom måling av muskel sammentrekning som reaksjon på neuronal stimulerende midler (figur 9). Selv om målingen av utgangs funksjonelle parametre i et multiplex-analyse (figur 7) har åpenbare fordeler i forhold til standard biomolekylære vurdering av in vitro-kulturer, evnen til å vurdere neuromuskulær funksjon og utholdenhetskapasitet seeded celler i stor grad øker anvendeligheten av denne modell for medikamentscreening og sykdom modelleringsprogrammer. Den beskrevne teknikk har forskere på midler for å utføre hurtig, rimelig funksjonell vurdering av både friske og syke muskelceller in vitro. Allsidigheten av kulturen system, og high nivå av funksjonell detalj oppnåelig fra analyse av rådata, skal produsere mer nøyaktige spådommer om in vivo vev svar på nye patologiske og kjemiske utfordringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av National Institute of Health tilskuddsordninger tall R01NS050452 og R01EB009429. Fabrikasjon av braket chips ble utført eksternt av medarbeidere på nanofabrikasjon anlegget ligger ved Cornell University. Alt utstyr som brukes i cantilever fabrikasjon prosessen lå i dette anlegget. Spesiell takk til Mandy Esch og Jean-Matthieu Prot for deres hjelp med cantilever mikro-fabrikasjon. Video animasjon av cantilever funksjonalitet ble generert av Charles Hughes, Alex Zelenin og Eric Imperiale fra Syntetisk Reality Lab ved UCF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
- Bischoff, R. Enzymatic liberation of myogenic cells from adult rat muscle. Anat. Rec. 180, 645-661 (1974).
- Yasin, R., et al. A quantitative technique for growing human adult skeletal muscle in culture starting from mononucleated cells. J. Neurol. Sci. 32, 347-360 (1977).
- Dennis, R. G., Kosnik, P. E., 2nd, Excitability and isometric contractile properties of mammalian skeletal muscle constructs engineered in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 327-335 (2000).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Eng Part C Methods. 18, 349-357 (2012).
- Langelaan, M. L. P., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 5, 529-539 (2011).
- Stephenson, G. M., O'Callaghan, A., Stephenson, D. G. Single-fiber study of contractile and biochemical properties of skeletal muscles in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetes. 43, 622-628 (1994).
- Harber, M., Trappe, S. Single muscle fiber contractile properties of young competitive distance runners. Journal of applied physiology (Bethesda, Md: 1985). 105, 629-636 (2008).
- Hvid, L. G., et al. Four days of muscle disuse impairs single fiber contractile function in young and old healthy men. Experimental gerontology. 48, 154-161 (2013).
- Edman, K. A.
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Sung, J. H., et al. Microfabricated mammalian organ systems and their integration into models of whole animals and humans. Lab on a chip. 13, 1201-1212 (2013).
- Wilson, K., Molnar, P., Hickman, J. J. Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a chip. 7, 920-922 (2007).
- Wilson, K., Das, M., Wahl, K. J., Colton, R. J., Hickman, J. Measurement of contractile stress generated by cultured rat muscle on silicon cantilevers for toxin detection and muscle performance enhancement. PLoS ONE. 5, (2010).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C.
- Pirozzi, K. L., Long, C. J., McAleer, C. W., Smith, A. S., Hickman, J. J. Correlation of embryonic skeletal muscle myotube physical characteristics with contractile force generation on an atomic force microscope-based bio-microelectromechanical systems device. Applied physics letters. 103, 83108 (2013).
- Smith, A., Long, C., Pirozzi, K., Hickman, J. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. Technology. 1, 37-48 (2013).
- Stenger, D. A., et al. Coplanar molecular assemblies of amino- and perfluorinated alkylsilanes: characterization and geometric definition of mammalian cell adhesion and growth. Journal of the American Chemical Society. 114, 8435-8442 (1992).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. A defined long-term in vitro tissue engineered model of neuromuscular junctions. Biomaterials. 31, 4880-4888 (2010).
- Rumsey, J. W., Das, M., Bhalkikar, A., Stancescu, M., Hickman, J. J. Tissue engineering the mechanosensory circuit of the stretch reflex arc: Sensory neuron innervation of intrafusal muscle fibers. Biomaterials. 31, 8218-8227 (2010).
- Das, M., Rumsey, J. W., Bhargava, N., Stancescu, M., Hickman, J. J. Skeletal muscle tissue engineering: A maturation model promoting long-term survival of myotubes, structural development of the excitation-contraction coupling apparatus and neonatal myosin heavy chain expression. Biomaterials. 30, 5392-5402 (2009).
- Das, M., et al. Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 378-387 (2009).
- Stenger, D. A., Pike, C. J., Hickman, J. J., Cotman, C. W. Surface determinants of neuronal survival and growth on self-assembled monolayers in culture. Brain research. 630, 136-147 (1993).
- Hickman, J. J., et al. Rational pattern design for in vitro cellular networks using surface photochemistry. Journal of Vacuum Scienc., & Technology A: Vacuum, Surfaces, and Films. 12, 607-616 (1994).
- Das, M., Molnar, P., Devaraj, H., Poeta, M., Hickman, J. J. Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motor neurons in a defined system. Biotechnology progress. 19, 1756-1761 (2003).
- Rumsey, J. W., et al. Node of Ranvier formation on motor neurons in vitro. Biomaterials. 30, 3567-3572 (2009).
- Murugan, R., Molnar, P., Rao, K. P., Hickman, J. J. Biomaterial Surface patterning of self assembled monolayers for controlling neuronal cell behavior. International journal of biomedical engineering and technology. 2, 104-134 (2009).
- Guo, X., Johe, K., Molnar, P., Davis, H., Hickman, J. Characterization of a human fetal spinal cord stem cell line, NSI-566RSC, and its induction to functional motoneurons. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4, 181-193 (2010).
- Varghese, K., et al. A new target for amyloid beta toxicity validated by standard and high-throughput electrophysiology. PLoS ONE. 5, e8643 (2010).
- Natarajan, A., et al. Patterned cardiomyocytes on microelectrode arrays as a functional, high information content drug screening platform. Biomaterials. 32, 4267-4274 (2011).
- Davis, H., et al. Rat Cortical Oligodendrocyte-Embryonic Motoneuron Co-Culture: An Axon-Oligodendrocyte Interaction Model. Journal of biomaterials and tissue. 2, 206-214 (2012).
- Natarajan, A., DeMarse, T., Molnar, P., Hickman, J. Engineered In Vitro Feed-Forward Networks. J Biotechnol Biomater. 3, 2 (2013).
