Summary
このプロトコルは、 インビトロで筋細胞の収縮性を測定するための柔軟な培養表面としてマイクロスケールのシリコンカンチレバーの使用を記載している。細胞収縮を測定記録し、 インビトロで収縮機能を測定するための非侵襲的かつスケーラブルなシステムを提供し、力の読み取り値に変換することができるカンチレバー屈曲を引き起こす。
Abstract
インビトロアッセイにおける複数の予測と生物学的に関連の開発は、播種した細胞の機能評価を容易にする多目的な細胞培養系の進歩に基づく。そのため、マイクロカンチレバー技術は、曲げ収縮誘発性基板の評価を通じて、骨格筋、心筋、および平滑筋細胞などの細胞型の範囲の収縮機能を測定するためにどのプラットフォームを提供する。多重化されたカンチレバーアレイのアプリケーションは、薬物の有効性および毒性、疾患表現型および進行、ならびに神経筋および他の細胞 - 細胞相互作用を評価するためのハイスループットプロトコルに適度な開発する手段を提供する。この原稿は、この目的のために信頼性の高いカンチレバーアレイを製造するための詳細、およびこれらの表面上に成功裏に培養細胞に必要なメソッドを提供する。さらなる説明は、機能的肛門を実行するのに必要なステップに設けられている新規なレーザーおよび光検出器システムを使用してそのようなアレイ上で維持収縮性細胞型のysis。ハイライトの精度と、このシステム、ならびにこのような技術を適用することができる研究の広い範囲を使用して可能な収縮機能の分析の再現可能な性質を提供した代表的なデータ。このシステムの成功広く採用は、組織のパフォーマンス、疾患の発症および新規治療的処置に対する応答のより正確な予測をもたらす、インビトロで迅速、低コストで機能的研究を実行するための手段を研究者に提供することができる。
Protocol
1カンチレバーチップ製造
説明した製造工程を図示した細部は、 図1に示す。
- オーブンでシリコン·オン·インシュレータ（SOI）ウェーハを配置し、それらを脱水し、20分間125℃で焼く。
- プラズマを用いて脱水したSOIウェハのハンドル層上に酸化ケイ素の1.5μmの厚さの層を堆積させる化学気相成長法（PECVD）ツールを強化。
- デバイス層を上に向けてスピンコーターチャック上のウエハを配置します。 、ウエハがセンタリングされていることを確認し1000回転/秒の加速度で60秒間、3000rpmでウェハの中心、そしてスピンでP20プライマーの2ミリリットルを分注する。 P20プライマーは、デバイス層にフォトレジストの接着を促進する。
- ウェハをスピンコータチャック上にある間に、ウェーハの中心にS1818フォトレジストを2mlを分配、およびo 1,000回転/秒の加速度で60秒間3,000 rpmでスピンフォトレジストの厚さ1.5μmの層をbtain。
- ホットプレート上でウェーハを置き、1分間115℃でソフトベークを行う。
- デバイス層上のフォトレジストにカンチレバーマスクからパターンを転写するためにフォトリソグラフィーコンタクトマスクアライナを使用してハードコンタクトUV露光を行う。 125 MJ / S1818フォトレジスト用cm 2の露光エネルギー値に基づいて露光時間を算出する。
- 優しく前後にウェハを振りながら、1分間726 MIFフォトレジスト現像液にウェハを浸漬することにより、フォトレジストを開発する。
- 脱イオン（DI）水を用いてウェーハをリンスし、それを乾燥、好ましくは、スピンリンス乾燥（SRD）ツールを使用して。
- アセトンに浸した綿棒を使用して（端から5mmまで）ウェーハのエッジからフォトレジストを除去します。
- フォトレジスト側を上にして、ディープ反応性イオンエッチング（DRIE）ツールで、ウェーハをロードし、デビを通じてパターニングされたシリコン層をエッチングするレシピを実行CE層。エッチストップとしての埋め込み酸化物層の機能なので、完全なエッチングを確実にするために必要であると予想されるよりも50％〜100％以上のサイクルでエッチングを行う。
- フォトレジストを除去するために20分間のホットフォトレジスト浴溶液にウェハを配置します。 DI水でウェーハを洗浄するためにクイックダンプリンサ（QDR）にウエハを転送します。フォトレジスト剥離後、ウェーハを洗浄し、乾燥さSRDツールでウェーハをロードします。期待どおりカンチレバーパターンが表示されていることを確認するために、顕微鏡下でウェハを検査します。
- PECVDツールを使用して、ウエハのデバイス層の上に非ドープ酸化シリコンの厚さ1μmの層を堆積。さらなる処理ステップ中にカンチレバーの保護層としてこの酸化物層は機能する。
- ウェハの裏面の処理を開始するために上に向け、ハンドル層をスピンコータチャックにウェハを配置します。 、ウエハがセンタリングされていることを確認し、ウェハの中央にP20プライマーの2ミリリットルを分配し、3000 rpmでスピン1,000回転/秒の加速度で60秒間。
- ウェハはスピンコーターチャックに入れたまま、ウエハの中心にSPR220-4.5フォトレジストの2ミリリットルを分配し、1000回転/秒の加速度で45秒間、2000rpmでスピンの6.5ミクロンの厚さの層を得るためフォトレジスト。
- 2分間115℃でソフトベークを実行するために近接ホットプレート上にウエハを配置します。
- 前面/背面の位置合わせが可能なフォトリソグラフィコンタクトアライナーを使用して、前側カンチレバーパターンに裏面ウィンドウマスクを位置合わせし、ハンドル層上のフォトレジストに裏面ウィンドウマスクのパターンを転写するために、ハードコンタクトUV露光を行う。 SPR220-4.5フォトレジスト480 MJ / cm 2の露光エネルギー値に基づいて算出された露光時間を使用する。
- UV露光の後、ウェハは、次の処理ステップの前に30分間、暗い領域に残るう。
- ウエハを浸漬することによりフォトレジストを現像2分間726 MIFのフォトレジスト現像液を穏やかに前後にウェーハを振とうしながら。
- 脱イオン（DI）水を用いてウェーハをリンスし、それを乾燥、好ましくは、スピンリンス乾燥（SRD）ツールを使用して。
- 12時間90℃のオーブンでウェーハを配置します。
- フッ素化ガスによるRIEシステムおよび酸化物をエッチングするためのレシピを用いてウエハの裏面に酸化シリコン層をエッチングする。ウェハの裏面上のパターン化された酸化物は、さらなる処理のためのエッチングマスクとして機能する。露出したウィンドウ内の酸化シリコンが完全にエッチングされることを保証するために、顕微鏡下でウェハを検査します。
- アセトン中に浸し、クリーンルーム綿棒を使用して（端から5mmまで）ウェーハのエッジ上にフォトレジストを除去します。
- とDRIEツールでウエハをロードし、エッチストップとしての埋め込み酸化膜の機能化を500μmの深さにパターン化されたハンドル層をエッチングするためにレシピを実行します。の過熱を防止するために、複数の実行中に、このエッチを分割シリコンの一貫性のないエッチングを引き起こすウェーハ。このエッチング工程は、完全にカンチレバー下のシリコンを除去します。
- カンチレバー下記の埋め込み酸化物層とカンチレバーの上に保護酸化物層を除去するために、25％希釈HFエッチング液を用いたウェットエッチング工程を行う。
注：この手順は、シリコンカンチレバーの底面を解放し、また、レーザーでカンチレバーをプローブするためのアクセスを提供するために下にあるウィンドウが開きます。 - DI水浴場のシリーズと窒素で丁寧に乾燥を用いてウェハを洗浄します。カンチレバーは、その拠点でのみサポートされているので、直接カンチレバーにDI水または不活性ガスの強制スプレーを使用しないでください。
- ハンドル層エッチング工程中に生成劈開ラインに沿ってウェハから各チップを切断する。
2細胞培養
- 以前に公開されている方法17に従って13Fカバースリップを準備します。
注：もし13F入り江rslipsが利用できない、95°以上の接触角を有する任意の疎水性表面を使用することができる。 - カンチレバーチップ、70％エタノール溶液中の13Fカバースリップを滅菌し、フローフード中で空気乾燥させ。
- 標準12ウェルプレートの内側13Fカバースリップの上に個別のカンチレバーのチップを置きます。
- コート細胞型について最適化されたバイオポリマーまたは表面修飾を有するカンチレバーは、標準的な細胞培養プロトコルに従って使用されている。
- 所望の濃度へのそれらの特異的な増殖培地中で細胞を再懸濁する。
注：このプロトコルは、カンチレバー窓から落下し、所望のカンチレバー表面に付着していない細胞のかなりの数になります。細胞調製は、したがって、標準的なカバースリップの準備のためよりも濃縮3~4なされるべきである。例えば、ラット骨格筋衛星細胞の播種は、典型的には500〜セル/平方ミリメートル15,16の播種密度を使用して行われる、および/平方mm 2000個の細胞でカンチレバー基板で使用されます。最適化実験は、適切な播種密度を確認するために、新しい細胞源を用いて実施されるべきである。 - 媒体の気泡が完全にカンチレバー窓を覆う確保カンチレバーチップ表面上に細胞懸濁液200μlをピペット。媒体が窓から発散し、カンチレバーの上に静的な泡を形成しない場合は13Fのカバーガラスを交換し、メッキを再試行してください。
- インキュベーターにチップを含むプレートを移し、細胞が少なくとも1時間（好ましくは2〜3時間）のために接着させる。
- このメッキ期間の後、増殖培地1mlの文化を13Fカバースリップすることなく、きれいなだけでなく、チップを転送し、トップアップするために滅菌ピンセットを使用しています。
- インキュベーターにプレートを返します。
- カバーガラス上のインビトロ維持のための彼らの標準的なプロトコルに従って細胞を維持する。骨格筋細胞のために、細胞がコンフルエントになったら、筋管形成を誘導する培地組成のスイッチが必要になります。
カンチレバーのたわみ解析のためのハードウェアおよびソフトウェアのセットアップ3。
- 直立電気生理学顕微鏡のステージに加熱された培養皿を置きます。
- 加熱された顕微鏡ステージに細胞が現在（+ 10mMのHEPES）中に懸濁さ給餌培地3mlを加える。
- 15mmの離間距離で加熱された培養皿の内側のステンレス鋼電極をマウントし、パルス発生器に接続し、変化する強度、周波数、及び波形の電界刺激パルスを生成することができる、システムは電場刺激を生成できるようにする細胞の適切なとき。
- ボルトヘリウムネオンレーザーは、顕微鏡台の下面に、XY並進ステージ上に取り付けられ、レーザビームは30°の角度で加熱した培養皿の底を通って導かれるように調整relativカンチレバーの面に電子。
- ボルト象限光検出器モジュール、顕微鏡ステージの下側に、XY並進ステージ上に取り付けられ、4象限の中央になるように反射されたレーザ光 の土地の位置を調整してください。 図2は、設定されたハードウェアの概要を説明します記載されたプロトコルを実装するために必要な。
- カンチレバーを横切って走査するリニアアクチュエータを制御するためのソフトウェアプログラムを記述します。 図3に設けフローチャートを参照して、ソフトウェアプログラムを書くこのシステムで使用するためにプログラムされたグラフィカルインターフェイスは、 図4に設けられている。
4。録音カンチレバーたわみデータ
- カンチレバー分析ハードウェアと関連ソフトウェアをオンにします。
- 媒体への加熱されたステージのサーミスタを挿入し、それが37℃を読むことを待つ。
- cantileveと段階にカンチレバーチップを挿入ステージの右手側に向けrsは。
- 顕微鏡の光源をオンにしてください。
- 視野にカンチレバーのエッジをもたらし、カンチレバー1 NOTEの先端にレーザビームを位置決めするレーザー/光検出器制御ソフトウェアを使用するために顕微鏡の焦点を合わせる：カンチレバーがステージの右に向いていると仮定すると、カンチレバー1配列の左上に配置された1つであり、数字は左下に16にダウンを実行。カンチレバー17は、右上の位置にあり、右下の（ 図5A）で32に実行されます。
- を押して、録音ソフトウェア上で「再生」。
- 位置の光検出器信号は光検出器を制御するステッピングモータを調整することにより、xとyの両方のフレームに「0」を読み出すようになっている。
- レーザー/光検出器制御ソフトウェアで設定カンチレバー1の位置（ 図4）。
- ステップ4.7を繰り返して、カンチレバー16の先端にレーザーを移動させ、cantilevを設定えー、レーザー/光検出器制御ソフトウェアの16ポジション。
- カンチレバー32は、手順4.7の先端にレーザーを移動させ、レーザー/光検出器制御ソフトウェアのカンチレバー32の位置を設定します。
- カンチレバー17は、手順4.7の先端にレーザーを移動させ、レーザー/光検出器制御ソフトウェアのカンチレバー17の位置を設定します。
- 顕微鏡光源と実験室でのオーバーヘッドライトをオフにします。
- 録音ソフトウェアを押して「記録」。
- 1Hzの周波数で40ミリ秒、5 Vのパルスに対するパルス発生器のハードウェアを設定し、マシンの電源を入れます。
注：必要に応じて、この時点では、特定の細胞ソースの最適化された刺激プロトコルを採用して、述べ設定は、ヒトとげっ歯類の細胞源12,13,15,16を使用して収集されたデータに基づくガイドラインである。 - レーザー/光検出器制御ソフトウェアを使用して、32カンチレバーアレイを横切って走査するためのハードウェアを設定し、それぞれの上に5秒間停止メール。
- 32カンチレバーのスキャンが完了すると、次に録音ソフトを停止し、データファイルを起動し、刺激装置をオフにしてください。
- 収縮活動の証拠について、それぞれのカンチレバーから記録されたトレースを調べます。陽性反応をそれぞれのカンチレバーをメモしておきます。偏向は、ベースラインよりも少なくとも0.1 Vである場合に収縮がピークと定義される。
- レーザー/光検出器制御ソフトウェア上のスキャンプロトコルから任意の非応答性のカンチレバーを取り外します。
- アクティブカンチレバーは、細胞の自発収縮活動の測定値を得るために刺激することなく、再スキャンすることができる。
- 培養された細胞の機能的出力への影響を観察するために、媒体への治療用化合物を添加した後、電気刺激または幅広い分野ずにスキャンを実行します。
- 電気的に延長された期間とCONTRのスキャンレベルのために細胞を刺激することにより、疲労評価を実施 actilityは、それが特定のしきい値以下に低下するピーク力のためにかかる時間を測定した。
- 運動ニューロンは筋肉との共培養で維持されている実験では、またはシナプス阻害剤（ 例えば 、D-ツボクラリン）と走査（グルタミン酸など）、神経刺激薬と運動ニューロン、筋管カンチレバー共培養の処理により、神経筋接合部の形成を測定自発的活動の増加と減少はそれぞれ16。
- 計画された実験の必要性によって指示されるように、特定のスキャンを実行します。
カンチレバーたわみデータの解析5。
- 使用して、ストーニーの方程式は15細胞層または筋管（パスカル）、および（ナノニュートン）は、細胞の収縮力を直接測定における応力の読み出しに（ボルト）で生カンチレバー偏向データを変換する（詳細は下記）更新日：
広告/ 51866 / 51866eq1.jpg "/>式（1）
式2 - ここで、δ=筋管によって生成カンチレバー先端のたわみや応力、筋管によって生成σC =ストレス、写真上のレーザー位置に電圧を関連するカンチレバー、C型検出器 =システム固有の係数の均一な厚膜と仮定すると全幅-detector、θ=カンチレバーの面に対するレーザおよび検出器の角度、E Siはシリコンの弾性率=、tのSiはSiの毒=ポアソン比V、T fは筋の厚さ 、カンチレバーの厚さ=シリコンカンチレバー先端から検出器へのレーザのL =片持ち梁の長さ、P =経路長、およびw
- ストレスとストーニーのの適用のために使用されたと仮定し、セルの断面積からの力の計算を等しくすることで、筋管が均一な膜である、筋管の力が式3につながる、フィルムの力に等しいと仮定すると方程式。
式3 - 機能的なデータ収集に続いて、免疫細胞化学分析のためにカンチレバーチップを修正するか、標準的な技術を使用してタンパク質またはDNA分析のために細胞を利用する。
- 必要に応じて、代わりに、後の時点で機能的性能を再評価するために、分子解析のための準備のインキュベーターにセルを返します。
式2 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
カンチレバー上の収縮性細胞の成功した文化は、標準的な細胞培養技術（ 図5）を利用して、比較的簡単な手順です。収縮する細胞を支持するカンチレバーの割合は、細胞型を調べ、特定の培養技術が採用さに依存して変化する。ラット後肢由来の初代胚細胞を使用して、収縮活動を調べカンチレバーの12％で検出された（n = 4）であった。記載レーザーと光検出器システムを使用して収縮機能の分析は、播種された細胞の機能的成熟に関連する正確なリアルタイムデータを提供する。 図7に示すように、標準的な電気生理学的なソフトウェアの使用は、その後、そのようなピーク力、力のピークまでの時間、および半弛緩までの時間などの関連する機能的特性の計算を容易にする、生データを分析するために使用することができる。処理した培養物からのその後のデータ収集治療用化合物とを可能にしと、薬剤を添加しない機能特性の比較をすることにより、化合物の活性及びin vivoでの応答のその後の予測の評価を可能にする。また、拡張された刺激プロトコルは、このように、このシステム（ 図8）から得られる生理学的データのレベルを広げ、培養細胞中の疲労の速度を評価する手段を提供する。
カンチレバー培養物は、 インビトロで神経筋シナプス形成（ 図9）の評価を可能にするように、このような培養では、自発収縮活動の速度は速度と比較され、骨格筋筋管16と培養系における運動ニューロンを含むように修飾することができるグルタミン酸などの神経特異的刺激薬による治療に応答した収縮。収縮率のいずれも観察されたグルタミン酸誘発性増加は、アセチルコリン放出およびその後のミオにつながる、培養神経細胞の活性化を示唆しているチューブの活性化。グルタミン酸誘発される活性の停止につながるようなアセチルコリン受容体遮断薬、D-ツボクラリンのようなシナプス阻害剤、を用いた治療は、これらの培養物16における機能の神経筋シナプスの存在についてのさらなる証拠を提供する。
図1の回路図の詳細をカンチレバーの製造プロセスフローフロー図に記載されている数字は、タイトルのメソッドセクションのプロトコルステップに相関"カンチレバーチップ製造。」 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ハードウェアカンチレバー上の細胞の収縮を評価するために使用されるレーザ/光検出器システムの詳細。カンチレバー評価のために使用される改変された電気生理学顕微鏡の（A）写真。レーザー（i）および光検出器（ 二 ） は、XY並進ステージ上のステージの下に取り付けられている。透明な培養皿は、ステージの下側を通ってカンチレバーアレイにレーザ通過を可能にする段階（iii）の上に取り付けられている。顕微鏡ステージの（B）図「トップダウン」の観点。 XY並進ステージは、アレイの各カンチレバーを調べるために、レーザの移動を容易に、XおよびY平面（赤矢印）の両方でレーザーおよび光検出器の移動を可能にする。カンチレバーチップ（ⅲ）正しく動作するシステムのために、ステージの右を向いたカンチレバーと、ステージに配置する必要があります。（C）レーザー（i）の写真をクローズアップし、光検出器（ii）は、顕微鏡のステージの下に取り付けられている。レーザは、カンチレバーチップ（θ）の平面に対して30°の角度で配置されている。（D）培養皿の写真をクローズアップ。広い視野電気刺激は、銀電極対の手段（iv）は離れて15ミリメートルを位置決めすることによって適用される。加熱素子（v）の皿の下側に取り付けられ、分析中に、37℃で培養を維持するために使用される。温度制御は、ダイナミック、および媒体（図示せず）に配置されたサーミスタによって調整される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
コントロールへのソフトウェアの基礎となるロジックの図3のフロー· チャートユーザ入力および走査運動を制御ループの主ループ：レーザーと光検出器の走査2つのソフトウェアは、制御動作をループする。メインループで、高スループットのデータ収集への中長期のための第二のループの活性化が続く中にセットアップが実行される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
カンチレバー評価中にレーザーと光検出器の位置を制御するために使用されるソフトウェアの図4のグラフィカルユーザインタフェース。手動でX及びY平面の両方でレーザーおよび光検出器の位置を制御するための（A）ボタン（B）を制御し、手動で4コーナカンチレバー（1、16、17、および32）の位置を設定することにより、ソフトウェアを許可するアレイ内の残りのカンチレバーの位置を推定する。（C）ユーザーは、各スキャンに含める片持ちかを選択できるように制御します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
このシステムで使用するためのカスタム構築されたカンチレバーチップ5のイメージ図、及び同様の表面上に維持された細胞の代表的な画像。 （A）単独の、特注のカンチレバーチップの写真。各チップは、右上にある画像とカンチレバー32の左下に配置されている16のカンチレバー1の2列に配置された32のカンチレバーが含まれています。カンチレバーチップは、15×15 mm 2である。カンチレバー上に成長させた初代ラット骨格筋細胞の（B）位相コントラスト画像秒。各カンチレバーは、100μm、幅4μmの厚さ750ミクロンの長さである。カンチレバー上に維持初代ラット筋管（C）の免疫細胞化学ステイン。細胞は、ミオシン重鎖に対する抗体プローブを用いて染色した。収縮機構の成熟を示す、培養された繊維の横紋外観に注意してください。カンチレバーエッジは人為的にスケールの指標を提供するために、この画像で強調表示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
カンチレバー上の筋管による力を導出するためのストーニーの方程式で使用される用語を説明するための図6の回路図。筋管、Cによって生成さδ=カンチレバー先端のたわみや応力検出器 、レーザー、光検出器上の位置、θ=カンチレバーの平面にレーザーおよび検出器の角度に電圧を関連=システム固有の係数、E Siはシリコンの弾性率=、tのSiはの厚さ=カンチレバー、T F =筋管の厚さは、シリコン中のSi =毒の比率は、L =カンチレバーの長さ、およびカンチレバー先端から検出器へのレーザーのP =経路長対 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7の代表的な生データと記載カンチレバーシステムを使用して収縮フォームの分析。 （A）はカンチレバー上の初代ラット筋管の幅広い分野電気刺激からの生データ·トレースの例。カンチレバーに負担縦示すx軸のトップトレース（ボルト単位）=レーザー偏向。カンチレバー全体のねじれ歪みを示す中東トレース= y軸における（ボルト）で、レーザー偏向。このシステムにおける筋管の収縮を誘発するために使用される電気パルスの時間的位置の下のトレース=表示（B）標準的な電気生理学ソフトウェアを使用して、ピーク力（PF）を測定することが可能であり、半分に力（TTP）および時間をピークまでの時間初代ラット骨格筋筋管から収集された生データから緩和（1/2 RT）。（C）丁合い収縮データ（N = 11）。修正されたストーニーの式を適用するとボルトでの生データ値からカンチレバー応力の計算を可能にする。このデータから、（ニュートン）の力の直接計算をも生成することができる。ワット復刻出版データi番目の許可13。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図カンチレバー培養において骨格筋疲労の分析を実証する8。代表的なデータ 。 （単位：ボルト）生データ（ナノニュートンで）筋管力の測定に変換して再プロットした。データは連続的刺激の0分（黒のトレース）および120分（灰色のトレース）の後に1 Hzの幅広い分野の電気パルスに応答してカンチレバーに筋収縮の大きさを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図9代表とし、神経筋遮断薬を添加せずに運動ニューロン刺激の機能的効果を実証し、骨格筋運動ニューロンの共培養カンチレバー上に維持の分析からトレースします。生データを（ボルトで）筋管の測定に変換されたの（ナノニュートン）の力と、神経刺激なしで培養筋管による自発収縮の再プロットした。（A）測定。200μMのグルタミン酸を添加することにより、神経刺激後の筋管収縮の（B）の測定。（C）測定グルタミン酸および12.5μMのD-ツボクラリン処理後の筋収縮。許可を得て転載16公開されたデータは、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
以下の表は、記載され検証実験中の培養細胞に使用される特定の試薬だけでなく、カンチレバーの評価を実行するために必要な機器をリストアップ。使用した培養試薬は必要ではなく、このシステムは簡単にin vitroでの収縮細胞を維持するいずれかのラボの培養プロトコルに統合されるべきであることに注意してください。提供されて記載されている試薬は、研究者は説明した特定の実験結果を繰り返したいはずです。
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Discussion
細胞収縮の証拠マイクロカンチレバーを分析する重要なステップは、顕微鏡ステージ内のカンチレバーチップの配置、配列内のコーナーカンチレバーの先端がレーザーと光検出器のその後のアラインメントである。これが正確に行われない場合、ソフトウェアは、潜在的にデータ収集中に偽陰性の蓄積につながる、アレイ内の残りのカンチレバーの位置を推定することができません。オペレータは、カンチレバーチップは、レーザー位置を校正する前に、培養皿の底と面一に嘘をついていることを確認するために注意する必要があります。チップは皿に角度で座っている場合には、偏向されたレーザビームの経路を変更し、データ収集を混乱させるであろう。
機能的な空気の表は、データ収集の間、バックグラウンドの振動を相殺するために使用されなければならない。本研究で用いたカンチレバーの厚さが薄い（約4ミクロン）広報収縮活動に対して高い感度をovidesが、振動に対する感度の増加の副作用を有する。オペレータは、バックグラウンドの測定値を減らすために、データの記録中はできるだけハードウェアを中心に移動するように注意する必要があります。段階でのカンチレバーチップを配置するとき最後に、チップはよく、培養中の刺激銀電極と接触しないように注意してください。電極チップに触れることで広い視野刺激の適用は、電流経路を変更し、負に効果的に培養細胞を刺激するためのシステムの能力に影響を与える。
骨格筋筋管における力出力のより正確な測定値を得るためには、高度に一度機能分析が完了した培養細胞の免疫染色を行うことが推奨される。リストされた方程式は、力を計算するために、筋管の断面積（CSA）の入力を必要とする。仮定値は、pに基づいて使用することができるがreviousデータは、共焦点イメージング技術を用いて、筋管の正確なCSAの測定は、収縮筋によって加えられる力のより正確な推定を提供する。当該セルの物理的特性に生の収縮データを関連付けることは、複数のカンチレバー間で正規化結果の貴重な実験条件15の間、及び薬物治療や疾患への全組織応答の正確な予測を生成するためのきわめて重要である。ストーニーの方程式を検討筋管は非常に労力のみを参照すべきであるカンチレバーの長さ全体に及ぶと仮定し、この仮定に準拠した細胞から得られたデータを含む。これが不可能な場合、有限要素解析は、以前に公開された15のように小さな筋管からの力の正確な測定を提供するために使用することができる。この分析方法は、はるかに労働集約的、したがって、より高いスループットのアプリケーションには不向きですが、最適化された場合に必要になることがありストーニーの仮定に準拠した細胞培養物を得ることができない。
既に述べたように、培養パラメーターは、標準カバースリップ調製物から転送することができる。しかし、薬物スクリーニング用途での本システムの使用のための無血清培地組成物および非生物学的基質を利用することを検討することをお勧めします。により動物血清の未定義の性質のために、新規治療薬の効果は、培養培地中のこのような添加剤を含めることによって混乱することができる。無血清培地処方は、齧歯類とヒト骨格筋培養18-21および化合物の評価を行うため、より制御され、明確に定義された環境を提供するの両方で利用できます。同様に、カンチレバー上に生物学的コーティング（コラーゲン、ラミニンなど）の使用は、非生物学的基質を適用することによって回避される細胞調製物に変動性を導入する。培養表面上にシラン自己組織化単分子層の堆積は、exが示されているtensively複数の細胞型16,18,20,22-31の付着や開発をサポートし、信頼性と再現性の方法で完全に定義された表面を生成するための手段を表します。
により哺乳動物系に存在する収縮性細胞の範囲に、in vitroアッセイのために、このモデルの適用は比較的広い。骨格筋細胞を用いて最適化が、システムは、リアルタイムでこれらの細胞における新規な治療薬への線量応答の迅速な評価を実行するための手段を提供すること、ならびに筋細胞および心筋細胞を滑らかにするために潜在的に適用可能である。現在のカンチレバーチップ32のカンチレバー（ 図5A）のアレイから成るが、簡単に、より多くを含むように変更することができる。このようなアレイの分析は大幅任意の観察された差異の統計的検出力を増加させる、単一の培養物からのデータ点の実質的な数を生成する。細胞を培養し、 図8に証明されるようにこの系においてインビトロで細胞の耐久性レベルに対する薬物効果の評価を可能にする、連続的な広い視野刺激に応答して、経時的に疲労を受ける。この培養モデルへの神経支配する運動ニューロンの添加はまた、筋肉の測定を介してシナプス形成の評価を可能にするニューロンの興奮剤に応答した収縮（ 図9）。多重化アッセイにおけるベースライン機能パラメータ（ 図7）の測定は、 インビトロ培養の標準的な生体分子の評価を介して明らかな利点を有しているが、神経筋機能および播種した細胞の持久力を評価する能力が大幅に薬物スクリーニングのためのこのモデルの適用性を増加させるおよび疾患モデリングアプリケーション。記載された技術は、研究者に、in vitroで 、健康で病気の筋肉細胞の両方の迅速、低コストで機能的な評価を実施するための手段を提供しています。培養システムの汎用性、およびh生データの分析から得られる機能的なディテールのIGHレベルは、小説病理学的および化学的な課題へのin vivoでの組織反応のより正確な予測を生成する必要があります。
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Acknowledgments
この研究は健康の認可番号R01NS050452とR01EB009429総合研究所によって資金を供給された。カンチレバーチップの製造は、コーネル大学にあるナノ加工施設での共同研究者により外部で行われた。カンチレバーの製造工程で使用されるすべての機器はこの施設に位置していた。カンチレバー微細化と彼らの支援のためのマンディエッシュとジャン=マチューProtのに感謝します。カンチレバーの機能のビデオのアニメーションは、UCFでの合成リアリティ·ラボからチャールズ·ヒューズ、アレックスZeleninとエリック·インペリアーによって生成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary rat muscle growth medium | |||
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 (50x) | Life Technologies | 17504044 | 1x |
| Glutamax (100x) | Life Technologies | 35050061 | 1x |
| G5 supplement | Life Technologies | 17503-012 | 1x |
| Glial-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRG400B | 20 ng/ml |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRB600B | 20 ng/ml |
| Ciliary Neurotrophic Factor | Cell sciences | CRC400A | 40 ng/ml |
| Neurotrophin-3 | Cell sciences | CRN500B | 20 ng/ml |
| Neurotrophin-4 | Cell sciences | CRN501B | 20 ng/ml |
| Acidic Fibroblast Growth Factor | Life Technologies | 13241-013 | 25 ng/ml |
| Cardiotrophin-1 | Cell sciences | CRC700B | 20 ng/ml |
| Heparin Sulphate | Sigma | D9809 | 100 ng/ml |
| Leukemia Inhibitory Factor | Sigma | L5158 | 20 ng/ml |
| Vitronectin | Sigma | V0132 | 100 ng/ml |
| Primary rat muscle differentiation medium | |||
| NB Activ 4 | Brain Bits LLC | NB4-500 | |
| Equipment | |||
| Class 2 red diode laser | Newport | ||
| Photo-detector | Noah Industries | ||
| Model 2100 Pulse stimulator | A-M systems | ||
| Multiclamp 700B Digitizer | Axon Instruments | ||
| Patch clamp microscope and stage | Olympus | ||
| Delta T4 culture dish controller | Bioptechs | ||
| Axoscope software | Molecular Devices | ||
| LabVIEW software | National Instruments | ||
| 37 oC, 5% CO2 incubator | NAPCO | ||
| Class 2 microbiological flow hood | Labconco | ||
| Pipettes and tips | Eppendorf |
References
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